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The bcl-2 inhibitor APG-2575 resets tumor-associated macrophages toward the M1 phenotype,promoting a favorable response to anti-PD-1 therapy via NLRP3 activation

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Cellular & Molecular Immunology 2024年第1期21卷 60-79页

作者： Fan Luo Han Li Wenjuan Ma Jiaxin Cao Qun Chen Feiteng Lu Miaozhen Qiu Penghui Zhou Zengfei Xia Kangmei Zeng Jianhua Zhan Ting Zhou Qiuyun Luo Wentao Pan Lin Zhang Chaozhuo Lin Yan Huang Li Zhang Dajun Yang Hongyun Zhao State Key Laboratory of Oncology in South China Guangdong Key Laboratory of Nasopharyngeal Carcinoma Diagnosis and TherapyGuangdong Provincial Clinical Research Center for CancerSun Yat-sen University Cancer CenterGuangzhouChina Ascentage Pharma(Suzhou)Co Ltd 218 Xinghu StreetSuzhouJiangsu ProvinceChina

The main challenges in the use of immune checkpoint inhibitors(ICIs)are ascribed to the immunosuppressive tumor microenvironment and the lack of sufficient infiltration of activated CD8+T *** the tumor microenvironment(TME)from“cold”to“hot”and thus more likely to potentiate the effects of ICIs is a promising strategy for cancer *** found that the selective bcl-2 inhibitor APG-2575 can enhance the antitumor efficacy of anti-PD-1 therapy in syngeneic and humanized CD34+mouse *** single-cell RNA sequencing,we found that APG-2575 polarized M2-like immunosuppressive macrophages toward the M1-like immunostimulatory phenotype with increased CCL5 and CXCL10 secretion,restoring T-cell function and promoting a favorable immunotherapy ***,we demonstrated that APG-2575 directly binds to NF-κB p65 to activate NLRP3 signaling,thereby mediating macrophage repolarization and the activation of proinflammatory caspases and subsequently increasing CCL5 and CXCL10 chemokine *** a result,APG-2575-induced macrophage repolarization could remodel the tumor immune microenvironment,thus improving tumor immunosuppression and further enhancing antitumor T-cell *** immunohistochemistry confirmed that patients with better immunotherapeutic efficacy had higher CD86,p-NF-κB p65 and NLRP3 levels,accompanied by lower CD206 expression on ***,these data provide evidence that further study on APG-2575 in combination with immunotherapy for tumor treatment is required.

关键词： bcl-2 APG-2575 ICIs Macrophages NLRP3

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Polysaccharide of Alocasia cucullata Exerts Antitumor Effect by Regulating bcl-2, Caspase-3 and ERK1/2 Expressions during Long-Time Administration

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Chinese Journal of Integrative Medicine 2024年第1期30卷 52-61页

作者： ZHOU Qi-chun XIAO Shi-lin LIN Ru-kun LI Chan CHEN Zhi-jie CHEN Yi-fei LUO Chao-hua MO Zhi-xian LIN Ying-bo School of Traditional Chinese Medicine Southern Medical UniversityGuangzhou(510515)China Clinical and Basic Research Team of TCM Prevention and Treatment of Non-Small Cell Lung Cancer the Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese MedicineGuangzhou(510120)China Department of Chinese Medicine Zhujiang Hospital Affiliated to Southern Medical UniversityGuangzhou(510282)China Department of Pharmacy Jiangmen Central HospitalJiangmen(529000)China

