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α-2,6唾液酸转移酶在bhk细胞中的表达

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中国生物制品学杂志 2009年第1期22卷 22-24页

作者：侯小强高玉伟孙培录夏咸柱杨松涛吉林大学畜牧兽医学院长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所长春130062

目的在bhk细胞中表达α-2,6唾液酸转移酶(ST6Gal1),为其相关研究奠定基础。方法提取人肝癌HepG2细胞总RNA,经RT-PCR扩增α-2,6唾液酸转移酶的cDNA,克隆入载体pMD18-T中,测序后将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒... 详细信息

目的在bhk细胞中表达α-2,6唾液酸转移酶(ST6Gal1),为其相关研究奠定基础。方法提取人肝癌HepG2细胞总RNA,经RT-PCR扩增α-2,6唾液酸转移酶的cDNA,克隆入载体pMD18-T中,测序后将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-ST6Gal1,并转染bhk细胞,免疫荧光法检测α-2,6唾液酸转移酶的表达。结果克隆的α-2,6唾液酸转移酶基因与GenBank中报道的已知序列完全一致,重组真核表达质粒转染的bhk细胞表面SAα2,6Gal含量增加。结论α-2,6唾液酸转移酶在bhk细胞中获得了有效表达,为流感病毒受体的研究提供了技术支持。

关键词： α-2,6唾液酸转移酶 bhk细胞克隆表达

表达vWF蛋白的重组bhk细胞的无血清培养

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华东理工大学学报（自然科学版） 2004年第3期30卷 254-257页

作者：易小萍孙祥明张元兴华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

采用HADAMARD统计设计方法建立了适于重组bhk细胞培养和vWF蛋白表达的无血清培养基SFMA。用SFMA进行重组bhk细胞的批培养,细胞生长明显优于有血清培养(DMEM+FBS(φFBS=0.05))和无血清培养基SFM- 的培养,最大细胞密度可分别提高16.7%和40... 详细信息

采用HADAMARD统计设计方法建立了适于重组bhk细胞培养和vWF蛋白表达的无血清培养基SFMA。用SFMA进行重组bhk细胞的批培养,细胞生长明显优于有血清培养(DMEM+FBS(φFBS=0.05))和无血清培养基SFM- 的培养,最大细胞密度可分别提高16.7%和40%。同时,在培养的96h,蛋白的表达水平比有血清培养提高了18.7%,SFMA维持培养48h的vWF蛋白的表达水平比SFM- 提高了50%。

关键词： bhk细胞 rec-vWF 无血清培养基细胞培养

凝血因子Ⅶ基因表达载体的构建及其在bhk细胞中的表达

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中国生物工程杂志 2005年第1期25卷 44-47页

作者：吕茂民王娜王栋于群章金刚军事医学科学院野战输血研究所北京100850

凝血因子Ⅶ是凝血块形成的起始关键分子之一,它对外源性凝血途径的启动具有重要的作用。为表达具有促凝活性的重组人凝血因子Ⅶ,通过PCR的方法从质粒pUC-FⅦ中扩增人凝血因子ⅦcDNA,并将其定向克隆入真核表达载体pIRESneo中,构建重组表... 详细信息

凝血因子Ⅶ是凝血块形成的起始关键分子之一,它对外源性凝血途径的启动具有重要的作用。为表达具有促凝活性的重组人凝血因子Ⅶ,通过PCR的方法从质粒pUC-FⅦ中扩增人凝血因子ⅦcDNA,并将其定向克隆入真核表达载体pIRESneo中,构建重组表达载体pIRES-FⅦ,测序正确后用脂质体介导的方法转染bhk-21细胞,经G418加压筛选、细胞有限稀释等方法获得克隆细胞株,收集无皿清培养上清,进行SDS-PAGE、Western blot和活性鉴定。结果成功构建了重组表达载体pIRES-FⅦ,实现了其在bhk-21细胞中的表达,且表达产物具有促凝活性。重组人凝血因子Ⅶ在哺乳动物细胞中的成功表达,为整体止血剂的研究奠定了基础。

关键词：重组人凝血因子Ⅶ 表达载体 bhk细胞基因表达止血剂

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蚓激酶的克隆及其对bhk细胞的作用

中国生物化学与分子生物学报 2002年第6期18卷 776-779页

作者：孙兆军梁国栋陈飞付士红沈悦柴玉波李晓宇徐义辉侯云德中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100052

