检索结果-南通市图书馆

稳定表达犬瘟热病毒受体SLAM的bhk-21细胞系的建立

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

稳定表达犬瘟热病毒受体SLAM的BHK-21细胞系的建立

作者：朱颖东北农业大学

学位级别：硕士

犬瘟热（Canine distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）引起的一种食肉目动物的急性、高度接触性传染病，临床表现为双相热、结膜炎、急性鼻卡他、严重的胃肠炎和神经症状等，呈世界性分布。近年来，珍稀动物... 详细信息

犬瘟热（Canine distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）引起的一种食肉目动物的急性、高度接触性传染病，临床表现为双相热、结膜炎、急性鼻卡他、严重的胃肠炎和神经症状等，呈世界性分布。近年来，珍稀动物如大熊猫、伊比利亚猞猁和免疫犬发生CD的报道，证实和提示了CDV感染宿主范围在不断扩大和抗原性可能发生变异，这一现象引起了众多学者对CDV的未知感染宿主和生物学特性研究的关注。病毒分离和鉴定是当前流行CDV毒株生物学特性研究的基础，但CDV在Vero、MDCK等常用的细胞系上或不易适应，或不产生典型细胞病变（CPE），或传代几次后病毒丢失，分离率较低，影响和限制了对犬瘟热病毒野毒株的分离、生物学特性和致病机制的研究。因此，建立易于CDV培养增殖的细胞系，对开展CDV的深入研究和疫苗毒生产都具有重要的应用价值。信号淋巴细胞激活分子（Signalling Lymphocyte Activation Molecule, SLAM,也称为CD150）是CDV感染宿主的主要受体，本研究旨在建立以bhk-21细胞为亲本细胞，能稳定表达犬SLAM的细胞系，用于CDV分离和体外研究。研究克隆了不含信号肽的编码犬SLAM的基因片段，将其定向插入真核表达载体pDisplay，得到重组表达载体pDisplay/SLAM。将pDisplay/SLAM用脂质体法转染到bhk-21细胞，通过G418压力筛选并结合有限稀释法、细胞免疫荧光和RT-PCR筛选出稳定表达SLAM的阳性细胞，命名为bhk-21/SLAM。应用RT-PCR方法对bhk-21/SLAM细胞的第5、10、15和20代细胞mRNA检测结果显示，SLAM的编码基因在bhk-21/SLAM细胞中稳定转录;细胞免疫荧光检测结果显示第20代bhk-21/SLAM细胞中有SLAM蛋白稳定表达;Western Blot也证明了SLAM蛋白在bhk-21/SLAM细胞中获得了表达。bhk-21/SLAM和bhk-21细胞的形态无明显差异，但单位面积总细胞数比后者多。病毒培养增殖实验结果显示，CDV Snyder Hill参考株在bhk-21细胞上未出现细胞病变，而感染bhk-21/SLAM细胞后12h后即可出现细胞病变;CDV Snyder Hill参考株在bhk-21/SLAM细胞上培养（24h）后的TCID50为10-3.9/0.1ml;bhk-21/SLAM细胞上清中的CDV Snyder Hill株病毒核酸含量于24h达到最高值（107.9拷贝/μl），较相同时间bhk-21细胞上清中的核酸含量显著提高。病料分离株CDV-Z7可在bhk-21/SLAM细胞上产生典型CPE，而在bhk-21细胞上无CPE。本研究建立了稳定表达犬SLAM的细胞系bhk-21/SLAM，与bhk-21细胞相比较，受试病毒在该细胞上的增殖滴度更高，产生的CPE更明显。该细胞系有望为CDV的分离、生物学特性研究和疫苗毒生产发挥积极的作用。

关键词：犬瘟热病毒受体信号淋巴细胞激活因子 bhk-21细胞系 bhk-21/SLAM细胞系

逆转录病毒载体介导的稳定表达口蹄疫病毒3D基因的bhk21细胞系的建立

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

微生物学报 2008年第8期48卷 1115-1120页

作者：毕研丽沈小燕丛国正刘湘涛常惠芸才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

【目的】研究口蹄疫病毒RNA聚合酶在bhk-21细胞中的稳定表达状况,为研究RNA聚合酶生物学活性及其基因工程疫苗研制提供科学依据。【方法】从重组质粒pMD18-T-3D扩增口蹄疫病毒3D基因,通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pBPSTR1... 详细信息