Objective: To study the in vitro and in vivo antitumor effects of the polysaccharide of Alocasia cucullata(PAC) and the underlying mechanism. Methods: B16F10 and 4T1 cells were cultured with PAC of 40 μg/m L, and PAC was withdrawn after 40 days of administration. The cell viability was detected by cell counting kit-8. The expression of bcl-2 and Caspase-3 proteins were detected by Western blot and the expressions of ERK1/2 mRNA were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR). A mouse melanoma model was established to study the effect of PAC during long-time administration. Mice were divided into 3 treatment groups: control group treated with normal saline, positive control group(LNT group) treated with lentinan at 100 mg/(kg·d), and PAC group treated with PAC at 120 mg/(kg·d). The pathological changes of tumor tissues were observed by hematoxylin-eosin staining. The cell apoptosis of tumor tissues was detected by TUNEL staining. bcl-2 and Caspase-3 protein expressions were detected by immunohistochemistry, and the expressions of ERK1/2, JNK1 and p38 mRNA were detected by qRT-PCR. Results: In vitro, no strong inhibitory effects of PAC were found in various tumor cells after 48 or 72 h of administration. Interestingly however, after 40 days of cultivation under PAC, an inhibitory effect on B16F10 cells was found. Correspondingly, the long-time administration of PAC led to downregulation of bcl-2 protein(P <0.05), up-regulation of Caspase-3 protein(P<0.05) and ERK1 mRNA(P<0.05) in B16F10 cells. The above results were verified by in vivo experiments. In addition, viability of B16F10 cells under long-time administration culture in vitro decreased after drug withdrawal, and similar results were also observed in 4T1 cells. Conclusions: Long-time administration of PAC can significantly inhibit viability and promote apoptosis of tumor cells, and had obvious antitumor effect in tumor-bearing mice.

关键词： polysaccharide of Alocasia cucullata tumor cells bcl-2 Caspase-3 ERK1/2 Chinese medicine

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Phase separation of Nur77 mediates XS561-induced apoptosis by promoting the formation of Nur77/bcl-2 condensates

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2024年第3期14卷 1204-1221页

作者： Xiaohui Chen Meichun Gao Yongzhen Xia Xin Wang Jingbo Qin Hongying He Weirong Liu Xiaowei Zhang Shuangzhou Peng Zhiping Zeng Ying Su Xiaokun Zhang School of Pharmaceutical Science Fujian Provincial Key Laboratory of Innovative Drug Target ResearchXiamen UniversityXiamen 361002China NucMito Pharmaceuticals Co. Ltd.Xiamen 361000China Department of Clinical Laboratory the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen UniversityZhuhai 519000China

The orphan nuclear receptor Nur77 is a critical regulator of the survival and death of tumor *** pro-death effect of Nur77 can be regulated by its interaction with bcl-2,resulting in conversion of bcl-2 from a survival to *** bcl-2 is overexpressed in various cancers preventing them from apoptosis and promoting their resistance to chemotherapy,targeting the apoptotic pathway of Nur77/bcl-2 may lead to new cancer ***,we report our identification of XS561 as a novel Nur77 ligand that induces apoptosis of tumor cells by activating the Nur77/bcl-2 *** vitro and animal studies revealed an apoptotic effect of XS561 in a range of tumor cell lines including MDA-MB-231 triple-negative breast cancer(TNBC)and MCF-7/LCC2 tamoxifen-resistant breast cancer(TAMR)in a Nur77-dependent *** studies showed XS561 potently induced the translocation of Nur77 from the nucleus to mitochondria,resulting in mitochondria-related ***,XS561-induced accumulation of Nur77 at mitochondria was associated with XS561 induction of Nur77 phase separation and the formation of Nur77/bcl-2 ***,our studies identify XS561 as a new activator of the Nur77/bcl-2 apoptotic pathway and reveal a role of phase separation in mediating the apoptotic effect of Nur77 at mitochondria.

关键词： XS561 Nur77 bcl-2 Apoptosis Mitochondria Phase separation TNBC TAMR

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基于bcl-2与mTOR蛋白“crosstalk”探究活血定眩胶囊对血管内皮细胞自噬的作用机制

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中国中药杂志 2024年

作者：巩彦龙王凯宋永嘉刘小钰宋敏甘肃中医药大学附属医院骨科甘肃省人民医院骨科甘肃中医药大学中医临床学院

基于B淋巴细胞瘤-2基因（bcl-2）与雷帕霉素靶蛋白（mTOR）蛋白“crosstalk”探究活血定眩胶囊（HXDX）对血管内皮细胞自噬的作用机制。将bEnd.3细胞分为空白对照组、模型组、活血定眩胶囊组，（免疫共沉淀）CO-IP实验后蛋白免疫印迹法... 详细信息

