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Komagataeibacter xylinus运动相关基因的敲除及对细菌纤维素合成的影响

Komagataeibacter xylinus运动相关基因的敲除及对细菌纤维素合成...

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作者：王旭天津科技大学

学位级别：硕士

细菌纤维素(Bacterial cellulose,bc)是由细菌合成的高分子生物聚合物,具有保水性高、结晶度高、可降解性强、生物相容性高、纯度高等优良特性,广泛应用于食品、医疗、化妆品、功能膜等领域。木葡萄糖酸醋杆菌(Komagataeibacter xylinus... 详细信息

细菌纤维素(Bacterial cellulose,bc)是由细菌合成的高分子生物聚合物,具有保水性高、结晶度高、可降解性强、生物相容性高、纯度高等优良特性,广泛应用于食品、医疗、化妆品、功能膜等领域。木葡萄糖酸醋杆菌(Komagataeibacter xylinus)是bc合成研究的模式菌株。该菌株可以利用葡萄糖、甘油、甘露醇等碳源合成bc,也可以利用糖蜜等复杂底物合成bc,具有高产量、低成本等优点。随着合成生物学的发展,越来越多的国内外学者成功利用代谢工程的手段改造醋酸杆菌,提高bc产量或改变bc结构。研究发现,细菌的运动相关基因与bc合成有关,在此基础上,我们利用CRISPR-Cas9技术成功敲除细菌运动相关基因motA、motB,构建了敲除菌株K.xylinus-ΔmotA、K.xylinus-ΔmotB、K.xylinus-Δmot2A、K.xylinus-ΔmotAB。之后,为了探究敲除基因与bc合成的关系,我们将敲除菌株进行发酵验证,结果表明:同时敲除基因motA和motB基因的敲除菌敲除菌K.xylinus-ΔmotAB的bc产量最高,达到6.87±0.17 g/L,与野生型菌株相比,提高44%左右;同时,该菌株合成的bc的孔隙率最低,达到了54.35%,并具有更优越的力学性能,杨氏模量显著提高,最高可达5211 MPa。此外,敲除运动相关基因对bc化学结构及网状结构并没有明显改变。由于目前针对bc合成模式菌K.xylinus开发的遗传操作工具仍比较少,因此,我们将传统的sacB介导的反向筛选敲除系统引入该菌,探索该系统的可行性。本研究首先利用卡那抗性基因和红色荧光蛋白编码基因mRFP以及枯草芽孢杆菌来源的携带sacB基因的pkR6k质粒构建基因敲入载体。首先用强启动子P替换卡那抗性基因原始启动子,构建强启动子的质粒pkR6k,在此基础上,将新构建的质粒pkR6k与同源臂连接,构建敲入载体及敲除载体,将质粒pkR6k与同源臂连接及mRFP基因连接,构建mRFP基因敲入载体。为了进一步提高重组效率,促进基因敲除及敲入的效率,我们将重组酶表达系统引入该质粒,优化质粒敲除系统从而为后续的敲除方法建立奠定基础。

关键词：木葡萄糖酸醋杆菌细菌纤维素 motA基因 motB基因基因敲除 bc合成孔隙率

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氧分压及碳源对细菌纤维素合成影响的研究

氧分压及碳源对细菌纤维素合成影响的研究

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作者：李思琦天津科技大学

学位级别：硕士

为了研究碳源和氧分压对细菌纤维素合成及纤维结构的影响,本文从单一碳源培养,复合碳源培养,过表达FBP蛋白,以及不同碳源及氧分压等角度,通过测定发酵参数,细菌纤维素材料性能以及相关酶活水平,并通过代谢组学技术进一步探究碳源及氧分... 详细信息

为了研究碳源和氧分压对细菌纤维素合成及纤维结构的影响,本文从单一碳源培养,复合碳源培养,过表达FBP蛋白,以及不同碳源及氧分压等角度,通过测定发酵参数,细菌纤维素材料性能以及相关酶活水平,并通过代谢组学技术进一步探究碳源及氧分压对细菌纤维素合成机制的影响。得到的结果如下:（1）通过葡萄糖和甘油作为单一碳源合成细菌纤维素,以葡萄糖为碳源相比,甘油为碳源时G.xylinus CGMCC 2955的细胞浓度低,pH值高,副产物葡萄糖酸浓度低,细菌纤维素产量高,产量为4.930 g/L,碳源-细菌纤维素转化率高。其中甘油为碳源,发酵起始的细菌纤维素产量低,终产量高,这是由于葡萄糖和甘油为碳源时,菌体代谢及细菌纤维素合成途径差异的影响。（2）在单一碳源合成细菌纤维素实验结果的基础上,利用葡萄糖和甘油的复合碳源合成细菌纤维素,最优复合碳源比例是葡萄糖:甘油为1.5:1,最优复合碳源合成细菌纤维素产量为5.994 g/L,复合碳源合成细菌纤维素的孔隙率、结晶度及杨氏模量增大。（3）确定果糖-1,6-二磷酸酶（FBP）是糖异生途径的限速酶。通过过表达fbp基因,构建过表达FBP蛋白菌株,与G.xylinus CGMCC 2955的发酵参数相比,G.xylinus-fbp+的细胞浓度增大,细菌纤维素产量及碳源-细菌纤维素转化率降低。（4）通过调节碳源及氧分压,从发酵参数、材料性能、代谢组学以及相关酶活水平对G.xylinus CGMCC 2955及G.xylinus-fbp+合成细菌纤维素进行研究。15%氧分压条件下,以甘油为碳源,G.xylinus CGMCC 2955合成细菌纤维素产量最高,且以甘油为碳源可以通过减少副产物葡萄糖酸的含量进一步减少氧浓度对于细菌纤维素产量的影响。低氧培养条件下,FBP蛋白的过表达会促进了碳源向细菌纤维素合成代谢。随着氧分压的增大,孔隙率增大,G.xylinus-fbp+合成的细菌纤维素孔隙率增大。对代谢组学数据和胞内相关酶活水平分析结果表明,随着氧分压的增大,EMP途径关键酶以及UGPase酶活力降低,氨基酸以及脂肪酸的相对含量增加。在15%氧分压条件下,FBP蛋白的过表达会促进D-木糖、D-（-）-塔格糖以及脯氨酸的显著累积。

关键词：细菌纤维素 bc合成微环境碳源氧分压代谢组

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