【目的】研究口蹄疫病毒RNA聚合酶在bhk-21细胞中的稳定表达状况,为研究RNA聚合酶生物学活性及其基因工程疫苗研制提供科学依据。【方法】从重组质粒pMD18-T-3D扩增口蹄疫病毒3D基因,通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pBPSTR1-3D。用pBPSTR1-3D和pVSV-G双质粒瞬时转染GP2-293包装细胞,收获重组逆转录病毒,然后感染bhk-21细胞,嘌呤霉素持续筛选12d后获得阳性克隆,并用有限稀释法挑选单个阳性细胞克隆。【结果】应用PCR、RT-PCR技术可从体外反复传代的阳性细胞中扩增到3D基因,证实目的外源基因能转录并被稳定整合进宿主细胞基因组中。经SDS-PAGE、Westernblot、间接免疫荧光检测到在不同代次的阳性细胞中有目的蛋白表达。【结论】本试验利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术,将外源基因插入到靶细胞的基因组中,构建了稳定表达口蹄疫病毒RNA聚合酶的包装细胞系,为研究3D基因表达及其蛋白定位提供了方便,也为下一步研究RNA聚合酶生物学功能和疫苗研制提供了科学依据。

关键词：口蹄疫病毒 3D基因逆转录病毒载体pBPSTR1 bhk-21细胞系

稳定表达犬瘟热病毒细胞受体SLAM的bhk-21/SLAM细胞系的建立

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国预防兽医学报 2014年第6期36卷 440-443页

作者：朱颖刘文鑫赵姝静李丹丹冯瑜菲关玮琨何丽丽江馗语师东方东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 沈阳市动物疫病防控中心辽宁沈阳110161

为建立稳定表达犬瘟热病毒(CDV)受体,即信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的bhk-21细胞系,本研究将重组表达质粒pDisplay-SLAM转染于bhk-21细胞,通过G418压力筛选并结合有限稀释法、免疫荧光、RT-PCR和western blot筛选出稳定表达SLAM的阳性细... 详细信息

为建立稳定表达犬瘟热病毒(CDV)受体,即信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的bhk-21细胞系,本研究将重组表达质粒pDisplay-SLAM转染于bhk-21细胞,通过G418压力筛选并结合有限稀释法、免疫荧光、RT-PCR和western blot筛选出稳定表达SLAM的阳性细胞(bhk-21/SLAM)。病毒感染试验结果显示,CDV在bhk-21细胞中无细胞病变(CPE)产生,而感染bhk-21/SLAM细胞12 h后即可出现CPE;bhk-21/SLAM细胞培养物上清液中的CDV核酸含量于24 h达到最高值(107.9拷贝/μL),明显高于对照组bhk-21细胞培养物上清液中的核酸含量(106.28拷贝/μL)。研究结果表明,与bhk-21细胞相比较,CDV在bhk-21/SLAM细胞中的病毒核酸含量更高,并能够产生明显的CPE。该细胞系的建立在CDV的分离、生物学特性研究和疫苗毒生产等方面具有良好应用前景。

关键词：犬瘟热病毒信号淋巴细胞激活因子 bhk-21细胞系 bhk-21 SLAM细胞系

过表达TPL2蛋白bhk21细胞系的建立及其初步应用

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国兽医科学 2019年第12期49卷 1527-1534页

作者：郝军红闫鸣昊张大俊张学刚申超超徐国伟李国丽张克山郑海学刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室

利用慢病毒表达系统将TPL2(COT和MAP3K8)质粒稳定整合在乳仓鼠肾细胞(baby Hamster Syrian kidney)bhk21细胞基因组染色体上,建立稳定表达TPL2的bhk21/TPL2细胞系。构建TPL2质粒,通过基因合成将TPL2基因和慢病毒载体Lv-PCDH连接,得到重... 详细信息

利用慢病毒表达系统将TPL2(COT和MAP3K8)质粒稳定整合在乳仓鼠肾细胞(baby Hamster Syrian kidney)bhk21细胞基因组染色体上,建立稳定表达TPL2的bhk21/TPL2细胞系。构建TPL2质粒,通过基因合成将TPL2基因和慢病毒载体Lv-PCDH连接,得到重组慢病毒载体Lv-TPL2。通过嘌呤霉素筛选得到的阳性细胞株bhk21/TPL2即为稳定表达TPL2蛋白的bhk21细胞株。运用间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、实时荧光定量PCR和普通PCR等技术分别验证TPL2基因组整合、转录、反应活性以及FMDV、SVV在bhk21/TPL2细胞株上的增殖效果。结果,TPL2基因被稳定整合在bhk21细胞基因组染色体上,建立的细胞系连续传代不丢失。接种病毒后致细胞病变严重,相对于正常的bhk21/PCDH细胞,整合有TPL2的bhk21细胞对FMDV、SVV的易感性显著增强。上述结果为FMDV疫苗的研制和生产提供了更佳的功能细胞系。