基于B淋巴细胞瘤-2基因（bcl-2）与雷帕霉素靶蛋白（mTOR）蛋白“crosstalk”探究活血定眩胶囊（HXDX）对血管内皮细胞自噬的作用机制。将bEnd.3细胞分为空白对照组、模型组、活血定眩胶囊组，（免疫共沉淀）CO-IP实验后蛋白免疫印迹法（WB）检测bcl-2与mTOR的结合情况，染色后激光共聚焦显微镜观察bcl-2与mTOR蛋白的共定位情况；构建bEnd.3细胞内bcl-2 siRNA模型，将bEnd.3细胞分为5组，空白对照组、氧糖剥夺（OGD）组、转染bcl-2 siRNA组、阴性对照（NC）组、HXDXC组；构建bEnd.3细胞内mTOR siRNA模型，将bEnd.3细胞分为5组，空白对照组、OGD组、转染mTOR siRNA组、NC组、HXDXC组，WB检测自噬相关蛋白的表达。CO-IP实验结果显示bcl-2与mTOR蛋白在bEnd.3细胞可共定位表达，活血定眩胶囊含药血清干预后bcl-2、mTOR蛋白的表达显著上升。筛选并转染bcl-2-mus-384后诱导bEnd.3细胞自噬，bcl-2 siRNA组中bcl-2表达较空白对照组和模型组显著降低，mTOR蛋白的表达较OGD组显著降低、人微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）表达较模型组显著升高，活血定眩胶囊含药血清干预后，HXDX组中bcl-2、mTOR表达较bcl-2 siRNA组显著升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、重组人自噬效应蛋白1（Beclin1）表达较bcl-2 siRNA组显著降低；转染mTOR-mus-7061诱导bEnd.3细胞自噬后，在mTOR siRNA组中，mTOR蛋白表达较空白对照组和模型组显著降低，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达较模型组明显升高；经活血定眩胶囊含药血清干预后HXDX组中bcl-2、mTOR表达较mTOR siRNA组明显升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达较mTOR siRNA组明显降低。该研究从细胞水平探讨了bEnd.3细胞自噬过程中bcl-2与mTOR“crosstalk”，并说明了活血定眩胶囊含药血清对其的调节作用，为椎动脉型颈椎病的治疗提供基础。

关键词：椎动脉型颈椎病自噬 bcl-2 mTOR “crosstalk” 活血定眩胶囊

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骨松益骨方调控Beclin 1/bcl-2对去卵巢大鼠骨细胞凋亡和自噬的影响

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中国骨质疏松杂志 2024年第5期30卷 655-661页

作者：有曼魏立伟柴爽郑旭霞孟璐张虹何广宏秦娜河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院) 河南洛阳471000

目的探讨骨松益骨方(GSYG)对去卵巢(OVX)大鼠骨质疏松的作用以及对Beclin 1/bcl-2介导的骨细胞凋亡与自噬的影响。方法将大鼠随机分成假手术组(Sham)、模型组(Model)、GSYG低、中、高剂量组[1.25、2.5、5 g/(kg·d)]。通过ELISA检测大... 详细信息

目的探讨骨松益骨方(GSYG)对去卵巢(OVX)大鼠骨质疏松的作用以及对Beclin 1/bcl-2介导的骨细胞凋亡与自噬的影响。方法将大鼠随机分成假手术组(Sham)、模型组(Model)、GSYG低、中、高剂量组[1.25、2.5、5 g/(kg·d)]。通过ELISA检测大鼠血清中P1NP和β-CTX的水平;Micro-CT测定股骨骨密度以及微结构的变化;HE染色检查骨组织的形态学变化;TUNEL染色观察骨细胞凋亡;免疫组化观察骨组织中LC3的变化;Western blot法检测大鼠胫骨近端bcl2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP、LC3、Beclin1的表达变化;免疫共沉淀法检测Beclin1和bcl-2的相互作用。结果与模型组相比,GSYG中、高剂量组的P1NP和β-CTX水平显著降低(Pbcl-2的表达显著升高(Pbcl-2相互作用较强,而GSYG高剂量组中两者结合均减少。结论GSYG对OVX大鼠的骨质疏松发展有抑制作用,其机制与其调控Beclin 1/bcl-2介导的凋亡与自噬有关。

关键词：骨松益骨方 Beclin 1 bcl-2 凋亡自噬

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宰后秦川牛肉成熟过程中bcl-2调控线粒体中Ca变化对细胞凋亡及肉保水性的影响

