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木鳖子制霜工艺及炮制“减毒增效”机理初步研究

木鳖子制霜工艺及炮制“减毒增效”机理初步研究

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作者：宋燕安徽中医药大学

学位级别：硕士

目的木鳖子(Momordica cochinensis(Lour.)Spreng.)为葫芦科植物木鳖的干燥成熟种子,属于有毒中药,临床应用需炮制成霜。本课题旨在优化木鳖子霜的最佳炮制工艺,并分析比较木鳖子制霜前后的化学成分、急性毒性及抗肿瘤药效的差异,以此... 详细信息

目的木鳖子(Momordica cochinensis(Lour.)Spreng.)为葫芦科植物木鳖的干燥成熟种子,属于有毒中药,临床应用需炮制成霜。本课题旨在优化木鳖子霜的最佳炮制工艺,并分析比较木鳖子制霜前后的化学成分、急性毒性及抗肿瘤药效的差异,以此探讨木鳖子霜的“减毒增效”机理。方法1木鳖子霜的最佳工艺研究以丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯、β-谷甾醇,齐墩果酸含量及脂肪油含量的指标归一值“OD”为综合评价指标,采用三因素三水平的Box-Behnken响应面法(bbd-rsm)设计试验,考察烘制时间、烘制温度、压制时间对木鳖子霜的炮制工艺影响。2木鳖子制霜前后化学成分差异研究采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术(UPLC-QTOF-MS),通过时间依赖型的质谱数据扫描模式(MS)采集木鳖子与木鳖子霜各9批样品的高精确度的数据,将Unifil软件与Progenesis QI软件分析数据结合,根据主成分分析(PCA)与正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)比较木鳖子制霜前后的化学成分差异。3木鳖子制霜前后急性毒性及抗肿瘤药效比较研究根据小鼠急性毒性实验方法,以概率单位法(Bliss)计算木鳖子与木鳖子霜醇提物口服的LD,并于给药后连续14 d观察、记录各组小鼠的自主活动、精神状况及毒性反应、死亡数,实验结束处死小鼠,取肝、肾进行病理学检查。采用昆明种小鼠腋下接种H肝癌腹水方式,建立移植性肿瘤模型。将H荷瘤小鼠分为模型组(无菌生理盐水)、阳性CTX组(20mg/kg)、阳性复方守宫散组(1.95g/kg)、木鳖子给药组(1.65g/kg、0.55g/kg)、木鳖子霜给药组(1.65g/kg、0.55g/kg)及正常组,连续灌胃给药10天。观察荷瘤小鼠的生活状态及体质量变化,测定抑瘤率、脏器指数;ELISA法测定血清中IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α水平;HE染色观察肿瘤、肝脏组织的病理变化,免疫组化法检测肿瘤组织中bax、bcl-2蛋白表达水平。结果1木鳖子霜的最佳工艺研究根据bbd-rsm优选出木鳖子霜最佳炮制工艺条件为烘制时间1.7h、烘制温度80℃、压制时间30min。2木鳖子制霜前后成分差异研究木鳖子鉴定32种成分,木鳖子霜新增9种成分,共41个化合物。(1)新增9种成分,即oleragenin;Goyaglycoside f;Charantosides A;momordicoside U;3-O-β-D-glucofuranosidurono-6,3-lactone-gypsogenin;Karavilagenins D;daucosterol;Kuguacins K;Kuguacins O。(2)含量显著差异6种成分,MomordinsⅢ、Neokug uaglucoside、nonadec-10-enoic acid、oleanolic acid木鳖子霜更高;(9Z,11Z,13E)-o ctadeca-9,11,13-trienoic acid、KaravilosidesⅠ木鳖子更高。3木鳖子制霜前后急性毒性及H抗肿瘤药效研究3.1木鳖子制霜前后急性毒性研究木鳖子与木鳖子霜各组小鼠均不同程度的出现自发活动减少、困倦、眼睑半闭,严重的表现强直性抽搐,直至死亡;根据Bliss法,计算出木鳖子LD=16.777g/kg,木鳖子霜LD=28.560g/kg。木鳖子霜毒性较木鳖子明显降低;且木鳖子霜组肝、肾组织病变程度较木鳖子组有不同程度的减轻。3.2木鳖子制霜前后的H荷瘤小鼠抗肿瘤作用研究木鳖子与木鳖子霜各组小鼠均不同程度改善H荷瘤小鼠一般状况,提高脾脏、胸腺指数,抑制肿瘤生长,但二者之间无显著性差异;均升高血清IL-2、IL-6、IL-12与TNF-α的水平,且木鳖子霜较木鳖子(1.65g/kg)的IL-2、TNF-α水平显著升高,木鳖子霜较木鳖子(0.55g/kg)的IL-12水平显著提高;均提高肿瘤组织中bax表达,并抑制bcl-2表达从而升高bax/bcl-2比值,且木鳖子霜较木鳖子显著升高;缓解肿瘤及肝脏组织的病理学变化。结论本课题以bbd-rsm优选的木鳖子霜炮制工艺稳定可行,模型预测性良好。木鳖子与木鳖子霜化学成分存在“质”、“量”差异;木鳖子霜急性毒性明显低于木鳖子;而木鳖子霜可能通过提高IL-2、IL-6、TNF-α因子水平及调节凋亡基因bcl-2、bax水平增强其抗肿瘤疗效,初步阐明木鳖子霜的“减毒增效”机理。

