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抗人B7-H4嵌合抗体的制备及鉴定

中国免疫学杂志 2022年第22期38卷 2763-2769页

作者：范振军张文婷张丽张俊爱赵祖国徐军发(指导) 广东医科大学医学技术学院检验医学研究所东莞523808 广东医科大学基础医学院微生物学和免疫学教研室东莞523808

目的:制备抗人B7-H4嵌合单克隆抗体(mAb),并对其生物学功能进行初步鉴定。方法:从杂交瘤细胞株扩增抗人B7-H4可变区基因序列;构建表达人鼠嵌合抗体的表达载体,并转染ChO-K1细胞构建稳定表达抗B7-H4嵌合抗体的ChO-K1细胞株;SDS-PAGE检测... 详细信息

目的:制备抗人B7-H4嵌合单克隆抗体(mAb),并对其生物学功能进行初步鉴定。方法:从杂交瘤细胞株扩增抗人B7-H4可变区基因序列;构建表达人鼠嵌合抗体的表达载体,并转染ChO-K1细胞构建稳定表达抗B7-H4嵌合抗体的ChO-K1细胞株;SDS-PAGE检测mAb纯度;ELISA测定mAb效价;SPR测定mAb的亲和力;bCA法检测mAb浓度;CCK-8法检测T细胞增殖情况;ELISA和Western blot确定mAb结合表位范围;使用Discovery Studio软件对单抗表位进行分析。结果:从杂交瘤细胞成功扩增出抗体可变区基因,筛选出稳定表达嵌合抗体的ChO-K1细胞株;细胞培养上清中mAb浓度为1.82 mg/ml,ELISA有效效价为1.97×10^(5)左右,亲和力为3.72×10^(-9)kD;CCK-8结果表明嵌合单抗可以阻断B7-H4-Fc分子对T细胞增殖的抑制作用;表位分析结果表明嵌合mAb主要以氢键和疏水作用与B7-H4 IgC域结合。结论:本研究成功制备了抗B7-H4的人鼠嵌合单抗,可在体外有效地阻断B7-H4-Fc对T细胞增殖抑制作用并为B7-H4抗体药物研发提供了前期基础。

关键词： B7-H4 嵌合抗体抗体表位 T细胞增殖

干扰B7-H4表达通过下调E2F家族相关转录因子抑制乳腺癌细胞的增殖

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中国肿瘤生物治疗杂志 2022年第3期29卷 195-201页

作者：陈昊川郜赵伟龙敏刘冲董轲张惠中空军军医大学第二附属医院检验科陕西西安710038

目的:探讨干扰B7-H4表达对乳腺癌细胞增殖、凋亡、周期以及相关下游分子表达的影响。方法:利用脂质体转染技术分别将特异性靶向B7-H4的siRNA(siB7-H4)及其阴性对照(siNC)转染至对数生长期的乳腺癌T47D和MCF-7细胞,分别命名为T47D-sib7-h... 详细信息

目的:探讨干扰B7-H4表达对乳腺癌细胞增殖、凋亡、周期以及相关下游分子表达的影响。方法:利用脂质体转染技术分别将特异性靶向B7-H4的siRNA(siB7-H4)及其阴性对照(siNC)转染至对数生长期的乳腺癌T47D和MCF-7细胞,分别命名为T47D-siB7-H4、T47D-siNC、MCF-7-siB7-H4和MCF-7-siNC组。用qPCR法和Wb法验证siRNA干扰效果及其对细胞周期分子cyclin D1表达的影响,CCK-8法和FCM分别检测干扰B7-H4表达对T47D和MCF-7细胞增殖、周期和凋亡的影响,qPCR法检测B7-H4干扰对E2F家族相关转录因子表达的影响。结果:成功构建干扰B7-H4表达的乳腺癌T47D和MCF-7细胞。与T47D-siNC和MCF-7-siNC组相比,T47D-siB7-H4和MCF-7-siB7-H4组细胞中B7-H4 mRNA和蛋白表达水平均显著降低、细胞增殖能力显著降低(均P0.05)。与T47D-siNC相比,干扰B7-H4后T47D细胞中E2F1、E2F2、E2F7和E2F8 mRNA水平有不同程度的降低(均P7-siNC相比,干扰B7-H4后MCF-7细胞中E2F1、E2F2、E2F3、E2F7和E2F8 mRNA水平均有不同程度的降低(PB7-H4表达可下调cyclin D1和E2F家族相关转录因子的表达,导致细胞周期阻滞并抑制细胞增殖。