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食品科学 2024年

作者：刘长玲高爽马佳荣李亚蕾罗瑞明曹松敏 1.宁夏大学食品科学与工程学院 2.宁夏大学动物科技学院宁夏大学动物科技学院宁夏大学食品科学与工程学院

为研究宰后秦川牛肉成熟过程中B细胞淋巴瘤2蛋白（B-celllymphomaprotein2，bcl-2）调控线粒体中Ca2+变化对细胞凋亡及肉保水性的影响。用200μmol/L甘氨鹅脱氧胆酸溶液（Glycochenodeoxycholicacid，GCDA）和10μmol/LABT-737溶液注射处理秦川牛背最长肌，测定并分析在4℃条件下成熟0、6、12、24、48、72、120h时，bcl-2 含量、bcl2关联X蛋白（bcl2-associatedXprotein，Bax）含量及Bax/bcl-2水平、内质网和线粒体钙离子浓度变化、电压依赖性阴离子通道蛋白1（Voltage-dependentanionchannelprotein1，VDAC1）表达量、钙蛋白酶含量、以及线粒体细胞凋亡途径和保水性等相关指标变化情况。结果表明：在宰后6h，GCDA处理组和ABT-737处理组的bcl-2含量都极显著大于空白对照组（P＜0.01），GCDA处理组和ABT-737处理组的Bax/bcl-2水平和VDAC1的表达量都极显著低于空白对照组（P＜0.01），GCDA处理组的蒸煮损失率显著低于空白对照组（P＜0.05），ABT-737处理组的蒸煮损失率极显著低于空白对照组（P＜0.01），GCDA处理组的pH高于空白对照组，ABT-737处理组的pH显著高于空白对照组（P＜0.05）；在宰后120h，GCDA处理组和ABT-737处理组的bcl-2的含量相对于空白对照组分别下降了66.29％和7.52％，GCDA处理组Bax含量相对于对照组提高了24.05％，ABT-737处理组Bax含量相对于对照组下降了13.73％，GCDA处理组的Bax/bcl-2水平相对于空白对照组极显著上升（P＜0.01），GCDA处理组和ABT-737处理组的VDAC1的表达量都极显著低于空白对照组（P＜0.01），ABT-737处理组的内质网钙离子浓度极显著大于对照组（P＜0.01），GCDA处理组和ABT-737处理组的线粒体钙离子浓度极显著高于空白对照组（P＜0.01），GCDA处理组和ABT-737处理组的牛钙蛋白酶含量相对于对照组分别提高了67.23％和22.36％，GCDA处理组和ABT-737处理组的Caspase-9的含量相对于空白对照组分别提高了71.82％和61.93％，GCDA处理组的Caspase-3的含量相对于空白对照组增加了68.40％，而ABT-737处理组的Caspase-3的含量显著低于空白对照组（P＜0.05）；在宰后0～120h，GCDA处理组和ABT-737处理组的MFI基本显著高于空白对照组（P＜0.05）。综上，秦川牛宰后成熟过程中，宰后pH的呈显著下降变化，为宰后细胞凋亡的发生提供有利环境条件，bcl-2可以导致VDAC1部分关闭，进而抑制线粒体Ca2+的摄入，Ca2+信号进入细胞后，能够刺激线粒体膜间隙的钙蛋白酶活化，当线粒体内Ca2+超载会促使Caspase-9被激活，再激活下游的Caspase-3，从而诱导细胞凋亡，细胞凋亡和Caspase 激活程度越高，细胞骨架肌原纤维蛋白降解越多，持水能力就越差，肉品保水性就越低。因此得出通过处理bcl-2来调控线粒体内源性途径中对钙离子的影响，进而研究细胞凋亡和肉的保水性的影响。

关键词： bcl-2 宰后成熟秦川牛背最长肌细胞凋亡 Ca 肉的保水性

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基于bcl-2/Bax/caspase-3通路探讨熟地黄对注意缺陷多动障碍大鼠纹状体神经元凋亡的影响

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中国中药杂志 2024年

作者：王静朱康琳倪新强蔡文华杨宇婷章嘉琦周翀史美君广州中医药大学第四临床医学院深圳市中医院中山大学附属第七医院

基于B淋巴细胞瘤-2（bcl-2）/bcl-2相关X蛋白（Bax）/半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）信号通路探讨熟地黄对注意缺陷多动障碍（ADHD）大鼠纹状体神经元凋亡的影响。将24只3周龄雄性自发性高血压病大鼠（SHR）随机分为模型组、哌甲酯组(2... 详细信息

