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血清外泌体中b7-h4在黑素瘤中的表达及其临床意义

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临床皮肤科杂志 2022年第2期51卷 77-81页

作者：周来来张汝芝程贵苏州大学附属第三医院皮肤科江苏常州213003 苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心江苏常州213003

目的:探讨黑素瘤患者血清外泌体中b7-h4的表达及其临床意义。方法:采用超速离心法提取患者血清内的外泌体,采用透射电镜观察外泌体超微结构,并用Western blot法检测外泌体中b7-h4蛋白的表达。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测60例黑素... 详细信息

目的:探讨黑素瘤患者血清外泌体中b7-h4的表达及其临床意义。方法:采用超速离心法提取患者血清内的外泌体,采用透射电镜观察外泌体超微结构,并用Western blot法检测外泌体中b7-h4蛋白的表达。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测60例黑素瘤患者和60例健康体检者血清来源的外泌体内b7-h4的表达水平,并探讨临床病理指标和预后的关系。结果:黑素瘤患者血清来源的外泌体中b7-h4的表达水平较健康对照组明显升高,差异有统计学意义(Pb7-h4高表达组中breslow厚度>4 mm、有溃疡、Ⅲ~Ⅳ期及核分裂象≥5个/mm;患者例数显著高于低表达组(Pb7-h4高表达组患者生存时间较低表达组短,差异有统计学意义(Pb7-h4表达是黑素瘤患者的独立预后因子(Pb7-h4表达升高与黑素瘤的预后不良有关。测定血清外泌体内b7-h4的水平可能有助于黑素瘤的临床预后判断。

关键词：外泌体 b7-h4 黑素瘤预后

免疫检查点分子PD-L1和b7-h4在卵巢癌组织中的表达及意义

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现代免疫学 2023年第1期43卷 36-41页

作者：凌佳怡谢芳杜婷黄沁张营胡鑫童瞿秋霞苏州大学医学部苏州215006 苏州大学附属第一医院临床免疫学实验室苏州215006 苏州大学病理学教研室苏州215006 苏州大学附属第一医院妇产科苏州215006 苏州大学附属第二医院妇产科苏州215004

为探讨免疫检查点分子PD-L1和b7-h4在卵巢癌组织中的表达特点以及临床意义,收集46例手术切除的卵巢癌组织,通过免疫组化染色技术检测PD-L1和b7-h4分子的表达水平和定位,采用χ2检验分析其与样本临床参数之间的关系,Spearman法分析相关... 详细信息

为探讨免疫检查点分子PD-L1和b7-h4在卵巢癌组织中的表达特点以及临床意义,收集46例手术切除的卵巢癌组织,通过免疫组化染色技术检测PD-L1和b7-h4分子的表达水平和定位,采用χ2检验分析其与样本临床参数之间的关系,Spearman法分析相关性。结果显示,PD-L1和b7-h4分子在卵巢癌组织内中/高表达所占百分比分别为67.4%(31/46)和82.6%(38/46),二者同时中/高表达率为58.7%(27/46)。膜PD-L1中/高表达与病理类型、分化程度有关(Pb7-h4中/高表达与病理类型有关(Pb7-h4的表达有相关性(r=0.553,Pb7-h4的表达有相关性(r=0.429,Pb7-h4分子主要集中在卵巢透明细胞癌亚组,PD-L1与b7-h4在胞膜和胞浆的表达具有相关性,在免疫治疗卵巢癌时需考虑PD-L1和b7-h4抗体联合靶向干预。

关键词：卵巢肿瘤免疫检查点程序性死亡受体配体1 b7-h4

b7-h3和b7-h4基因多态性及其甲基化水平与强直性脊柱炎易感性的关联性研究

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B7-H3和B7-H4基因多态性及其甲基化水平与强直性脊柱炎易感性的关...

作者：杨会安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:1.探讨b7-h3和b7-h4基因单核苷酸多态性与强直性脊柱炎易感性之间的关联性;2.检测AS患者中b7-h3基因启动子区域甲基化水平及其m RNA表达水平,在表观遗传学水平上探讨b7-h3基因在AS发病机制中的作用。方法:1.本次研究分为两个部分,... 详细信息

