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针对bcr/abl的锤头状核酶的骨髓净化作用

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2003年第9期35卷 859-863页

作者：吴勇陈元仲黄慧芳陈萍吕联煌福建医科大学协和医院福建省血液研究所福建医科大学协和医院福州350001

为了探讨锤头状核酶对原代慢性粒细胞白血病 (chronicmyelogenousleukemia ,CML)细胞的作用及其在体外骨髓净化的效果 ,应用逆转录病毒介导的基因转移法将针对bcr abl融合基因的核酶转染原代CML和正常人骨髓单个核细胞 ,通过造血祖细胞... 详细信息

为了探讨锤头状核酶对原代慢性粒细胞白血病 (chronicmyelogenousleukemia ,CML)细胞的作用及其在体外骨髓净化的效果 ,应用逆转录病毒介导的基因转移法将针对bcr abl融合基因的核酶转染原代CML和正常人骨髓单个核细胞 ,通过造血祖细胞集落培养、流式细胞术、免疫细胞化学法检测核酶对原代CML细胞的作用 ;进一步将此核酶转染CML缓解模型 ,通过白血病细胞集落培养、巢式RT PCR检测其在体外骨髓净化的效果。结果表明 ,原代CML细胞生长增殖和p2 10的表达显著受抑 ,但正常造血祖细胞受影响较小 ;核酶完全抑制模拟缓解骨髓中残留K5 6 2细胞的增殖及bcr ablmRNA表达 ,但并不影响ablmRNA表达 ,因此有望用于CML的体外骨髓净化。

关键词：锤头状核酶融合基因 bcr/abl 慢性粒细胞白血病骨髓净化

IKZF1基因在bcr/abl融合基因阳性急性淋巴细胞白血病中的表达及机制探讨

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现代肿瘤医学 2022年第4期30卷 603-607页

作者：刘锋温静李光戴进前杜明珠宋艳萍西安市中心医院西安市血液病研究所陕西西安710004

目的:探讨IKZF1基因在急性淋巴细胞白血病中的表达特点及可能机制,进一步明确急性淋巴细胞白血病的发病机理。方法:收取80例急性淋巴细胞白血病患者的外周血标本,其中21例bcr/abl融合基因阳性,均为B细胞急性淋巴细胞白血病。RT-PCR技术... 详细信息

目的:探讨IKZF1基因在急性淋巴细胞白血病中的表达特点及可能机制,进一步明确急性淋巴细胞白血病的发病机理。方法:收取80例急性淋巴细胞白血病患者的外周血标本,其中21例bcr/abl融合基因阳性,均为B细胞急性淋巴细胞白血病。RT-PCR技术检测IKZF1基因、RAG1基因及RAG2基因的表达;提取细胞DNA,PCR技术检测IKZF1基因的缺失突变;二代测序了解IKZF1基因断裂点区域的碱基序列。结果:RT-PCR结果显示80例急性淋巴细胞白血病中19例表达IK6亚型,其中17例为bcr/abl融合基因阳性B细胞急性淋巴细胞白血病,2例为bcr/abl融合基因阴性B细胞急性淋巴细胞白血病。即IK6亚型的表达主要在B细胞急性淋巴细胞白血病中,且主要与bcr/abl融合基因有关。PCR实验证实了bcr/abl融合基因阳性B细胞急性淋巴细胞白血病中IKZF1基因发生了缺失突变。二代测序发现IK6亚型由IKZF1基因2号内含子和6号内含子异常断裂后拼接形成,断裂点处存在重组激活基因蛋白能靶向作用的cRSS序列。结论:IK6亚型的表达主要在B细胞急性淋巴细胞白血病中。IK6亚型的表达在急性淋巴细胞白血病中与bcr/abl融合基因有关。IK6亚型的表达在bcr/abl融合基因阳性急性淋巴细胞白血病中与重组激活基因蛋白靶向作用导致IKZF1基因2号和6号内含子断裂可能相关。

关键词：急性淋巴细胞白血病 bcr/abl IKZF1 IK6 cRSS 重组激活基因蛋白

FABD对bcr/abl蛋白致癌能力的影响及机制的探究

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FABD对BCR/ABL蛋白致癌能力的影响及机制的探究

作者：郑忍忍重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:慢性髓细胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia,CML）是由造血干细胞异常增殖分化以及肿瘤性转化所引起的。t（9;22）（q34;q11）易位后所编码的bcr/abl蛋白是其发生发展的标志性蛋白。针对bcr/abl激酶区设计的一线药物伊马替尼（Im... 详细信息