基于B淋巴细胞瘤-2（bcl-2）/bcl-2相关X蛋白（Bax）/半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）信号通路探讨熟地黄对注意缺陷多动障碍（ADHD）大鼠纹状体神经元凋亡的影响。将24只3周龄雄性自发性高血压病大鼠（SHR）随机分为模型组、哌甲酯组(2 mg·kg-1·d-1)和熟地黄组(2.4 mg·kg-1·d-1)，同周龄雄性WKY大鼠设为正常组，每组8只，连续灌胃给药28 d。记录每组体质量和摄食量；旷场实验、高架十字迷宫测试评估大鼠多动、冲动行为；尼氏染色法检测纹状体神经元及尼氏体变化；原位末端标记法（TUNEL）荧光染色检测纹状体细胞凋亡；免疫印迹法（Western blot）检测纹状体中bcl-2、Bax、caspase-3蛋白的表达量。结果显示，与模型组相比，熟地黄可显著降低SHR大鼠在旷场实验中的总运动距离、平均运动速度和中心区停留时间，显著减少在高架十字迷宫中进入开臂的次数比、开臂停留时间和探头次数，明显增多纹状体神经元尼氏体，显著下调凋亡指数，显著升高bcl-2蛋白表达及bcl-2/Bax比值，降低Bax、caspase-3蛋白表达。总之，熟地黄可减少ADHD大鼠的多动、冲动行为，其作用可能与调控纹状体bcl-2/Bax/caspase-3信号通路，增强纹状体神经元抗凋亡能力有关。

关键词：熟地黄注意缺陷多动障碍纹状体 bcl-2 Bax caspase-3 神经元凋亡

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miR-181a靶向bcl-2调控氧糖剥夺/再灌注模型诱导的SH-SY5Y神经细胞凋亡

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石河子大学学报（自然科学版） 2024年第1期42卷 91-100页

作者：袁珊杨玉莹许梅梅胡广泽高蕊石河子大学医学院生物化学教研室/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室新疆石河子832000

目的皮层是响应脑缺血缺氧最为敏感的组织之一,基于前期深度测序技术,我们筛选获得响应脑缺血缺氧应激的皮层区目标基因miR-181a及bcl-2。本研究旨在SH-SY5Y细胞株氧糖剥夺/复糖复氧模型验证二者靶向调控关系及功能,明确miR-181a—bcl-... 详细信息

目的皮层是响应脑缺血缺氧最为敏感的组织之一,基于前期深度测序技术,我们筛选获得响应脑缺血缺氧应激的皮层区目标基因miR-181a及bcl-2。本研究旨在SH-SY5Y细胞株氧糖剥夺/复糖复氧模型验证二者靶向调控关系及功能,明确miR-181a—bcl-2调控网络在OGD/R诱导的神经细胞凋亡中的作用。方法采用线栓法构建大鼠缺血缺氧再灌注损伤模型,脑切片TTC染色及行为学评分法评估模型。应用qRT-PCR及Western Blot验证目标基因的表达。生物信息学分析miR-181a与bcl-2的靶向结合位点并比对结合位点的保守性,双荧光素酶报告基因实验验证miR-181a与bcl-2靶向结合的特异性。采用OGD/R细胞模型体外模拟脑缺血再灌注损伤,检测凋亡相关蛋白表达及Hoechst荧光染色评估细胞凋亡。结果大鼠大脑中动脉阻塞后miR-181a、bcl-2表达变化趋势相反。RNA hybird软件预测miR-181a可结合bcl-2的3′-UTR区,且结合区域高度保守。双荧光素酶报告基因实验发现,相对于bcl-23′UTR-WT与mimic-NC共转染组,bcl-23′UTR-WT与miR-181a mimic共转染后的荧光活性更低(Pbcl-2-Mut与miR-181a mimic共转染组,荧光活性无显著差异(P>0.05)。分别用miR-181a的模拟物及抑制物转染OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞,miR-181a可以抑制bcl-2 mRNA及其蛋白的表达水平(Pbcl-2,下调miR-181a可通过促进bcl-2的表达进而抑制SH-SY5Y神经细胞OGD/R损伤诱导的细胞凋亡。