关键词：乳腺癌 B7-H4 E2F家族 T47D细胞 MCF-7细胞增殖细胞周期

CXC趋化因子受体7和B7-H4在甲状腺癌组织的表达及其临床意义

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中华实验外科杂志 2023年第1期40卷 134-137页

作者：黎思毅覃文懿郑昌蔚王衡广东医科大学附属医院血管甲状腺乳腺外科湛江524001 广东医科大学附属医院病理科湛江524001

目的探讨CXC趋化因子受体7(CXCR7)蛋白和B7-H4蛋白在甲状腺癌组织中的表达,以及两者与甲状腺癌病理特征的关系及临床意义。方法收集2017年1月至2022年9月广东医科大学附属医院病理确诊的131例甲状腺肿瘤患者的组织标本,其中33例甲状腺... 详细信息

目的探讨CXC趋化因子受体7(CXCR7)蛋白和B7-H4蛋白在甲状腺癌组织中的表达,以及两者与甲状腺癌病理特征的关系及临床意义。方法收集2017年1月至2022年9月广东医科大学附属医院病理确诊的131例甲状腺肿瘤患者的组织标本,其中33例甲状腺瘤组织标本、98例甲状腺癌组织标本,同时另选择20例正常甲状腺组织标本为对照组。采用免疫组织化学法检测上述组织中CXCR7蛋白和B7-H4蛋白的表达水平,组间比较采用χ^(2)检验,分析CXCR7蛋白和B7-H4蛋白的表达水平与甲状腺癌临床病理参数的关系。结果正常甲状腺组织、甲状腺瘤组织和甲状腺癌组织中的CXCR7蛋白表达率分别为15.00%(3/20)、42.42%(14/33)和77.55%(76/98),两两之间比较差异有统计学意义(χ^(2)=14.167、29.371、4.299,P7表达水平与甲状腺癌TNM分期、病理类型、颈淋巴结转移明显相关(χ^(2)=8.989、6.144、5.532,P7表达水平与甲状腺癌性别、年龄、组织分化程度、包膜浸润无明显相关(χ^(2)=0.002、0.015、0.492、0.023,P>0.05)。正常甲状腺组织、甲状腺瘤组织和甲状腺癌组织中的B7-H4蛋白阳性表达率分别为20.00%(4/20)、48.49%(16/33)和81.63%(80/98),两两之间比较差异有统计学意义(χ^(2)=13.854、30.761、4.300,PB7-H4表达水平与甲状腺癌TNM分期、病理类型、颈淋巴结转移和包膜浸润明显相关(χ^(2)=9.941、4.986、4.923、6.661,PB7-H4表达水平与甲状腺癌性别、年龄、组织分化程度无明显相关(χ^(2)=0.044、0.008、0.164,P>0.05)。结论CXCR7蛋白和B7-H4蛋白在甲状腺癌组织呈高表达,CXCR7和B7-H4表达水平与甲状腺癌的发展、转移及恶性程度明显相关。

关键词： CXC趋化因子受体7 甲状腺癌 B7-H4 免疫组织化学法

胰腺癌B7-H4与相关血清肿瘤标志物的预后价值研究

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中国免疫学杂志 2022年第2期38卷 201-205,210页

作者：严小甜钱韵(指导) 浙江大学医学院附属第二医院检验科杭州310009

目的:分析胰腺癌患者肿瘤组织B7-H4表达水平与术前血清中癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA)199及CA242等肿瘤标志物表达水平的相关性,同时探讨其在胰腺癌中的临床应用价值。方法:采用抗人B7-H4单克隆抗体免疫组化染色方法测定188例胰腺癌患... 详细信息