目的:1.探讨b7-h3和b7-h4基因单核苷酸多态性与强直性脊柱炎易感性之间的关联性;2.检测AS患者中b7-h3基因启动子区域甲基化水平及其m RNA表达水平,在表观遗传学水平上探讨b7-h3基因在AS发病机制中的作用。方法:1.本次研究分为两个部分,第一部分,本研究在安徽医科大学第一附属医院风湿免疫科收集了649例确诊AS患者,同时在安徽医科大学第一附属医院体检中心和合肥市中心血站收取性别和年龄相匹配的健康对照组646名。研究选取了b7-h3和b7-h4基因的5个SNPs(包括rs3816661,rs3825859,rs6428679,rs3738414 and rs10801935)。采用了SNPscan基因分型技术得到候选基因的基因型。分别对基因型分布,等位基因频率,不同遗传模型进行了分析,比较AS患者组和健康对照组之间的差异。随后又分别根据年龄、性别、hLA-b27状态、bASDAI得分、bASFI得分和ASDAS得分对基因型分布进行了分层分析;2.第二部分,本研究收取了84例AS患者和性别与年龄相匹配的健康对照83例。采用亚硫酸氢盐测序法检测了AS患者和健康对照组中b7-h3基因启动子区域甲基化水平。在已收取的患者中随机抽取20例和相应的健康对照,采用q RT-PCR方法检测了b7-h3基因的m RNA表达水平。分别分析了b7-h3基因不同Cp G位点和Cp G区域甲基化水平在AS患者组和健康对照组中的差异。后根据性别和hLA-b27状态对甲基化水平进行了分层分析;3.所有的统计分析均使用SPSS 23.0软件。符合正态分布的连续性数据用均数±标准差((?)±SD)表示,组间比较使用独立样本t检验;偏态分布数据使用中位数和四分位数间距(M(P,P))表示,组间比较采用Mann-Whitney U检验。定性资料的分布特征用绝对数和百分比表示。采用Pearson卡方检验或Fisher精确检验比较病例组和对照组的基因型分布、等位基因频率和遗传模型。计算比值比(Odds ratio,ORs)和相应的95%可信区间(95%confidence interval,CIs)来评估风险。使用卡方检验对对照组的多态性进行独立的hardy-Weinberg平衡(hardy-Weinberg equilibrium,hWE)检验。采用haploview 4.2软件进行连锁不平衡(LD)和单倍型分析。使用Graph Pad Prism7.0绘制图形。多重比较下,采用bonferroni校正法对P值进行校正,双侧P值小于0.05为有统计学意义。结果:1.基本情况:第一部分:研究共纳入了649名AS患者,包括男性患者518名,女性患者131名,和646名健康对照,包括男性526名,女性120名。病例和对照组的平均年龄分别为29.30±9.58岁和28.61岁±7.85岁,病例组和对照组在性别(P=0.482)和年龄(p=0.156)构成上差异均无统计学意义。第二部分:研究纳入病例组84例,对照组83例。包含男性患者64例,女性患者20例,男性对照63例,女性对照20例。病例组和对照组之间的年龄(t=0.157,P=0.876)、性别构成(X=0.002,P=0.965)差异均无统计学意义;2.所有SNPs在病例组和对照组中的基因型和等位基因频率分布差异均无统计学意义(P均>0.05)。b7-h4 rs10801935位点CA+CC显性基因型,与野生型AA基因型相比,AS发病风险显著升高(P=0.013)。与野生型GG基因型相比,b7-h4 rs37388414位点的GA和GA+AA基因型增加了AS的发病风险,但是在bonferroni校正之后,差异无统计学意义(GAvs.GG:P=0.033,GA+AA vs.GG:P=0.045)。SNPs均与临床特征无显著性关联。分层分析显示,在男性患者和ASDAS≥1.3的患者中,与野生型GG基因型相比,b7-h4 rs3738414位点GA和GA+AA基因型与AS风险增加显著相关。经过bonferroni校正后,该相关性在男性患者中仍然具有统计学意义(GA vs.GG:P=0.005,GA+AA vs.GG:P=0.008),但是在ASDAS≥1.3的患者中差异无统计学意义(GA vs.GG:P=0.028;GA+AA vs.GG:P=0.034)。b7-h4 rs3738414 A等位基因(A vs.G)增加了男性亚组AS的发生风险,而bonferroni校正后的P值无统计学意义(P=0.027)。单倍型分析表明,TAG单倍型与AS风险显著增加相关(P=0.026,OR=1.190,95%CI=1.020-1.389);3.甲基化分析结果显示在AS患者组和健康对照组之间存在18个位点甲基化差异性表达;AS患者中Cp G-1的甲基化水平的中位数是2.81%,健康对照组中的甲基化水平的中位数是3