Lumbrukinase gene from earthworm ( *** ) was obtained by RT\|PCR. The product, PI 239 , was sequenced and analyzed by biology programs and database. The gene including signal peptide coding sequence was cloned into an eukaryotic vector and the clones were obtained by transferring into bhk cells. The gene was fused with EGFP gene at C\|terminal to be detected conveniently by its fluorescence. The lumbrukinase gene PI 239 has 852 nucleotides that code for 239 amino acid residues as mature peptide chain. The N terminal of PI 239 shares certain homology with those known lumbrukinase. The enzyme contains relative more acidic amino acid residues, and has homology to serine protease. It belongs to the acidic protein, serine protease. Conformation prediction indicates that its secondary structure mainly consists of β sheet. It has two super secondary structure motifs with the active sites Asp188 and Ser189 in between. The DNA and mRNA of the whole gene could be detected in bhk clones, but no recombinant protein detected. Under cofocal microscope, the cells transferred with fused gene showed fluorescence indicating that the fused protein was expressed. In addition, the cells containing the fused gene died soon while most of the control cells were still alive. It seemed that the protein could be expressed in bhk cells as a cytotoxin, though at a low level.

关键词：蚓激酶克隆 bhk细胞作用

双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素基因真核表达质粒的构建及其在bhk细胞中的表达

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中国老年学杂志 2010年第3期30卷 374-376页

作者：白靓金宁一成岩石毅王芳鲁会军南文龙关铭吉林大学药学院吉林长春130021 军事医学科学院11所全军基因工程重点实验室

目的构建双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素真核表达载体,并在幼仓鼠(bhk)细胞中进行表达。方法通过PCR方法分别改造流感病毒H5亚型血凝素(HA)和H7亚型HA基因片段,在融合片段间引入具有柔性功能的(G4S)3linker和具有自裂解功能的口蹄疫蛋白2A... 详细信息

目的构建双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素真核表达载体,并在幼仓鼠(bhk)细胞中进行表达。方法通过PCR方法分别改造流感病毒H5亚型血凝素(HA)和H7亚型HA基因片段,在融合片段间引入具有柔性功能的(G4S)3linker和具有自裂解功能的口蹄疫蛋白2A linker。将融合后的基因片段H5HA-H7HA克隆至真核表达载体pVAX1。选用bhk真核表达细胞系,用脂质体转染法将纯化后的表达质粒在细胞进行表达,转染后48h,用间接免疫荧光法(IFA)检测目的基因的表达情况。结果表达双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素基因的重组真核表达质粒pVAX1-H5HA-H7HA经酶切和测序证明构建正确。转染重组质粒的bhk细胞可检测到目的蛋白的表达。结论成功构建了真核表达质粒pVAX1-H5HA-H7HA,并在bhk真核细胞中正确表达,为H5、H7双亚型核酸疫苗的研究奠定了基础。

关键词：流感病毒血凝素真核表达 bhk细胞

牛坏死杆菌43kDa外膜蛋白真核质粒在bhk细胞中的瞬时表达

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中国生物制品学杂志 2020年第2期33卷 149-151,156页

作者：张思瑶王志慧贺显晶蒋剑成汪锋锋王丽娜肖佳薇郭东华黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

目的构建含有牛坏死杆菌43 kDa外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因的真核表达重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP,并检测其在bhk细胞中的瞬时表达。方法将43 kDa OMP核苷酸全基因序列与pCAGGS-HA载体连接,构建重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP... 详细信息

目的构建含有牛坏死杆菌43 kDa外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因的真核表达重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP,并检测其在bhk细胞中的瞬时表达。方法将43 kDa OMP核苷酸全基因序列与pCAGGS-HA载体连接,构建重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP,转化至大肠埃希菌,将鉴定正确的阳性菌转染bhk细胞,采用间接免疫荧光和Western blot法检测重组蛋白的表达。结果经双酶切及PCR鉴定,重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP构建正确;转染pCAGGS-43 kDa OMP的bhk细胞镜下观察可见绿色荧光,Western blot检测可见相对分子质量为43 000的目的蛋白。结论成功构建了pCAGGS-43 kDa OMP真核表达质粒,可在bhk细胞中瞬时表达,为进一步研究牛坏死杆菌感染机制奠定了基础。