目的:慢性髓细胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia,CML）是由造血干细胞异常增殖分化以及肿瘤性转化所引起的。t（9;22）（q34;q11）易位后所编码的bcr/abl蛋白是其发生发展的标志性蛋白。针对bcr/abl激酶区设计的一线药物伊马替尼（Imatinib,IM）取得了良好的效果,但其耐药或不耐受使得部分CML患者无法完全治愈。课题组前期发现在耐药的细胞中bcr/abl仍具有激酶活性,因而我们推测在bcr/abl致病中除激酶区外,还有其他结构域发挥着重要作用,也因此有望成为新的治疗靶点。F-肌动蛋白结合域（F-actin binding domain,FABD）作为bcr/abl的关键区域,定位于c-abl的羧基末端,影响着蛋白激酶的活性。已有文章报道缺失FABD可以影响c-abl蛋白的定位及其生物学功能,但是,这一结构域在bcr/abl融合蛋白中发挥怎样的功能尚不明确也未见相关报道。因此通过32D细胞及小鼠模型,进一步探讨FABD缺失后对bcr/abl蛋白调控细胞转化、增殖、定位及致白血病能力的影响,并试图阐明相关机制。方法:1.首先构建FABD缺陷型腺病毒载体Ad-bcr/ablΔFABD、野生型Ad-bcr/abl腺病毒载体和对照载体Adtrack,用腺病毒分别感染32D细胞,通过CCK-8、细胞集落形成、流式细胞术以及DAPI染色检测FABD缺失后对32D细胞增殖、凋亡的影响。2.探讨FABD缺失对bcr/abl引起的小鼠白血病严重程度的影响,将腺病毒分别感染的32D细胞通过尾静脉注射至小鼠体内,观察小鼠存活状态,记录小鼠体重以及外周血细胞计数变化情况,处死濒死小鼠,分离肝脏、脾脏、骨髓组织或细胞,进行瑞吉染色、HE染色观察白血病细胞浸润程度。3.通过western blot和免疫荧光检测FABD缺失后对bcr/abl及其下游信号分子STAT5、ERK、AKT和CRKL磷酸化水平的影响和bcr/abl蛋白在细胞内的位置变化。通过Co-IP检测缺失FABD后的bcr/abl与细胞骨架相关蛋白F-actin的相互作用及结合情况。最后通过Western blot、免疫荧光和免疫组织化学检测bcr/abl入核后的p73及其下游分子的表达情况。结果与结论:1.成功构建了可以表达目的蛋白的腺病毒载体:缺失型Ad-bcr/ablΔFABD、野生型Ad-bcr/abl和空载Adtrack。在体外实验中我们发现,与全长bcr/abl相比,FABD缺失后的细胞增殖速度和集落形成大小受到抑制,同时凋亡细胞比例有所升高,细胞形态更趋近凋亡碎裂。因此,缺失FABD可以减弱bcr/abl促进细胞增殖的能力同时也可以削弱bcr/abl抵抗凋亡的能力。2.小鼠体内实验表明,与全长bcr/abl相比,FABD缺失后小鼠外周血白细胞数量明显减少,组织中白细胞浸润数量减少、浸润程度减轻,肝脾肿大程度也得到明显缓解,缺失FABD后减少了CML样疾病的发病率,这说明FABD缺失可在一定程度上缓解体内白血病的严重程度。3.FABD缺失后,bcr/abl（Y177）蛋白磷酸化水平明显升高,并且这种升高的激酶活性不被imatinib抑制,但是其下游分子STAT5、ERK、AKT和CRKL磷酸化水平呈下降趋势。FABD缺失后,F-actin与bcr/abl的共定位消失,相互结合能力减弱,bcr/abl的细胞内定位也发生了改变,bcr/abl蛋白不单单分布在细胞质,也有部分蛋白进入细胞核。入核后的bcr/abl诱导p73表达,从而激活下游凋亡分子PUMA进一步促进细胞凋亡。综上所述,我们发现一方面,FABD缺失不仅可以抑制bcr/abl促进细胞增殖的能力,还可以抑制bcr/abl抗凋亡的能力。另一方面,FABD缺失诱导的细胞凋亡可能归因于bcr/abl进入细胞核。针对这一结构域可能有助于找到新的疗法,以更好地抑制慢性髓细胞白血病的进展。

关键词：慢性髓细胞白血病 bcr/abl F-肌动蛋白结合域细胞内定位

bcr/abl融合基因少见型实时荧光PCR定量检测在慢性髓系白血病中的应用

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中国实验血液学杂志 2017年第4期25卷 1016-1021页

作者：邹媛杜翠陈红梅郭福晓程建兵唐远燕吴薇夏成青杭州艾迪康医学检验中心分子病理实验室浙江杭州310030

目的:探讨实时荧光定量聚合酶链反应法(real-time PCR)检测bcr/abl少见融合型别在bcr/abl常见型别阴性慢性髓系白血病(CML)中的临床应用价值。方法:收集2012年7月至2015年12月期间FISH检测或染色体核型分析存在Ph染色体的CML病例2 490例... 详细信息