目的:分析胰腺癌患者肿瘤组织B7-H4表达水平与术前血清中癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA)199及CA242等肿瘤标志物表达水平的相关性,同时探讨其在胰腺癌中的临床应用价值。方法:采用抗人B7-H4单克隆抗体免疫组化染色方法测定188例胰腺癌患者手术切除组织中B7-H4表达水平。同时利用电化学发光法检测术前血清中CEA、CA199及CA242浓度。结果:胰腺癌患者术前血清CEA水平与胰腺癌原发灶、淋巴结及远端转移分期(TNM)及远端转移相关(P42水平与胰腺癌患者年龄及远端转移相关(PB7-H4表达水平与血清CEA表达存在显著正相关(P0.05)。在胰腺癌患者术后6个月生存的预测分析中,B7-H4染色积分的曲线下面积(AUC)明显高于CEA和CA242(PB7-H4染色积分联合术前血清CA199的AUC明显高于术前血清CA199(PB7-H4 AUC相比无差异。结论:综合检测胰腺癌患者化疗前肿瘤组织B7-H4表达水平及血清肿瘤标志物水平可能有利于协助诊断、预测转移、评价化疗疗效及判断预后。

关键词：胰腺癌 B7-H4 肿瘤标志物预后

系统性红斑狼疮患者血清B7-H4、ICOSL水平变化及与IKKβ/NF-κb通路的关系

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医学动物防制 2023年第7期39卷 634-638页

作者：张扬马洁梁静李茜张裕祥龚楚新疆医科大学第六附属医院检验科乌鲁木齐830002

目的探讨系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)患者血清可溶性共刺激因子b7同源体-4(b7 nomolog 4,B7-H4)、外周血淋巴细胞表面诱导共刺激分子配体(inducible costimulator ligand, ICOSL)的表达水平与核因子Kappab(nuclear factor-κb,NF-κb)通路中Iκb激酶(Iκb-kinase, IKK)β间的关系。方法将2020年4月至2021年12月50例SLE患者纳入研究组,选取同期来某院一般体检的50例健康人作为对照组,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清B7-H4及诱导性共刺激分子配体(inducible costimulator ligand, ICOSL)表达水平,反转录聚合酶链反应(reverse tran-scription PCR,RT-PCR)法检测NF-κb通路中IKKβ mRNA表达水平。组间比较采用t检验,两两变量的相关性采用Pearson分析,绘制受试者操作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析联合B7-H4、ICOSL、IKKβ检测对SLE患者的诊断价值。结果研究组血清可溶性B7-H4、ICOSL表达水平高于对照组,差异有统计学意义(t=-4.281、-31.439,PB7-H4、ICOSL与IKKβ mRNA均存在显著正相关关系(r=0.782、0.766,PB7-H4、ICOSL和IKKβ mRNA高表达,3者呈正相关关系,实时检测B7-H4、ICOSL水平能准确评估疾病发展,对改善患者预后及抑制该病进展有重要意义。

关键词：系统性红斑狼疮诱导性共刺激分子配体 B7-H4 IKKβ/NF-κb通路相关性

抗B7-H4单链抗体库的构建和筛选及抗体特异性鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2016年第9期32卷 1260-1266页

作者：邵峦峦徐超超纪洪帅毛伟平王盈盈刘小綪朱岩岩南京师范大学生命科学学院江苏省分子医学重点实验室江苏省医药超分子材料及应用重点实验室江苏南京210046

目的构建小鼠抗B7-H4胞外区核糖体展示单链抗体(sc Fv)库,并筛选出特异性高的抗体。方法从A549细胞的c DNA中扩增B7-H4胞外区基因,将其插入原核表达载体p ET-28 a(+)中表达,获得B7-H4胞外区重组蛋白后纯化并免疫bALb/c小鼠。从免疫小鼠... 详细信息

目的构建小鼠抗B7-H4胞外区核糖体展示单链抗体(sc Fv)库,并筛选出特异性高的抗体。方法从A549细胞的c DNA中扩增B7-H4胞外区基因,将其插入原核表达载体p ET-28 a(+)中表达,获得B7-H4胞外区重组蛋白后纯化并免疫bALb/c小鼠。从免疫小鼠脾脏中提取总RNA,并利用反转录PCR、重叠延伸PCR(SOE-PCR)等技术扩增出重链可变区(Vh)、轻链可变区(Vκ)、Vh接头(Vh-linker)序列和Vκ接头(Vκ-linker)序列,得到重轻链可变区基因的连接产物Vh/Vκ。Vh/Vκ与p UM19-T载体连接并转化至E.coli Dh5α感受态菌株中,利用菌落PCR技术鉴定并测序。使用TNTT7 Quick for PCR DNA试剂盒对构建出的抗体库进行体外翻译与筛选,采用Western blot法和间接ELISA对得到的抗体进行特异性鉴定。结果经生物公司测序分析,得到序列正确的重链可变区(Vh)、轻链可变区(Vκ)及二者连接产物(Vh/Vκ),大小分别为439 bp、680 bp及1098 bp。经特异性实验分析,从得到的抗体库中筛选出的抗体与B7-H4具有高特异性结合能力。结论成功构建出鼠抗B7-H4胞外区核糖体展示sc Fv库,并筛选出与B7-H4胞外区重组蛋白高特异性结合的目标sc Fv。