关键词：强直性脊柱炎 b7-h3 b7-h4 单核苷酸多态性甲基化易感性

b7-h4在乳腺癌进展中的作用及其下游分子研究

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B7-H4在乳腺癌进展中的作用及其下游分子研究

作者：陈昊川中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

b7-h4与b7-h1/PD-L1、ICOS-L/b7-h2等同属于b7蛋白家族。作为免疫共抑制分子,b7-h4在发现之初主要被学者们认为通过与T细胞上的相应受体结合来抑制T细胞免疫从而促使肿瘤免疫逃逸,如今越来越多的研究表明b7-h4的异常表达在肿瘤细胞恶性... 详细信息

b7-h4与b7-h1/PD-L1、ICOS-L/b7-h2等同属于b7蛋白家族。作为免疫共抑制分子,b7-h4在发现之初主要被学者们认为通过与T细胞上的相应受体结合来抑制T细胞免疫从而促使肿瘤免疫逃逸,如今越来越多的研究表明b7-h4的异常表达在肿瘤细胞恶性生物学行为中同样扮演着重要的角色。PRDX3(PeroxiredoxinⅢ)是过氧化物酶家族成员,PRDX3主要参与调节由细胞因子诱导产生的细胞内过氧化氢水平。研究表明PRDX3在乳腺癌、肝细胞癌、结直肠癌、肺癌和鼻咽癌等高表达,保护增殖的肿瘤细胞免于凋亡和化学破坏。因此,其在恶性肿瘤进展中起到的作用开始得到许多学者的密切关注。E2F转录因子家族由8个成员构成(E2F1、E2F2、E2F3、E2F4、E2F5、E2F6、E2F7、E2F8),对调控细胞周期至关重要。E2F家族相关成员的异常表达与许多肿瘤预后不良有关,其中E2F2被报道在浸润性或非浸润性导管性乳腺癌和浸润性小叶性乳腺癌中过表达,并造成患者预后不良,提示其可能在乳腺癌进展中发挥重要作用。本课题通过转录组测序发现干涉乳腺癌细胞b7-h4的表达显著下调了PRDX3和E2F2 m RNA表达水平,然而b7-h4在乳腺癌进展中的作用以及其可能下游分子PRDX3和E2F2在其中扮演的角色仍有待探究。目的:本研究通过特异性靶向b7-h4的siRNA干涉乳腺癌细胞系中b7-h4的表达,探究干涉乳腺癌细胞b7-h4的表达对细胞增殖、周期分布、细胞总凋亡率和细胞内ROS水平的影响;在m RNA和蛋白水平上分析验证b7-h4与PRDX3或E2F2之间表达相关性;同时分别利用特异性靶向PRDX3和E2F2的siRNA干涉乳腺癌细胞系中PRDX3和E2F2的表达,探究干涉乳腺癌细胞PRDX3或E2F2的表达对细胞增殖、周期分布的影响以及干涉乳腺癌细胞PRDX3对其细胞内ROS水平的影响。构建PRDX3和E2F2过表达载体,在干涉b7-h4表达的乳腺癌细胞系中过表达PRDX3,探究PRDX3在干涉b7-h4引起的乳腺癌细胞增殖、周期与ROS变化中的作用;同时,在干涉b7-h4表达的乳腺癌细胞系中过表达E2F2,探究E2F2在干涉b7-h4引起的乳腺癌细胞增殖与周期变化中的作用。方法:第一部分:干涉b7-h4表达对乳腺癌细胞表型的影响及下游分子探究(1)通过RT-PCR实验检测b7-h4在本实验室保存的乳腺癌细胞系内的mRNA表达水平;(2)通过Wb实验观察b7-h4在各乳腺癌细胞系内的蛋白表达水平;(3)合成特异性靶向b7-h4的siRNA(sib7-h4),利用脂质体Lipofectamine2000将其转染至乳腺癌细胞系内,通过RT-q PCR和Wb实验鉴定干涉效率;(4)利用流式细胞术探究干涉乳腺癌细胞b7-h4的表达对其细胞周期、ROS水平和凋亡的影响;(5)利用细胞增殖实验探究干涉乳腺癌细胞b7-h4表达对其增殖的影响;(6)利用RT-q PCR和Wb实验检测干涉b7-h4后PRDX3和E2F2的m RNA与蛋白水平表达差异。第二部分:PRDX3在干涉b7-h4表达引起的乳腺癌细胞增殖、周期与ROS变化中的作用研究(1)通过特异性靶向PRDX3的siRNA(siPRDX3)干涉乳腺癌细胞系PRDX3的表达后,利用细胞增殖实验检测干涉PRDX3对乳腺癌细胞增殖能力的影响;(2)取PRDX3干涉细胞及相应对照细胞,用流式细胞术探究干涉乳腺癌细胞PRDX3的表达对其ROS水平和细胞周期的影响;(3)设计PRDX3基因扩增引物,通过PCR扩增合成,以空白载体作为阴性对照,将其插入到pc DNA3.1(+)载体上,形成PRDX3过表达载体pc DNA3.1-PRDX3,过表达载体经测序无误后用于后续实验;(4)参照siRNA和质粒共转染步骤,使用脂质体Lipofectamine2000将无关干涉序列(siNC)和pc DNA3.1(+)空载体共转染至乳腺癌细胞系内,命名为对照组(MCF-7 or T47D/siNC+pc DNA3.1 vector),将sib7-h4和pc DNA3.1(+)空载体共转染至乳腺癌细胞系内,命名为干涉组(MCF-7 or T47D/sib7-h4+pc DNA3.1 vector),将sib7-h4和PRDX3过表达载体pc DNA3.1-PRDX3共转染至乳腺癌细胞系内,命名为PRDX3回复组(MCF-7 or T47D/sib7-h4+pc DNA3.1-PRDX3),提取上述三组细胞的总RNA和蛋白,分别检测PRDX3和b7-h4在各组细胞内的表达变化;(5)利用流式细胞术比较各组细胞ROS水平和细胞周期分布差异;(6)通过细胞增殖实验比较各组细胞的细胞增殖能力差异。第三部分:E2F2在干涉b7-h4表达引起的乳腺癌细胞增殖与周期变化中的作用研究(1)通过特异性靶向E2F2的siRNA(si

