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羊口疮病毒b2l、F1l截短融合基因的构建及生物信息学分析

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黑龙江畜牧兽医 2022年第21期 86-92,139,140页

作者：付强梁倩鲜思美包涛涛杨倩顾庆林郑维豪杜鹏青成欣六盘水市畜牧水产业发展中心贵州六盘水553001 贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物疫病研究所贵阳550025 贵州省黔东南州农业农村局贵州黔东南556000

为了构建羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)b2l-F1l截短融合基因,并对该基因序列进行生物信息学分析,试验采用DNAStar生物信息学软件分别对b2l、F1l基因序列进行分析,截取b2l、F1l基因序列的主要抗原区域,分别设计引物,利用重叠延伸PCR(SOE-P... 详细信息

为了构建羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)b2l-F1l截短融合基因,并对该基因序列进行生物信息学分析,试验采用DNAStar生物信息学软件分别对b2l、F1l基因序列进行分析,截取b2l、F1l基因序列的主要抗原区域,分别设计引物,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术对截取的b2l、F1l基因主要抗原区域进行融合,并与pMD-18T载体连接,构建重组质粒pMD18-T-b2l-F1l,经PCR鉴定、双酶切和测序验证正确后,应用生物信息学在线软件对b2l-F1l截短基因编码的蛋白质进行信号肽、跨膜结构、亲疏水性、柔韧性、抗原指数、抗原决定簇、糖基化结合位点、磷酸化结合位点、二级结构和三级结构进行预测。结果表明:构建的b2l-F1l截短融合基因大小约为1080 bp,与预期目的片段大小相符;该蛋白有信号肽、无跨膜结构域,亲水性、抗原指数及柔韧性较好,有17个抗原决定簇,2个糖基化结合位点和28个磷酸化结合位点,二级结构中以α-螺旋和无规则卷曲占比较大。说明试验成功构建出羊口疮病毒b2l-F1l截短融合基因。

关键词：羊口疮病毒 b2l F1l SOE-PCR 生物信息学分析

羊口疮病毒陕西株b2l基因的克隆表达及间接ElISA检测方法的建立

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羊口疮病毒陕西株B2L基因的克隆表达及间接ELISA检测方法的建立

作者：何建斌西北农林科技大学

学位级别：硕士

羊口疮（Orf）是由羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）引起的传染性很强的传染病,呈全球性分布,羔羊对本病较为敏感,常造成重大的经济损失。本试验应用聚合酶链反应（PCR）技术扩增了ORFV Shaanxi分离株的b2l基因,并对其进行了序列分析及原... 详细信息

羊口疮（Orf）是由羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）引起的传染性很强的传染病,呈全球性分布,羔羊对本病较为敏感,常造成重大的经济损失。本试验应用聚合酶链反应（PCR）技术扩增了ORFV Shaanxi分离株的b2l基因,并对其进行了序列分析及原核表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并以该重组蛋白为包被抗原,通过优化各种条件,初步建立了检测其抗体水平间接ElISA方法。获得如下研究结果:1.扩增了ORFV Shaanxi分离株的b2l基因,目的基因片段长度为1137 bp,测序后,与Genbank中已收录的其他11株病毒毒株的b2l蛋白进行了序列分析,核苷酸序列和氨基酸序列的相似性在95.9%~97.4%和97.8%~99%之间。将目的基因成功连接到原核表达载体pET-28a,构建了重组质粒pET-28a-b2l。在大肠埃希菌原核表达系统中对重组质粒pET-28a-b2l进行诱导表达,获得了42 kD的b2l重组蛋白。2.以纯化的b2l重组蛋白为包被抗原,通过优化各种条件,建立了检测ORFV抗体水平的间接ElISA方法。优化的各条件是:抗原包被量为600 ng,血清和酶标二抗的稀释浓度1∶200和1∶5000;含5%脱脂奶粉的PbST封闭时间是1.5 h;血清和酶标二抗孵育1 h和0.5 h;TMb显色10 min。该方法特异性强、敏感性和重复性良好。对344份临床血清样品进行了检测,阳性检出率为96.8%。

关键词： ORFV b2l 表达纯化间接ElISA

羊口疮病毒安徽株的分离鉴定及其b2l基因的原核表达

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羊口疮病毒安徽株的分离鉴定及其B2L基因的原核表达

作者：郭浩安徽农业大学

学位级别：硕士

羊口疮病毒又叫羊传染性脓疱病病毒(ORFV),该病毒属于痘病毒科副痘病毒属病毒。羊口疮病毒具有较强的传染性,主要感染绵羊和山羊等反刍动物。近年来,逐渐有报道该病毒也可感染鹿、松鼠等野生动物。世界各国和地区都有该病的报道,对养羊... 详细信息