关键词： B7-H4 胞外区单链抗体核糖体展示重组蛋白

OTUD4去泛素化修饰B7-H4调控乳腺癌免疫微环境的机制研究

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OTUD4去泛素化修饰B7-H4调控乳腺癌免疫微环境的机制研究

作者：刁晗济宁医学院

学位级别：硕士

目的:阐明OTUD4去泛素化修饰B7-H4机制的研究,以及该机制对乳腺癌肿瘤微环境的影响。方法:本课题通过免疫组化的方法定位B7-H4在乳腺癌细胞内的表达,并统计B7-H4表达水平和乳腺癌患者预后的相关性;通过Western blot和RT-q PCR检测B7-H4... 详细信息

目的:阐明OTUD4去泛素化修饰B7-H4机制的研究,以及该机制对乳腺癌肿瘤微环境的影响。方法:本课题通过免疫组化的方法定位B7-H4在乳腺癌细胞内的表达,并统计B7-H4表达水平和乳腺癌患者预后的相关性;通过Western blot和RT-q PCR检测B7-H4在常见乳腺癌细胞系中蛋白水平和m RNA水平的表达是否一致。通过蛋白免疫共沉淀-质谱分析法筛选出与B7-H4存在相互作用的去泛素化修饰酶OTUD4。研究表明,OTUD4和B7-H4之间可能存在相互作用,这可以通过进行外源性和内源性Co-IP实验来证实。通过慢病毒稳定构建OTUD4过表达和OTUD4敲低的乳腺癌细胞系,Western blot和RT-q PCR技术检测OTUD4过表达和OTUD4敲低后的乳腺癌细胞系B7-H4蛋白和m RNA表达水平的变化。蛋白免疫沉淀-泛素化实验进一步探究OTUD4对B7-H4泛素化修饰的影响,蛋白半衰期实验探究OTUD4过表达和OTUD4低表达对于B7-H4蛋白半衰期的调控。克隆形成实验、细胞增殖实验和Transwell实验证明OTUD4和B7-H4对乳腺癌细胞本身生长增殖和转移能力的影响。采用多色荧光免疫分析B7-H4表达水平与肿瘤微环境中CD8+T细胞浸润之间的关系。结果:B7-H4在乳腺癌中表达上调,且与乳腺癌患者预后呈负相关;B7-H4在乳腺癌细胞系中蛋白水平和RNA水平表达不一致,且蛋白水平明显受去泛素化酶抑制剂影响;B7-H4与OTUD4存在相互作用且OTUD4正向调控B7-H4;OTUD4增加B7-H4蛋白水平,但不影响m RNA水平的变化;OTUD4通过去泛素化修饰B7-H4;改变OTUD4和B7-H4的表达水平不影响乳腺癌细胞系本身的生长和转移能力;在乳腺癌组织中OTUD4和B7-H4表达呈正相关,且和CD8+T细胞浸润呈负相关。结论:B7-H4在乳腺癌组织中表达高于正常组织,且B7-H4高表达的乳腺癌患者预后更差。OTUD4可以通过去泛素化正向调控B7-H4表达。OTUD4和B7-H4的表达通过影响CD8+T细胞浸润进而影响乳腺癌的转移和预后。

关键词： OTUD4 B7-H4 泛素化乳腺癌

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B7-H4表达对胃癌患者预后的影响及机制

解放军医学杂志 2021年第2期46卷 122-128页

作者：车楠齐文博杨昭婷玄延花延边大学医学院再生医学研究所吉林延吉133002 延边大学医学院病理教研室吉林延吉133002

目的探讨B7-H4表达对胃癌患者预后的影响及其可能机制。方法利用UALCAN、Kaplan-Meier Plotter数据库及GEPIA在线分析工具分析胃癌组织中B7-H4的表达及其与患者预后的关系。采用免疫组化染色检测胃癌组织中B7-H4的表达,分析其与临床病... 详细信息