关键词： b7-h4 PRDX3 E2F2 乳腺癌 ROS

蛋白酶体降解途径对b7-h4蛋白水平及肿瘤免疫抑制功能调控的研究

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蛋白酶体降解途径对B7-H4蛋白水平及肿瘤免疫抑制功能调控的研究

作者：陆有为苏州大学

学位级别：硕士

b7-h4(又称为b7x、VTCN1或b7S1)属于b7家族的负性协同刺激分子,因其能抑制T细胞的活化而在肿瘤免疫抑制微环境中发挥重要作用,且在许多肿瘤组织中存在特异性高表达,临床上与肿瘤分期、不良预后及生存率存在显著相关性。虽然在许多正常... 详细信息

b7-h4(又称为b7x、VTCN1或b7S1)属于b7家族的负性协同刺激分子,因其能抑制T细胞的活化而在肿瘤免疫抑制微环境中发挥重要作用,且在许多肿瘤组织中存在特异性高表达,临床上与肿瘤分期、不良预后及生存率存在显著相关性。虽然在许多正常组织及肿瘤组织中都可以检测到b7-h4的mRNA,但其蛋白却很难在正常组织中被检测到,说明b7-h4蛋白的表达存在转录后调控机制。因此研究b7-h4的表达调控对于了解b7-h4在肿瘤组织中的表达规律及将b7-h4作为免疫治疗的靶点具有重要的理论参考价值。本团队早期研究发现,相较于EGFR野生型(EGFR Wild Type,EGFR WT)肺癌,EGFR 激活型突变(EGFR-activating mutations,EGFR MT)的肺癌中 b7-h4 特异性高表达;并且转染EGFR MT基因也可上调EGFR WT肺癌细胞株中b7-h4蛋白表达水平。这提示我们,b7-h4的表达可能受EGFR的下游信号通路激活的调控,但是其调控所涉及的具体分子机制目前尚不明确。在本研究中,我们通过蛋白组学法进行研究发现与b7-h4结合的蛋白中有许多泛素化酶分子,因此推测EGFR MT很有可能是通过泛素-蛋白酶体途径在翻译后修饰水平调控着b7-h4的蛋白水平。后续我们通过免疫共沉淀、western blot等方法证实EGFR MT的确可通过降低b7-h4泛素化水平上调其表达量。同时,我们筛选出了可能与b7-h4去泛素化相关的一种去泛素化酶——USP2a,并且初步证实其参与到了 EGFR MT抑制b7-h4泛素化的过程中。本结果为更全面地研究b7-h4的表达调控机制提供了新的理论,并且为临床以b7-h4为靶点开发免疫治疗策略提供了新思路。本论文主要包括以下四部分内容:一、EGFR MT通过泛素化通路影响b7-h4蛋白的稳定性[目的]研究EGFRMT对b7-h4表达调控的机制。[方法](1)使用15μM的bortezomib或MG132处理h23、A549或h1437细胞0、1、2、4、8、12h后检测b7-h4表达水平;(2)使用15μM MG132处理共转染b7-h4-Flag、hA-Ub质粒的hEK293T细胞24h后对b7-h4进行免疫共沉淀,检测总裂解液中b7-h4的表达水平及b7-h4上泛素化水平;(3)hEK293T细胞中转染 EGFRMT(19Del、T790M、L858R)质粒和 b7-h4-Flag 质粒后检测 b7-h4 的表达水平;(4)hEK293T 细胞中共转染 EGFR MT、b7-h4-Flag 和 hA-Ub(hA-Ub-K48、hA-Ub-K63)质粒后对b7-h4进行免疫共沉淀检测其总泛素(K48、K63泛素侧链)水平;(5)使用20μg/L环己亚胺(ChX)处理转染EGFR MT质粒的A549、h23、h1437细胞0、2、4、8、12h后检测b7-h4的表达水平;(6)使用20μg/L环己亚胺(ChX)处理对敲低EGFR的h1975及hCC827细胞0、2、4、8、12h后检测b7-h4的表达水平。[结果]阻断蛋白酶体降解通路后泛素化的b7-h4产生了堆积,且堆积的量与bortezomib或MG132处理的时间呈正比;EGFR MT上调了内、外源性b7-h4的表达水平;EGFR MT显著抑制了 b7-h4上总泛素和K48、K63泛素侧链水平;转染EGFR MT延缓了 b7-h4的降解速度,而敲低则加速了 b7-h4的降解。[结论]EGFR MT可通过泛素化通路影响b7-h4蛋白的稳定性,导致b7-h4蛋白水平上调。二、通过蛋白组学鉴定出b7-h4的去泛素化酶[目的]寻找与b7-h4上泛素化相关的蛋白。[方法]蛋白组学实验鉴定b7-h4免疫共沉淀的产物。[结果]蛋白组学实验鉴定出11种可能参与b7-h4的去泛素化进程的相关蛋白,其中包含了 7位泛素特异性蛋白酶(USP)家族的成员。[结论]USPs可能参与调控b7-h4的泛素化进程。三、USP2a通过调控b7-h4的泛素化水平影响其稳定性[目的]筛选出特异调控b7-h4泛素化水平的去泛素化酶并验证其功能。[方法](1)hEK293T细胞中共转染七种USP家族的成员(USPs)(USP2a、USP7、USP9X、USP10、USP14、USP24、USP47)和 b7-h4-Flag 质粒后检测 b7-h4的表达水平;(2)hEK293T细胞中共转染七种USPs、b7-h4-Flag和hA-Ub(hA-Ub-K48、hA-Ub-K63)质粒后对b7-h4进行免疫共沉淀,检测其总泛素化(K48、K63 泛素侧链)水平;(3)hEK293T 细胞共转染 b7-h4-Flag 和 hA-Ub(hA-Ub-K48、hA-Ub-K63)后使用siRNA敲低USP2a,对b7-h4进行免疫共沉淀检测其总泛素化(K48、K63 泛素侧