关键词： miR-181a bcl-2 SH-SY5Y OGD/R 凋亡

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乳酸杆菌对牦牛大肠黏膜屏障的保护作用及Bax和bcl-2蛋白表达的影响

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黑龙江畜牧兽医 2024年第11期 62-66页

作者：常振宇董海龙叶炳涛陈永旭吴庆侠西藏农牧学院动物科学学院西藏林芝860100

为了探讨乳酸杆菌对犊牦牛大肠埃希氏菌(***)所致大肠黏膜屏障的病理损伤,以及对凋亡关键蛋白Bax、bcl-2的影响,试验将24头健康犊牦牛随机分为空白对照组、模型组、低LAB组、高LAB组,空白对照组牦牛每日每头灌服生理盐水10 mL,持续10 d... 详细信息

为了探讨乳酸杆菌对犊牦牛大肠埃希氏菌(***)所致大肠黏膜屏障的病理损伤,以及对凋亡关键蛋白Bax、bcl-2的影响,试验将24头健康犊牦牛随机分为空白对照组、模型组、低LAB组、高LAB组,空白对照组牦牛每日每头灌服生理盐水10 mL,持续10 d;模型组牦牛前5 d灌服生理盐水,第6天灌服生理盐水配制的*** O78,菌落总量为5×10^(8)cfu,第7~10天每天灌服生理盐水;低LAB组牦牛第1~6天与模型组一致,第7~10天每天灌服生理盐水配制的乳酸杆菌10 mL,菌落总量为1×10^(7)cfu;高LAB组牦牛第1~6天与模型组一致,第7~10天每天灌服生理盐水配制的乳酸杆菌10 mL,菌落总量为1×10^(11)cfu。第11天宰杀牦牛,采集各组牦牛盲肠、结肠和直肠肠段组织,采用H.E.染色法分别观察犊牦牛盲肠、结肠病理变化,通过Western-blot检测牦牛盲肠、结肠和直肠组织中凋亡关键蛋白Bax、bcl-2的相对表达量。结果表明:与空白对照组相比,模型组盲肠、结肠固有层有大量炎症细胞浸润,肠上皮细胞出现变性、坏死及脱落现象;高LAB组的肠组织结构完整,肠绒毛及肠腺较发达;与空白对照组相比,模型组Bax蛋白在盲肠、结肠和直肠中的相对表达量显著增加(Pbcl-2蛋白的相对表达量显著降低(Pbcl-2蛋白相对表达量随着乳酸杆菌菌落总量的增加呈依赖性增加且差异显著(Pbcl-2蛋白相对表达量与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)。说明菌落总量为1×10^(11)cfu的乳酸杆菌对*** O78所致的腹泻犊牦牛起到了保护作用。

关键词：乳酸杆菌牦牛大肠黏膜屏障保护 Bax bcl-2

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miR-323b-5p上调抑制bcl-2表达在早发型慢性胰腺炎中的作用机制研究

miR-323b-5p上调抑制Bcl-2表达在早发型慢性胰腺炎中的作用机制研...

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作者：孙晓茹中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

第一部分bcl-2表达下调与慢性胰腺炎的早发相关目的:慢性胰腺炎（chronic pancreatitis,CP）是一种进行性的慢性炎症性疾病,最终导致胰腺的外分泌和内分泌功能损害。其中早发型CP患者（C突变是中国CP人群的特征性突变。既往研究提示SPI... 详细信息