目的:探讨实时荧光定量聚合酶链反应法(real-time PCR)检测bcr/abl少见融合型别在bcr/abl常见型别阴性慢性髓系白血病(CML)中的临床应用价值。方法:收集2012年7月至2015年12月期间FISH检测或染色体核型分析存在Ph染色体的CML病例2 490例,其中bcr/abl P210,P190和P230定量检测均为阴性的病例12例,对该12例样本采用实时荧光PCR法定量检测b2a3(e13a3)、b3a3(e14a3)、e6a2、e8a2和e1a3等5种罕见bcr/abl融合型别。结果:12例样本中e1a3、e8a2、b2a3、b3a3和e6a2型别阳性分别为1、2、5、4和0例,阳性率分别为8.33%、16.67%、41.67%、33.33%和0%;总阳性率为100%,以b2a3型和b3a3型为主。结论:实时荧光PCR法定量检测bcr/abl少见融合型别,可用于临床疑似CML而bcr/abl常见型别定量检测阴性病例的诊断及微小残留病变监测。

关键词： bcr/abl mRNA 实时荧光PCR 慢性髓系白血病

59例bcr/abl阳性急性淋巴细胞白血病的临床特征及治疗转归

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南方医科大学学报 2009年第3期29卷 512-515页

作者：刘志刘晓力杜庆锋许娜钟敏宋兰林易正山刘启发孟凡义周淑芸南方医科大学南方医院血液科广东广州510515

目的研究分析bcr/abl阳性急性淋巴细胞白血病(bcr/abl+-ALL)临床特征及治疗转归,筛选可能影响临床疗效的相关预后因素。方法我院2001年1月至2008年5月荧光原位杂交检查确诊为原发bcr/abl+-ALL59例,经VDLP±Ara-C方案诱导化疗,化疗不缓... 详细信息

目的研究分析bcr/abl阳性急性淋巴细胞白血病(bcr/abl+-ALL)临床特征及治疗转归,筛选可能影响临床疗效的相关预后因素。方法我院2001年1月至2008年5月荧光原位杂交检查确诊为原发bcr/abl+-ALL59例,经VDLP±Ara-C方案诱导化疗,化疗不缓解者或准备移植者给予伊马替尼治疗,其中接受伊马替尼联合治疗17例,行异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)16例。结果59例bcr/abl+-ALL患者中位年龄32(3～69)岁,经第1疗程诱导治疗后获CR共32例(54.2%)。外周血白细胞计数bcr/abl+-ALL的疗效有一定的负性影响,Ph+伴附加染色体异常、合并败血症者生存期短,伊马替尼联合治疗和allo-HSCT均可延长bcr/abl+-ALL的生存期。

关键词：急性淋巴细胞白血病 bcr/abl 伊马替尼异基因造血干细胞移植

RNA干扰对慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因表达的抑制作用

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中华血液学杂志 2005年第6期26卷 359-362页

作者：马晓霞王椿卫菊秦尤文颜式可高彦荣蔡琦上海市第一人民医院血液科 200080

目的研究RNA干扰(RNAi)效应对慢性粒细胞白血病(CML)bcr/abl融合基因表达的抑制作用。方法体外化学合成针对bcr/abl融合基因的小干扰RNA(siRNA),并用电穿孔方法将siRNA转染K562细胞株,以未转染的细胞及非特异性的siRNA转染细胞作对照;... 详细信息

目的研究RNA干扰(RNAi)效应对慢性粒细胞白血病(CML)bcr/abl融合基因表达的抑制作用。方法体外化学合成针对bcr/abl融合基因的小干扰RNA(siRNA),并用电穿孔方法将siRNA转染K562细胞株,以未转染的细胞及非特异性的siRNA转染细胞作对照;同时转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照,流式细胞术检测其绿色荧光以确定转染效率;实时定量RTPCR及Westernblot法检测siRNA的抑制效应。MTT法检测细胞增殖抑制率。膜联蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)及碘化丙锭双染法测细胞凋亡率。结果电穿孔的转染效率可达70%;化学合成的siRNA可以抑制bcr/abl融合基因在mRNA和蛋白水平的表达;特异性siRNA可以抑制细胞增殖,转染24h细胞增殖抑制率达47%,48h达56%;特异性siRNA转染细胞24h组凋亡率为15.05%,48h组为19.47%,与对照组(1.00%)比较明显提高。结论在细胞水平上,化学合成的siRNA可以抑制bcr/abl融合基因的表达,为利用RNA干扰作为基因治疗的研究奠定基础。

关键词： RNA干扰慢性粒细胞白血病 bcr/abl 融合基因抑制作用细胞凋亡

bcr/abl转基因动物模型研究进展及应用

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中国实验血液学杂志 2011年第6期19卷 1532-1535页