关键词： b7-h4 EGFRMT 泛素 USP2a

OTUD4去泛素化修饰b7-h4调控乳腺癌免疫微环境的机制研究

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OTUD4去泛素化修饰B7-H4调控乳腺癌免疫微环境的机制研究

作者：刁晗济宁医学院

学位级别：硕士

目的:阐明OTUD4去泛素化修饰b7-h4机制的研究,以及该机制对乳腺癌肿瘤微环境的影响。方法:本课题通过免疫组化的方法定位b7-h4在乳腺癌细胞内的表达,并统计b7-h4表达水平和乳腺癌患者预后的相关性;通过Western blot和RT-q PCR检测b7-h4... 详细信息

目的:阐明OTUD4去泛素化修饰b7-h4机制的研究,以及该机制对乳腺癌肿瘤微环境的影响。方法:本课题通过免疫组化的方法定位b7-h4在乳腺癌细胞内的表达,并统计b7-h4表达水平和乳腺癌患者预后的相关性;通过Western blot和RT-q PCR检测b7-h4在常见乳腺癌细胞系中蛋白水平和m RNA水平的表达是否一致。通过蛋白免疫共沉淀-质谱分析法筛选出与b7-h4存在相互作用的去泛素化修饰酶OTUD4。研究表明,OTUD4和b7-h4之间可能存在相互作用,这可以通过进行外源性和内源性Co-IP实验来证实。通过慢病毒稳定构建OTUD4过表达和OTUD4敲低的乳腺癌细胞系,Western blot和RT-q PCR技术检测OTUD4过表达和OTUD4敲低后的乳腺癌细胞系b7-h4蛋白和m RNA表达水平的变化。蛋白免疫沉淀-泛素化实验进一步探究OTUD4对b7-h4泛素化修饰的影响,蛋白半衰期实验探究OTUD4过表达和OTUD4低表达对于b7-h4蛋白半衰期的调控。克隆形成实验、细胞增殖实验和Transwell实验证明OTUD4和b7-h4对乳腺癌细胞本身生长增殖和转移能力的影响。采用多色荧光免疫分析b7-h4表达水平与肿瘤微环境中CD8+T细胞浸润之间的关系。结果:b7-h4在乳腺癌中表达上调,且与乳腺癌患者预后呈负相关;b7-h4在乳腺癌细胞系中蛋白水平和RNA水平表达不一致,且蛋白水平明显受去泛素化酶抑制剂影响;b7-h4与OTUD4存在相互作用且OTUD4正向调控b7-h4;OTUD4增加b7-h4蛋白水平,但不影响m RNA水平的变化;OTUD4通过去泛素化修饰b7-h4;改变OTUD4和b7-h4的表达水平不影响乳腺癌细胞系本身的生长和转移能力;在乳腺癌组织中OTUD4和b7-h4表达呈正相关,且和CD8+T细胞浸润呈负相关。结论:b7-h4在乳腺癌组织中表达高于正常组织,且b7-h4高表达的乳腺癌患者预后更差。OTUD4可以通过去泛素化正向调控b7-h4表达。OTUD4和b7-h4的表达通过影响CD8+T细胞浸润进而影响乳腺癌的转移和预后。