关键词： TPL2基因 bhk-21细胞系口蹄疫病毒 SVV病毒慢病毒表达系统

稳定表达Cas9蛋白的bhk-21单克隆细胞系的建立与鉴定

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国兽医杂志 2022年第9期58卷 12-17页

作者：葛丽娟权冉陈俊贞袁圆圆付强李泽宇史慧君新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

为建立基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究采用慢病毒转导构建稳定表达Cas9蛋白的bhk-21-Cas9单克隆细胞系。将pMD2.G、pSPAX2和lentiCas9-Blast共转染HEK-293T细胞包装慢病毒,感染bhk-21细胞后经Blasticidin S进行阳性筛选... 详细信息

为建立基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究采用慢病毒转导构建稳定表达Cas9蛋白的bhk-21-Cas9单克隆细胞系。将pMD2.G、pSPAX2和lentiCas9-Blast共转染HEK-293T细胞包装慢病毒,感染bhk-21细胞后经Blasticidin S进行阳性筛选,筛选5代后通过有限稀释法培养Cas9单克隆细胞,利用Western blot检测Cas9蛋白的表达。为获得Cas9活性强的bhk-21-Cas9单克隆细胞系,根据紧密连接蛋白(OCLN)基因序列,设计针对OCLN基因的sgRNAs,构建lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组质粒,测序鉴定后将lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组载体转染bhk-21-Cas9单克隆细胞系。使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,经过Western blot检测OCLN蛋白的表达。Western blot检测Cas9蛋白结果显示,共获得了17株bhk-21-Cas9单克隆细胞系;测序结果显示,lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA载体构建成功,通过Western blot鉴定,有2株Cas9编辑效果好、具有高敲除效率的bhk-21单克隆细胞系。结果表明,本研究构建了稳定表达Cas9蛋白的bhk-21-Cas9单克隆细胞系,可以用于CRISPR/Cas9敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选影响病毒感染和复制的功能基因提供了科学依据。

关键词： Cas9蛋白 bhk-21细胞系慢病毒紧密连接蛋白

Viperin抑制鸭坦布苏病毒在bhk-21细胞中出芽及稳定表达Viperin细胞系的建立

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

Viperin抑制鸭坦布苏病毒在BHK-21细胞中出芽及稳定表达Viperin细...

作者：顾香雪安徽农业大学

学位级别：硕士

Viperin是一种干扰素诱导蛋白因子,具有抗病毒作用。鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）属于黄病毒科黄病毒属,主要引起蛋鸭产蛋量下降和雏鸭死亡。为揭示Viperin蛋白抗DTMUV的作用机制,本研究通过表达鸭源Viperin蛋白,构建稳定... 详细信息

Viperin是一种干扰素诱导蛋白因子,具有抗病毒作用。鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）属于黄病毒科黄病毒属,主要引起蛋鸭产蛋量下降和雏鸭死亡。为揭示Viperin蛋白抗DTMUV的作用机制,本研究通过表达鸭源Viperin蛋白,构建稳定表达Viperin基因的细胞系,在细胞水平探究了Viperin对DTMUV复制增殖及出芽的作用。一、Viperin蛋白的原核表达及多克隆抗体制备论文首先基于Gen Bank中不同动物源Viperin基因,用软件MEGA6.05建立系统发育树。然后将鸭Viperin基因克隆到p GEX-6P-1载体,原核表达Viperin融合蛋白。将纯化的Viperin融合蛋白免疫家兔,制备抗鸭Viperin多克隆抗体,ELISA法检测其效价为1:8000。二、Viperin蛋白对鸭坦布苏病毒在bhk-21细胞出芽的抑制作用首先,构建重组真核表达质粒p EGFP-N1-Viperin,转染bhk-21细胞,Viperin蛋白可在bhk-21细胞中瞬时表达。然后,将p EGFP-N1-Viperin和p EGFP-N1分别转染bhk-21细胞,再用DTMUV感染细胞,培养36 h后,用RT-q PCR检测细胞沉淀和上清中病毒拷贝数。其次,bhk-21细胞过表达Viperin蛋白后感染DTMUV,培养36 h,收集细胞样品。用EGFP单克隆抗体捕获该样品中与Viperin蛋白结合的物质进行质谱分析。结果显示,其中有2种与DTMUV复制有关的蛋白DDX3X、DDX5,4种与囊泡类蛋白相关的蛋白VAMP-3、囊泡转运蛋白SEC22、囊泡转运蛋白GOT1B、VAPA。鸭坦布苏病毒在bhk-21细胞中出芽受到抑制。三、稳定表达Viperin基因的bhk-21细胞系的构建首先,构建重组真核表达载体p LOV-e GFP-Viperin,再与p SPAX2、p MD2.G共转染293T细胞制备慢病毒样颗粒,将含慢病毒样颗粒的293T细胞培养上清感染bhk-21细胞,通过嘌呤霉素加压筛选,稳定传代20代后进行核酸水平、蛋白水平的鉴定。PCR检测到Viperin蛋白的c DNA、DNA;荧光显微镜下有绿色荧光,Western blot检测到Viperin蛋白的表达,表明成功构建稳定表达Viperin基因的bhk-21细胞系。综上,本研究制备了Viperin蛋白及其多克隆抗体,构建了稳定表达Viperin基因的bhk-21细胞系,且证明Viperin蛋白能抑制DTMUV的出芽,为进一步探究Viperin蛋白抗DTMUV出芽机制提供了方向。