目的探讨B7-H4表达对胃癌患者预后的影响及其可能机制。方法利用UALCAN、Kaplan-Meier Plotter数据库及GEPIA在线分析工具分析胃癌组织中B7-H4的表达及其与患者预后的关系。采用免疫组化染色检测胃癌组织中B7-H4的表达,分析其与临床病理特征、细胞周期调控蛋白、微血管密度(MVD)、干性相关蛋白及PI3K/Akt/NF-κb信号通路蛋白的关系。采用免疫荧光和Western blotting检测胃癌细胞中B7-H4及干性相关蛋白的表达。采用Oncomine数据库分析胃癌组织中B7-H4与PI3K、Akt mRNA表达的相关性。结果B7-H4在胃癌组织中的表达水平高于正常组织(PB7-H4与细胞周期调控蛋白p16及干性相关蛋白LSD1、SOX9、CD133的表达呈正相关(r=0.250,P76,P=0.018;r=0.434,PB7-H4阳性组织标本的MVD明显高于B7-H4阴性组织标本(P=0.019)。在胃癌细胞系中B7-H4与干性相关蛋白LSD1、SOX9、CD133共表达。B7-H4在胃癌组织中与p-PI3K-p85、p-Akt-Thr308、p-Akt-Ser473和NF-κb p65的表达呈正相关(r=0.269,P7,P=0.034)。胃癌组织中B7-H4与PI3K、Akt mRNA的表达呈正相关(r=0.403,PB7-H4能够促进胃癌进展且与患者的预后不良密切相关,其机制可能与B7-H4通过PI3K/Akt/NF-κb通路调节胃癌干性特征相关。

关键词： B7-H4 胃癌预后干性 PI3K/Akt/NF-κb

Expression of B7-H4 and hepatitis b virus X in hepatitis b virus-related hepatocellular carcinoma

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World Journal of Gastroenterology 2016年第18期22卷 4538-4546页

作者： bo hong Yun Qian hong Zhang Yi-wen Sang Lin-fang Cheng Qi wang Song Gao Min Zheng hang-ping Yao Department of Pathology The Second Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine Department of Clinical Laboratory The Second Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine Department of Gastroenterology The First Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases The First Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine

AIM: To investigate the expression and clinical significance of B7-H4 and hepatitis b virus X(hbx) protein in hepatitis b virus-related hepatocellular carcinoma(hbV-hCC).METhODS: The expression of B7-H4 in the human hCC cell lines hep G2 and hep G2.2.15 were detected by western blot, flow cytometry, and immunofluorescence. The expression of B7-H4 and hbx in 83 hbV-hCC was detected by immunohistochemistry, and the relationship with clinicopathological features was analyzed. Paraffin sections were generated from 83 hbV-hCC patients(22 females and 61 males) enrolled in this study. The age of these patients ranged from 35 to 77 years, with an average of 52.5 ± 11.3 years. All experiments were approved by the Ethics Committees of the Second Affiliated hospital, Zhejiang University School of Medicine.RESULTS: B7-H4 was significantly upregulated in hep G2.2.15 cells compared to hep G2 cells. Specifically, the protein expression of B7-H4 in the lysates of hep G2 cells was more than that in hep G2.2.15 cells. In addition, hbx was expressed only in hep G2.2.15 cells. Similar data were obtained by flow cytometry. The positive rates of B7-H4 and hbx in the tissues of 83 hbV-hCC patients were 68.67%(57/83) and 59.04%(49/83), respectively. The expression of hbx was correlated with tumor node metastases(TNM) stage, and the expression of B7-H4 was positively correlated with hbx(rs = 0.388; p he expression level of B7-H4 in hbx-positive hbV-hCC tissues was substantially higher than that in hbx-negative hbV-hCC tissues. The expression level of b7h4 was negatively related to tumor TNM stage.CONCLUSION: higher expression of hbx and B7-H4 was correlated with tumor progression of hbV-hCC, suggesting that B7-H4 may be involved in facilitating hbV-related hepatocarcinogenesis.

关键词： hepatocellular carcinoma hepatitis b virus hepatitis b virus X B7-H4 Immunohistochemistry