关键词：牛坏死杆菌外膜蛋白 bhk细胞瞬时表达

稳定表达人TMPRSS2基因bhk细胞系的建立及其对新城疫弱毒增殖效率评价

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中国兽医科学 2021年第5期51卷 594-600页

作者：刘伟李梦娇郭佩东孙英杰仇旭升谭磊宋翠萍廖瑛孟春春丁铲福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福建福州350002 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为提高细胞培养系统中新城疫病毒的增殖效率,通过构建TMPRSS2过表达的bhk细胞系,探索其对新城疫弱毒增殖的影响。本研究将TMPRSS2基因克隆于噬菌体载体pHAGE中,构建重组质粒pHAGE-TMPRSS2。将重组质粒pHAGE-TMPRSS2以及辅助包装质粒psP... 详细信息

为提高细胞培养系统中新城疫病毒的增殖效率,通过构建TMPRSS2过表达的bhk细胞系,探索其对新城疫弱毒增殖的影响。本研究将TMPRSS2基因克隆于噬菌体载体pHAGE中,构建重组质粒pHAGE-TMPRSS2。将重组质粒pHAGE-TMPRSS2以及辅助包装质粒psPAX2和pMD2G共转染至293T细胞并收集上清。将包装好的慢病毒感染bhk细胞,通过Blasticidin加入筛选和有限稀释法将单克隆细胞扩大培养。经RT-PCR和Western-blot鉴定,结果表明,TMPRSS2在bhk细胞中获得了稳定的高表达。接种新城疫弱毒后通过TCID50测定显示,TMPRSS2过表达bhk细胞系能支持较高水平的病毒增殖。

关键词： TMPRSS2 慢病毒包装 bhk细胞新城疫弱毒

新城疫病毒TS09耐热株在bhk细胞上的传代培养

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湖北农业科学 2012年第23期51卷 5424-5427,5435页

作者：温国元商雨郭静杨峻王红琳罗青平张蓉蓉邵华斌湖北省农业科学院畜牧兽医研究所武汉430064 华中农业大学动物医学院武汉430070

以新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)TS09耐热株为研究对象,研究了该毒株在幼仓鼠肾传代细胞(bhk细胞)上的培养适应性。通过培养条件的优化、连续传代培养和极限稀释法纯化,获得了一株新的、纯化的、适应bhk细胞的NDV耐热株,命名... 详细信息

以新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)TS09耐热株为研究对象,研究了该毒株在幼仓鼠肾传代细胞(bhk细胞)上的培养适应性。通过培养条件的优化、连续传代培养和极限稀释法纯化,获得了一株新的、纯化的、适应bhk细胞的NDV耐热株,命名为TS09-C株。TS09-C株的生物学特性测定结果表明,TS09-C株在bhk细胞中的增殖滴度为107.9TCID50/mL,平均鸡胚致死时间(MDT)大于120 h,脑内致病指数(ICPI)为0。与亲本株TS09株相比,TS09-C株的基因序列发生了较为明显的改变,但TS09-C株与亲本株仍保持着较近的遗传进化关系。

关键词：新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV) 耐热 bhk细胞传代

重组减毒沙门菌ΔcrpSL1344(pET28-tPA)在bhk细胞中的表达及活性检测

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黑龙江畜牧兽医 2012年第9期 17-20,167页

作者：杨宁宁李银聚程相朝张春杰吴庭才河南科技大学动物科技学院河南洛阳471003

为了探讨原核表达质粒中的真核基因在减毒沙门菌中表达的多肽是否能在真核细胞中加工修饰成具有生物活性的蛋白,试验根据人t-PA的编码序列设计1对引物,扩增t-PA目的基因片段,构建pET28-tPA原核表达质粒,将表达质粒电转化导入减毒鼠伤寒... 详细信息

为了探讨原核表达质粒中的真核基因在减毒沙门菌中表达的多肽是否能在真核细胞中加工修饰成具有生物活性的蛋白,试验根据人t-PA的编码序列设计1对引物,扩增t-PA目的基因片段,构建pET28-tPA原核表达质粒,将表达质粒电转化导入减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpSL1344中并转染bhk细胞,应用SDS-PAGE技术检测t-PA表达情况,ELISA法检测其表达水平,琼脂糖平板溶圈法检测纤溶活性。结果表明:重组菌ΔcrpSL1344(pET28-tPA)在bhk细胞中有66.0 ku的蛋白表达,转染96 h的表达量为108μg/L,细胞裂解液和转染表达质粒的细胞培养上清液均有促纤溶活性。说明携带t-PA原核表达质粒的减毒沙门菌具有较强的促纤溶活性。

关键词：减毒鼠伤寒沙门菌表达质粒组织型纤溶酶原激活剂(t—PA) bhk细胞活性检测