关键词： OTUD4 b7-h4 泛素化乳腺癌

乳腺浸润性导管癌超声及超声造影征象与b7-h4的关系研究

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乳腺浸润性导管癌超声及超声造影征象与B7-H4的关系研究

作者：张竞月新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:研究旨在分析浸润性导管癌(Invasive Ductal Carcinoma,IDC)超声及超声造影特征与b7同源体4(b7 homolog4,b7-h4)表达的关系及相关性。方法:本研究从2016年6月-2021年6月在新疆医科大学第一附属医院进行手术且经临床病理确诊为IDC的... 详细信息

目的:研究旨在分析浸润性导管癌(Invasive Ductal Carcinoma,IDC)超声及超声造影特征与b7同源体4(b7 homolog4,b7-h4)表达的关系及相关性。方法:本研究从2016年6月-2021年6月在新疆医科大学第一附属医院进行手术且经临床病理确诊为IDC的136例病人中,通过对b7-h4表达以及136例患者的超声及超声造影资料进行研究,探讨病灶超声及超声造影特征与b7-h4表达水平的关系及相关性。结果:免疫组化检测b7-h4在IDC细胞的阳性表达128张,其中高表达85张,低表达43张。IDC不同分子亚型与b7-h4高表达之间差异无统计学意义。不同的b7-h4表达分组中,二维IDC超声中纵横比≥1、形态不规则、周围组织回声中断、后方回声衰减及淋巴结转移等特征与b7-h4表达组之间差异具有统计学意义(Pb7-h4表达组之间差异具有统计学意义(Pb7-h4的高表达呈正相关(Pb7-h4呈高表达。结论:IDC超声及超声造影表现与分子标志物b7-h4的表达具有一定相关性,能够为乳腺癌的诊治提供新思路、方法以及客观影像学依据。IDC超声及超声造影特征可以预测IDC中分子标志物b7-h4的高表达,而b7-h4的高表达往往提示IDC较高的恶性程度及较强的侵袭性。

关键词：乳腺浸润性导管癌 b7-h4 超声检查造影

b7-h4在EGFR突变体肺癌细胞中的表达调控研究

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B7-H4在EGFR突变体肺癌细胞中的表达调控研究

作者：曹秋逸苏州大学

学位级别：硕士

肺癌是最常见的癌症类型,肺癌病例的85%为非小细胞肺癌(NSCLC)。非小细胞肺癌中一个极其重要的驱动突变基因是表皮生长因子受体(EGFR),大约三分之一的肺腺癌中都发现了其突变。它能借助信号转导使细胞生长失控和恶性化,因此临床治疗肺... 详细信息