羊口疮病毒又叫羊传染性脓疱病病毒(ORFV),该病毒属于痘病毒科副痘病毒属病毒。羊口疮病毒具有较强的传染性,主要感染绵羊和山羊等反刍动物。近年来,逐渐有报道该病毒也可感染鹿、松鼠等野生动物。世界各国和地区都有该病的报道,对养羊业造成较大危害和经济损失。除了疫苗接种外,该病尚未找到有效的治疗手段,使用较多的疫苗是弱毒苗和灭活苗,二者在一定程度上能够预防羊口疮病,但存在病毒毒力返强、病毒变异等问题,效果并不理想,因此有必要找到更加有效的措施防范该病毒的传播及危害。从中国安徽省亳州市某羊场采集疑似羊口疮病口腔结痂病料,利用Hela细胞进行病毒分离培养,根据NCbI上已公布的ORFV b2l基因序列,设计一对特异性引物,对特异性b2l基因进行PCR扩增并送至生物公司测序,与已发表的其他毒株进行序列比对,并构建遗传进化树,确定基因进化关系。将该基因克隆至原核表达载体pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-b2l,转化至大肠埃希菌bl21中,经IPTG诱导后,用SDS-PAGE及Western blot检测目的蛋白及反应原性,蛋白纯化后,注射小鼠,制备多克隆抗体保存备用。结果显示,将该病毒接种到Hela细胞后,3～4天产生细胞病变,细胞表现为脱落、圆缩等特征;PCR显示,在1137bp处有一明显的特异性条带,与目的片段长度一致,与参考序列比对,同源性达到99%,系统发育进化树表明该分离株与辽宁分离株HQ694773的亲缘关系最近,说明成功分离到一株羊口疮病毒,将其命名为ORFV-AH分离株。本试验成功表达了b2l重组蛋白,该蛋白以包涵体形式存在,SDS-PAGE分析表明蛋白约为55kDa,最佳诱导条件为温度37℃、时间4h,IPTG终浓度为1mmol/l,Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫活性。本试验提供了一种羊口疮病毒的检验方法,为安徽省羊口疮病毒的防控提供了技术支撑。

关键词：羊口疮病毒分离鉴定 b2l 原核表达

Identification and Phylogenetic Analysis of an Orf Virus Isolated from an Outbreak in boer Goat in Shanxi Province

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Agricultural Sciences in China 2011年第6期10卷 946-953页

作者： GU Shao-peng SHI Xin-tao SHI Zhong-yong WANG Zhong-bing ZHENG Ming-xue College of Animal Science and Veterinary Medicine Shanxi Agricultural University Taigu 030801 P.R.China Genetically Modified Testing Center Ministry of Agriculture/College of Life Science Shanxi Agricultural Universit Taigu 030801 P.R. China Center for Animal Disease Control and Prevention of Shanxi Province Taiyuan 030024 P.R.China

To identify and analyze the Orf virus in Shanxi Province, China, an Orf virus strain was successfully isolated from crust materials of boer goat with clinical sore mouth symptom from a goat farm of Shanxi Province by passaging in lamb testis （lT）. The Orf virus was identified by enzyme linked immunosorbent assay （ElISA） test, recurrent infection test, transmission electron microscopy, and PCR. The nucleotide and amino acid sequences of two genes of the Orf virus were analyzed. The results showed that under the electron microscopy the virus had a presence of typical parapoxvirus virions and there were many eosinophilic intracytoplasmic inclusions observed by hematoxylin-eosin （H＆E） stain. In ElISA test, optical density （OD） readings of the sample showed a positive result, and the rabbits infected with the virus showed a typically Orf virus-infected appearance. All these findings proved that the sample was an Orf virus. The phylogenetic studies of Orf b2l and Orf F1l genes showed that the virus clustered in different branches and were closer to the Orf virus Nantou （DQ904351） and the OV-SA00 isolates （AY386264）. Furthermore, the above results may provide some insight into the genotype of the etiological agent responsible for the Orf outbreak in Shanxi Province, and could also provide a comparative view of the b2l and F1l genes of parapoxvirus.