关键词：木鳖子制霜 bbd-rsm UPLC-QTOF-MS 抗肿瘤 LD50 减毒增效

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中药黄酮类成分的红外提取工艺优化及其抗氧化活性研究

中药黄酮类成分的红外提取工艺优化及其抗氧化活性研究

引用

作者：贺敬霞成都中医药大学

学位级别：硕士

黄酮类化合物广泛存在于药用植物中,已用于治疗多种慢性疾病,如高血压、糖尿病及动脉粥硬化等。目前就黄酮类成分的有效提取研究,以解决其提取过程中费用昂贵、操作复杂、耗时、耗剂等问题为关键所在。为此,探索一条绿色环保、高效、经... 详细信息

黄酮类化合物广泛存在于药用植物中,已用于治疗多种慢性疾病,如高血压、糖尿病及动脉粥硬化等。目前就黄酮类成分的有效提取研究,以解决其提取过程中费用昂贵、操作复杂、耗时、耗剂等问题为关键所在。为此,探索一条绿色环保、高效、经济的方法是非常重要的,故本研究以富含黄酮类化合物的葛根、黄芪、槐花、黄芩作为模式饮片进行了探索性研究。对影响黄酮提取效率的提取时间、提取溶剂、料液比和功率等因素运用单因素结合Box-Behnken响应面设计法(bbd-rsm)进行筛选,确定最佳的红外提取工艺,并采用超高效液相色谱(UPLC)法建立快速同步测定饮片中多种黄酮类成分含量的方法。最终由红外辅助法、超声法、回流法测定不同饮片中总黄酮含量,结合氧自由基吸收能力(ORAC)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)来评价红外法和传统法的优劣,通过总黄酮含量与抗氧化活性更加全面、可靠筛选了提取工艺。研究结果如下:(1)UPLC定量方法的建立采用UPLC对中药材的流动相、色谱条件及方法学进行研究。根据饮片中多种黄酮类成分的性质,筛选出分离度好、出峰时间快、峰型与峰面积好的甲酸,乙腈流动相梯度与最佳的柱温、检测波长、流速等色谱条件。并结合方法学的考察结果建立了四种饮片定量分析方法。各考察结果均达到标准要求,且仪器性能良好,红外辅助方法稳定可靠,各项结果表明可进行各饮片的有效成分含量测定和进一步研究。(2)红外辅助和传统提取研究运用红外辅助法对各饮片一的料液比,提取时间,提取功率等进行单因素筛选,并通过bbd-响应面法对影响大的因素进行进一步优化,最终得红外辅助提取总黄酮最佳提取工艺。最佳条件下各药材总黄酮含量分别为:黄芪的总黄酮含量为0.575mg/g,葛根的总黄酮含量为34.61mg/g,槐花的总黄酮的含量为33.199mg/g,黄芩的总黄酮的含量为174.794mg/g。同时以传统提取法(超声提取,回流提取)提取各饮片中总黄酮含量,其分别对应的最高含量分别为1.142,40.73,30.217,182.695mg/g,由结果显示,表明不同提取方法除黄芪外其含量相差较少,黄芪传统提取法含量约为红外的2倍。(3)抗氧化活性研究分别测定各饮片的ORAC值与DPPH值,在最佳红外辅助提取条件下,黄芪、葛根、槐花、黄芩的抗氧能力ORAC值分别为:6576.203±553、5824.016±575、3785.827±518、1603.197±78μmoL/g,清除活性DPPH值分别为110.83、32.50、53.44、88.49μg/mL。传统提取方法对应的最高ORAC值分别为:3428.050±391、3362.656±284、2983.864±232、2300.137±78μmo L/g,DPPH值:84.13,64.33,70.2,74.46μg/m L。由结果知,红外辅助提取的氧化活性整体强于传统提取方法,且黄芪红外提取的氧化活性是传统的2倍。本实验建立了以UPLC同时测定多种黄酮类的定量分析方法,并通过活性研究表明四种饮片的不同提取方法均有一定活性。以上研究结果表明红外辅助提取的效率高于传统提取,在含量与活性研究上,其整体优于传统,具有高效、经济、环保、绿色等特点,可用于之后提取工艺的研究。且通过含量与活性研究可知,采用这两种方法共同评价提取方法更加合理客观,避免了单方面片面的评价,使红外辅助法更好的用于研究。本实验可为之后红外辅助提取黄酮类成分,含量和活性研究奠定基础。

关键词：红外提取 bbd-rsm 黄酮类成分 UPLC 氧化活性

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