肺癌是最常见的癌症类型,肺癌病例的85%为非小细胞肺癌(NSCLC)。非小细胞肺癌中一个极其重要的驱动突变基因是表皮生长因子受体(EGFR),大约三分之一的肺腺癌中都发现了其突变。它能借助信号转导使细胞生长失控和恶性化,因此临床治疗肺腺癌常选用靶向阻断EGFR突变体的信号通路来作为重要策略之一。b7-h4(别称:b7-S1,b7x或VTCN1)是近年来发现的b7家族负性共刺激分子。b7-h4在人类肿瘤中广泛表达,如肾细胞癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌等都存在b7-h4的过表达。研究表明,b7-h4是T细胞免疫的强弱化子,它通过与T细胞表面的特异性受体结合,可以限制T细胞的免疫反应。b7-h4的异常高表达在肿瘤组织中广泛存在,使肿瘤细胞借此来逃避机体免疫系统的攻击,预示着该分子将成为肿瘤诊断和预后判断的分子生物标志物,同时也是一个针对肿瘤、炎症、自身免疫性疾病和器官移植的潜在的有效的治疗靶点。本论文通过收集数据库和部分临床肺腺癌样本,根据驱动突变背景,进行统计分析,之后又进行了细胞水平实验,研究EGFR突变体与b7-h4和PD-L1蛋白表达之间的关系。首先通过对TCGA等肺腺癌临床数据库中分子mRNA表达水平的统计,研究b7-h4和PD-L1的表达与EGFR驱动突变的相关性;再收集临床肺癌组织进行免疫组化染色,验证数据库的分析结果;最后选取天然表达EGFR野生型或突变体的肺腺癌细胞为研究对象,通过western blot等方法研究比较b7-h4和PD-L1表达在EGFR突变体中受到的调控作用。整个研究工作从临床样本出发,通过细胞水平的实验阐释其调控机制。本论文主要包括以下内容:一、肺腺癌数据库分析各免疫检查点分子与驱动突变的相关性[目的]通过对肺腺癌的基因芯片数据库和TCGA肺腺癌的RNA-seq数据分析,研究不同驱动突变的肺腺癌中免疫检查点分子的表达,以及肿瘤浸润CD8+T细胞的数量和功能之间的差异。[方法]收集数据库中肺腺癌的15个免疫检查点分子以及CD8A,GZMb及PRF1的mRNA表达数据,根据驱动突变背景,进行统计分析。[结果]免疫检查点分子CD8A,GZMb及PRF1在EGFR突变体肺腺癌中的mRNA表达显著低于癌旁正常组织。PD-L1在EGFR突变型中的mRNA表达显著低于野生型,而b7-h4和hhLA2在EGFR突变型中的mRNA表达显著高于野生型。此外,b7-h4与GZMb表达存在负相关,PD-L1与CD8表达存在正相关。[结论]在EGFR突变型肺腺癌中,PD-L1的mRNA表达下调,而b7-h4的mRNA表达上调,并且b7-h4和hhLA2的表达可能与CD8+T细胞的功能抑制有关。二、免疫组化研究肺腺癌样本中b7-h4、PD-L1和hhLA2三个免疫检查点分子的表达与EGFR驱动突变的相关性[目的]通过免疫组化实验,验证这三个免疫检查点分子的蛋白表达水平是否与数据库分析发现的mRNA表达水平一致。[方法]收集215例临床肺腺癌样本(127例为EGFR突变型,88例为野生型),免疫组化染色分析b7-h4,PD-L1,hhLA2,CD8,GZMb的表达。[结果]免疫组化染色发现,PD-L1在EGFR突变型中的蛋白表达显著低于野生型,而b7-h4在EGFR突变型中的蛋白表达显著高于野生型,hhLA2蛋白表达在两组间无显著差异。此外,b7-h4与GZMb表达存在负相关,PD-L1与CD8表达存在正相关。[结论]在EGFR突变型肺腺癌中,PD-L1的蛋白表达下调,b7-h4的蛋白表达上调,并且b7-h4的表达与CD8+T细胞功能抑制有关。三、验证研究b7-h4与PD-L1在EGFR肺癌细胞中的蛋白表达水平及相关信号通路[目的]细胞水平验证研究肺癌细胞中的EGFR突变体与b7-h4和PD-L1蛋白表达之间的关系,研究EGFR下游信号通路对b7-h4和PD-L1表达水平的调控作用。[方法]选用几株天然表达突变型EGFR和野生型EGFR的肺癌细胞为研究对象,通过western blot等方法检测验证EGFR突变与b7-h4和PD-L1蛋白表达之间的关系,以及EGFR相关信号通路的调控作用。[结果]b7-h4在EGFR突变型中的蛋白表达水平显著高于EGFR野生型,而PD-L1的表达则相反,并且肺癌细胞中的EGFR突变体可上调b7-h4,下调PD-L1的表达。EGFR信号通路下游p-ERK1/2信号分子的表达与b7-h4有明显的正相关性,而p-Akt信号分子的表达与PD-L1有正相关性。[结论]肺癌细胞株实验验证了数据库分析和免疫组化结果,即EGFR突变体可以上调b7-h4,下调PD-L1,EGFR下游的MEK/ERK通路的激活可上调b7-h4,而PI3K/Akt通路的激活可上调PD-L1。由于这两条信号通路存在交互抑制,EGFR突变体更倾向于激活MEK/ERK通路,因此上调b7-h4。

关键词： b7-h4 PD-L1 EGFR突变表达调控信号通路

替莫唑胺调控胶质瘤细胞中b7-h4表达的实验研究

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替莫唑胺调控胶质瘤细胞中B7-H4表达的实验研究

作者：李姿安郑州大学

学位级别：硕士

研究背景高级别神经胶质瘤,尤其是胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GbM)是最常见的恶性脑肿瘤。因其侵袭性强,难以做到手术全切,故复发率较高。在GbM术后辅助治疗中,替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)是GbM常用的一线化疗药物,其对免疫检查点的影... 详细信息