第一部分bcl-2表达下调与慢性胰腺炎的早发相关目的:慢性胰腺炎（chronic pancreatitis,CP）是一种进行性的慢性炎症性疾病,最终导致胰腺的外分泌和内分泌功能损害。其中早发型CP患者（2T>C突变是中国CP人群的特征性突变。既往研究提示SPINK1突变与CP早发相关,但并非CP早发的独立危险因素。此前本课题组发现CP早发与表观遗传学相关,因此本研究利用此前已成功构建的可自发出现CP的Spink1 c.194+2T>C杂合突变小鼠,观察其出现胰腺炎时间和程度差异的特征,并进行进一步分子机制探索。方法:选取8周龄左右的Spink1+/-小鼠,分为Spink1+/-小鼠组和Spink1+/-小鼠+雨蛙素组,对部分小鼠进行雨蛙素注射。于注射后的1 d、14 d、28 d、42 d时间节点处死小鼠,对小鼠胰腺组织进行苏木精-伊红、天狼星红和α-SMA免疫组化染色并分析其组织病理学特征。根据小鼠胰腺组织病理评分及处死时间节点将其分为CP早发组（1-14 d）和CP晚发组（28-42 d）,利用蛋白质谱分析筛选及鉴定参与CP早发的相关因子,随后在小鼠和人胰腺组织中进一步进行定性及定量验证。结果:在Spink1+/-小鼠和Spink1+/-小鼠+雨蛙素两组中均观察到小鼠个体间形成胰腺炎的时间和严重程度存在差异。蛋白质谱分析结果显示早发型CP小鼠与晚发型CP小鼠胰腺组织中存在375个差异表达蛋白,其中,介导细胞凋亡和组织纤维化的bcl-2（B-cell lymphoma-2,B淋巴细胞瘤-2）蛋白在早发型CP小鼠中的表达较晚发型CP小鼠下调1.39倍。同时在早发型CP小鼠及患者的胰腺组织中也观察到bcl-2蛋白表达降低。结论:Spink1+/-突变的小鼠出现CP改变的时间和程度不同。SPINK1突变不是造成CP早发的独立因素,有大量蛋白可能参与其中。bcl-2蛋白的表达降低与CP早发相关。第二部分miR-323b-5p上调抑制bcl-2的表达而促进胰腺腺泡细胞凋亡目的:miRNA是蛋白质的上游分子,可结合多个靶标并同时调节各种信号传导途径。此前本课题组已发现miR-323b-5p上调参与调控CP的早发,且参与凋亡程序。生物信息学预测发现,bcl-2是miR-323b-5p的靶蛋白。前文中发现抗凋亡蛋白bcl-2与CP早发相关。本研究拟在人胰腺组织中验证miR-323b-5p的表达量与早发型CP的关系,随后进一步通过体外实验验证miR-323b-5p对bcl-2的调控,以及两者的表达水平是否直接影响胰腺腺泡细胞的凋亡。方法:选取早发型CP及晚发型CP患者手术切除的胰腺组织蜡块,q PCR检测miR-323b-5p的表达并进行组间比较。双荧光素酶报告实验探究miR-323b-5p与bcl-2的靶向关系。体外实验提取小鼠原代胰腺腺泡细胞并鉴定。构建miR-323b-5p模拟物、miR-323b-5p抑制剂,转染小鼠原代腺泡细胞后,q PCR与WB检测腺泡细胞bcl-2的表达水平,TUNEL染色法与双染流式细胞术检测腺泡细胞凋亡情况。同时构建靶向抑制bcl-2表达的si RNA（si bcl-2）,设立正常对照组、miR-323b-5p抑制剂组、si bcl-2组、si bcl-2+miR-323b-5p抑制剂组,分别转染小鼠腺泡细胞,TUNEL染色法与双染流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:在前期本课题组研究结果的基础上,q PCR结果再次提示miR-323b-5p在早发型CP患者胰腺组织中表达升高。双荧光素酶报告实验提示miR-323b-5p靶向调控bcl-2的表达。miR-323b-5p模拟物转染腺泡细胞后,q PCR和WB显示bcl-2表达下调,腺泡细胞凋亡增加;miR-323b-5p抑制剂转染腺泡细胞后,q PCR和WB显示bcl-2表达上调,腺泡细胞凋亡减少。较正常对照组,si bcl-2组的腺泡细胞凋亡明显增加;si bcl-2+miR-323b-5p抑制剂组较si bcl-2组的细胞凋亡数下降,但较miR-323b-5p抑制剂组上升。结论:miR-323b-5p表达上调与早发型CP相关。miR-323b-5p上调和bcl-2的下调均可增加胰腺腺泡细胞凋亡。进一步提示miR-323b-5p上调靶向抑制bcl-2的表达,减弱bcl-2对腺泡细胞凋亡的抑制作用,造成胰腺腺泡细胞的凋亡。

关键词：早发型慢性胰腺炎晚发型慢性胰腺炎 SPINK1 bcl-2 早发型慢性胰腺炎 miR-323b-5p bcl-2

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