关键词： Viperin蛋白鸭坦布苏病毒抑制病毒出芽 bhk-21细胞系

猪乙脑病毒分离株***-1和***-3在bhk-21细胞上的传代培养及E基因序列稳定性分析

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

华北农学报 2013年第6期28卷 71-76页

作者：胡博滕蔓禹乐乐罗俊迟佳琪宿靖伟柴书军张改平吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130000 河南省农业科学院河南省动物免疫学重点实验室农业部动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

为研究猪乙脑病毒(JEV)分离株遗传基因的稳定性,将JEV分离株***-1和***-3在bhk-21细胞上进行连续传代培养,并对其E基因的遗传稳定性进行了研究。结果表明,经连续传代60次后病毒E基因趋于稳定,***-1毒株E蛋白氨基酸位点E21(A→V)、E200(T... 详细信息

为研究猪乙脑病毒(JEV)分离株遗传基因的稳定性,将JEV分离株***-1和***-3在bhk-21细胞上进行连续传代培养,并对其E基因的遗传稳定性进行了研究。结果表明,经连续传代60次后病毒E基因趋于稳定,***-1毒株E蛋白氨基酸位点E21(A→V)、E200(T→A)、E244(G→E)、E279(M→K)和E426(G→D),以及***-3毒株的E244(G→E)、E255(F→L)、E285(M→L)、E368(L→S)和E497(N→S)传代后发生稳定点突变。与JEV毒力相关的部分位点如E107、E138、E176、E177和E315遗传稳定性较高,经连续传代后均未发生突变,与疫苗株SA14-14-2相应位点完全一致。但是,另外一些位点的遗传稳定性较差,如***-3的E279(M→K→M)出现反复突变。这些突变是否与JEV的宿主细胞适应性及毒力变化相关有待进一步研究。

关键词：乙脑病毒 BSF.ZZ-1 BSF.ZZ-3 bhk-21细胞系传代培养 E基因序列分析

bhk-21细胞库的建立及其生物学特性鉴定

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

山西农业科学 2013年第8期41卷 808-812页

作者：付智财王家敏令世鑫沈武玲平玲魏园园马桂兰暴艳敏徐水林马忠仁乔自林新疆天康畜牧生物技术股份有限公司新疆乌鲁木齐830011 西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心甘肃兰州730030 兰州民海生物工程有限公司甘肃兰州730020

从美国典型培养物保藏中心(ATCC)和中国兽医药品监察所(中监所)引进2株bhk-21细胞系,传代扩增培养后液氮冻存,建立相应的细胞库;复苏细胞后对活力、形态、生长曲线、微生物污染、染色体核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性进行研究。结果... 详细信息

从美国典型培养物保藏中心(ATCC)和中国兽医药品监察所(中监所)引进2株bhk-21细胞系,传代扩增培养后液氮冻存,建立相应的细胞库;复苏细胞后对活力、形态、生长曲线、微生物污染、染色体核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性进行研究。结果显示,2个来源的bhk-21细胞系均呈成纤维型,生长状态良好;生长曲线呈S型;细菌、真菌、支原体及外源病毒检查均为阴性;染色体为21对,二倍体均占主体;外源质粒在该2株细胞系中能进行复制和表达。这可为开展bhk-21细胞系及口蹄疫疫苗的研究与开发提供基础理论依据和细胞资源。

关键词： bhk-21细胞系细胞库生物学特性