研究背景高级别神经胶质瘤,尤其是胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GbM)是最常见的恶性脑肿瘤。因其侵袭性强,难以做到手术全切,故复发率较高。在GbM术后辅助治疗中,替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)是GbM常用的一线化疗药物,其对免疫检查点的影响已有一定研究,但十分有限。鉴于免疫检查点抑制剂单一用药对于GbM的治疗效果有限,更好地了解替莫唑胺对免疫环境的影响,从而联合替莫唑胺与免疫检查点抑制剂以达到更好的协同治疗作用,对于扩展免疫治疗的用途,指导临床用药有很大的意义。b7-h4(也称为b7x或b7-S1)与PD-L1(又称b7-h1)一样,都是T细胞共刺激和共抑制家族-b7家族的成员。从功能上讲,b7-h4可以对T细胞的活化和增殖产生抑制效应。b7-h4的高表达在人类多种癌症组织中被检测到,并且通常与不良预后有关。关于TMZ和PD-L1药物的协同作用有一定的报道,其效果已被验证,但这远远不够。复旦大学附属华山医院周良辅团队近期报道发现,b7-h4在GbM中是一个重要的免疫检查点,并且在表达上b7-h4和PD-L1是相互独立的两个免疫检查点。我们推测,TMZ对免疫检查点的调控不仅局限于PD-L1分子上,还可能作用于其他免疫检查点如b7-h4。如何提高免疫治疗的敏感性是一大难题。TMZ和抗PD-L1药物结合治疗方案适用于高PD-L1表达者,而高b7-h4表达者可能需要TMZ及抗b7-h4药物的联合治疗,以提高不同亚型的治疗敏感性。TMZ是否可对b7-h4进行调控,以及TMZ与抗b7-h4的结合是否可对高表达b7-h4的GbM亚型群体疗效更好,甚至优于TMZ和PD-L1抗体结合的疗效,这是本论文在临床前研究中所关注的科学问题。目的本实验目的是进行替莫唑胺调控胶质瘤细胞中b7-h4表达的研究,利用GbM细胞模型在体外和体内探究TMZ对b7-h4的表达调控以及TMZ与b7-h4抗体联用对GbM原位移植瘤的抑制作用有望指导b7-h4阳性细胞亚型的治疗,为潜在的临床试验提供理论基础。方法1.体外培养GL261细胞和T98G细胞,将其分为对照组、TMZ200μmol/L(μM)组、TMZ400μM组及TMZ800μM组,通过流式细胞术(flow cytometry,FACS),蛋白质免疫印迹方法(Western blot,Wb)和实时荧光定量PCR(Real-time q PCR,RT-q PCR)检测PD-L1,b7-h4的表达。2.为研究TMZ对b7-h4的调控机制,将GL261细胞、T98G细胞分为对照组,TMZ200μM组、TMZ400μM组、JAK抑制剂(JAKi)组、JAKi+TMZ200μM组、JAKi+TMZ400μM组,通过Wb方法测定b7-h4,信号转导和转录激活因子3(STAT3),磷酸化的信号转导和转录激活因子3(p-STAT3)的表达。3.生信分析部分通过STRING网站研究b7-h4相关蛋白,GEPIA2网站查找b7-h4相关基因,并通过Metascape网站进行基因富集分析,研究b7-h4可能相关的信号通路。4.构建GL261-LUC细胞及C57bL/6小鼠原位脑胶质瘤模型,为开展体内实验建立平台。5.采用IbM Statistics SPSS 21.0统计软件,两组计量资料之间比较采用独立样本t检验,Ph Pad软件绘制统计图。结果1.TMZ促进小鼠及人胶质瘤细胞系PD-L1,b7-h4表达。通过流式细胞术和蛋白质免疫印迹方法检测蛋白表达,发现与对照组相比,TMZ组可明显升高GL261细胞膜表面PD-L1(Pb7-h4(Pb7-h4(P400μM范围内,随着TMZ浓度升高,PD-L1和b7-h4表达逐渐升高。实时荧光定量PCR结果显示TMZ对GL261细胞系b7-h4表达的调控发生在转录水平。2.TMZ对b7-h4的调控可能不是通过STAT3起作用。TMZ不能上调GL261和T98G细胞中p-STAT3水平,推测TMZ对b7-h4表达的调节并不是通过JAK-STAT3通路发挥作用的。3.通过生信分析,找到了b7-h4潜在的调控机制。从STRING网站获得了已通过实验确定的b7-h4的前十名结合蛋白,可以发现b7-h4与免疫反应关系密切。GEPIA2探究与b7-h4最密切相关的100个基因。将前100个基因上传到Metascape网站得到富集分析的结果,找到了b7-h4可能潜在的调控机制。4.成功构建了GL261-LUC细胞及C57bL/6小鼠原位脑胶质瘤模型。将Luciferase慢病毒感染到GL261细胞内,成功筛选并构建了GL261-LUC细胞。随后用GL261-LUC注射到C5

关键词：替莫唑胺 b7超家族 PD-L1 b7-h4 富集分析肿瘤模型构建