作者：朱玉峰王元占孟凡义南方医科大学南方医院实验动物研究中心广东广州510515 南方医科大学南方医院血液病科广东广州510515

转基因动物模型为研究慢性粒系白血病的发病机理与治疗提供了一个良好平台。利用不同的启动子或四环素调控系统已建立了一系列的bcr/abl转基因动物模型,其中相当一部分动物模型能很好的模拟人的CML特征,并在CML的发病机理与治疗的研究... 详细信息

转基因动物模型为研究慢性粒系白血病的发病机理与治疗提供了一个良好平台。利用不同的启动子或四环素调控系统已建立了一系列的bcr/abl转基因动物模型,其中相当一部分动物模型能很好的模拟人的CML特征,并在CML的发病机理与治疗的研究中广泛应用。本文就目前bcr/abl转基因动物模型的研究进展、优缺点及应用作一综述。

关键词： bcr/abl 慢性髓系白血病转基因动物

抗bcr/abl mRNA特异性核酶作用于靶基因的细胞内外切割实验

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复旦学报（医学版） 2003年第3期30卷 259-262页

作者：陈波斌林果为陆华中范华骅郭荣肖娟高跞高峰复旦大学附属华山医院血液科上海200040 上海市血液中心上海200051

目的将已构建的具有抗慢性粒细胞性白血病(CML)融合基因bcr/abl mRNA的含核酶载体,进行细胞内外实验,了解抗bcr/abl mRNA核酶的切割效应。方法含有抗靶基因的真核表达载体pAVGS4经酶切后,其中抗CML核酶M1-GS RNA的DNA序列被构建到pUC1... 详细信息

目的将已构建的具有抗慢性粒细胞性白血病(CML)融合基因bcr/abl mRNA的含核酶载体,进行细胞内外实验,了解抗bcr/abl mRNA核酶的切割效应。方法含有抗靶基因的真核表达载体pAVGS4经酶切后,其中抗CML核酶M1-GS RNA的DNA序列被构建到pUC19上得到pGS210,并经酶切和测序鉴定;合成bcr/abl融合位点前后的一段靶序列,克隆到pGEM-7zf(+)上得到p bcr-abl经测序鉴定,将pGS210和p bcr-abl进行体外转录,获得 M1-GS RNA及其作用底物,将两者混合、孵育,通过放射自显影术检测切割的效果;将pAVGS4转染到CML细胞株K652细胞内,通过RT-PCR方法了解核酶对于目标 RNA的作用效应。结果 p bcr-abl经酶切电泳及测序证实载体中含有目标序列,Ml-GS RNA作用于底物后,放射自显影术检测显示底物 RNA被有效切割。pAVGS4转染到K562细胞48和72h后,RT-PCR显示bcr/abl mRNA被有效切割。结论 pAVGS4可以有效地切割K562细胞内的bcr/abl mRNA,预期可作为CML分子靶向治疗的工具。

关键词： bcr/abl 核酶 RNA 细胞内 CML bcr-abl 抗b 酶切测序底物

STI571、三氧化二砷和Velcade对bcr/abl^+-CD34^+细胞增殖、凋亡的影响

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南方医科大学学报 2007年第11期27卷 1665-1669页

作者：李澄宇孟凡义孙启鑫扶云碧李利易正山宋兰林南方医科大学南方医院血液科广东广州510515

目的研究STI571、三氧化二砷(As2O3)和Velcade在单独及联合应用时对bcr/abl+-CD34+细胞增殖、凋亡的影响。方法提取慢性粒细胞白血病患者骨髓的bcr/abl+-CD34+细胞,用STI571、As2O3、Velcade单独及联合处理96h,通过CCK-8分析及流式细胞... 详细信息

目的研究STI571、三氧化二砷(As2O3)和Velcade在单独及联合应用时对bcr/abl+-CD34+细胞增殖、凋亡的影响。方法提取慢性粒细胞白血病患者骨髓的bcr/abl+-CD34+细胞,用STI571、As2O3、Velcade单独及联合处理96h,通过CCK-8分析及流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡的变化,并用Hoechst33342染色及荧光显微镜技术观察凋亡细胞形态学改变。同时检测上述方案对正常骨髓CD34+细胞的抑制作用。结果STI571、As2O3及Velcade对bcr/abl+-CD34+细胞的作用呈剂量依赖性,其中在低浓度时以抑制增殖作用为主,促凋亡作用不明显。当0.25～2μmol/LSTI571分别与2.5μmol/LAs2O3及15nmol/LVelcade联合后,抑制率和凋亡率均显著提高,呈相加或协同作用,且对正常CD34+细胞的抑制作用无进一步增强。结论As2O3及Velcade与STI571联合能够增强对bcr/abl+-CD34+细胞的作用,具有一定临床意义。

关键词： bcr/abl CD34^+细胞 STI571 三氧化二砷 Velcade