关键词： Orf virus boer goat identification phylogenetic analysis b2l F1l

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羊口疮抗体ElISA检测方法的建立及应用

羊口疮抗体ELISA检测方法的建立及应用

作者：李杰西北农林科技大学

学位级别：硕士

羊口疮，是由痘病毒科副痘病毒属的羊口疮病毒感染引起的人畜共患传染病，能引起山羊采食、吮乳困难而影响患羊增重或继发其他感染而死亡，给养羊业造成很大经济损失。许多研究结果显示，体液免疫在羊口疮免疫防御中发挥着很重要的作用... 详细信息

羊口疮，是由痘病毒科副痘病毒属的羊口疮病毒感染引起的人畜共患传染病，能引起山羊采食、吮乳困难而影响患羊增重或继发其他感染而死亡，给养羊业造成很大经济损失。许多研究结果显示，体液免疫在羊口疮免疫防御中发挥着很重要的作用。因而建立羊口疮抗体的ElISA检测方法对于羊口疮疫苗的免疫效果评估、羊口疮流行病学调查等有着重要的应用价值。羊口疮病毒表面囊膜蛋白b2l、肝素结合蛋白（F1l）和干扰素连接蛋白（VIR）在不同羊口疮病毒株中高度保守，并能刺激机体产生抗羊口疮病毒的抗体，因而本研究选其作为间接ElISA检测方法的候选包被抗原。本研究根据NCbI中已公布的b2l、F1l和VIR基因序列设计引物，通过PCR进行这三个基因的克隆，并将其与pGEM-Teasy载体连接转化到DH5α感受态细胞中，构建克隆质粒，测序。测序结果使用DNAstar软件分析基因的核苷酸和氨基酸序列，使用SignalPversion3.0预测有无信号肽，使用稀有密码子预测网站预测稀有密码子的含量;将目的基因与pET-32a经双酶切后连接并转化到bl21(DE3)中进行原核表达，获得的可溶性蛋白进行镍柱纯化;分别在家兔脊柱两侧、腹股沟经皮内或皮下接种重组蛋白抗原制备多克隆抗体，并通过Westernblot和琼脂双扩散试验确定获得的目的蛋白能否与其制备的多克隆抗体特异性结合，并通过间接ElISA方法确定抗体效价;分别以表达的蛋白和羊口疮病毒作为包被抗原检测53头份成年羊和已吃初乳的新生羔羊血清，通过比较阳性率确定哪种蛋白作为最佳包被抗原建立羊口疮抗体间接ElISA检测方法，对羊口疮疫情进行监测和进行疫苗免疫效果评估。研究结果如下： 1.成功克隆了b2l、F1l和VIR基因，其基因序列全长分别为1137bp、1011bp和552bp。序列分析结果表明，b2l、F1l和VIR基因与NCbI中已公布的基因核苷酸序列相似性分别为96.7%-98.0%、97.3%、94.9%-96.2%，氨基酸序列相似性分别为96.0%-97.9%、91.8%-92.9%、96.7%-97.3%，这四个基因在不同羊口疮病毒中高度保守。 2.获得了b2l、VIR基因的原核表达产物。pET32a-b2l-bl21上清在10℃、4h、IPTG0.3mmol/l表达量最高，pET32a-VIR-bl21上清在37℃、11h、IPTG1mmol/l表达量最高;b2l和VIR蛋白多克隆抗体的ElISA效价分别为1:200000和1:100000;Westernblot和琼脂双扩散试验显示，b2l和VIR蛋白能与兔抗羊口疮病毒抗血清和羊口疮病毒阳性血清特异性结合。3.确定了b2l蛋白、VIR蛋白和羊口疮病毒分别作为间接ElISA包被抗原的最佳反应条件，其中b2l蛋白最佳包被浓度为22μg/ml，最佳包被液为碳酸盐缓冲液，一抗最佳作用时间40min，二抗最佳作用时间60min，底物最佳作用时间20min;VIR蛋白最佳包被浓度为30μg/ml，最佳包被液为碳酸盐缓冲液，一抗最佳作用时间40min，二抗最佳作用时间60min，底物最佳作用时间20min;羊口疮病毒最佳包被浓度为106.2TCID50/ml，最佳包被液为碳酸盐缓冲液，一抗最佳作用时间60min，二抗最佳作用时间60min，底物最佳作用时间20min。分别以b2l蛋白、VIR蛋白、羊口疮病毒作为间接ElISA包被抗原检测成年羊和已吃初乳的新生羔羊血清共53头份的结果显示，b2l蛋白与羊口疮病毒的检测结果相同，阳性率为56.6%（30/53），因而成功建立以b2l蛋白作为包被抗原的羊口疮抗体ElISA检测方法。 4.通过特异性试验确定重组b2l蛋白与羊痘标准阳性血清、羊口蹄疫标准阳性血清无交叉反应，表明该方法特异性强;通过敏感性试验确定当羊口疮标准阳性血清稀释到1:105时仍为阳性，表明该方法敏感性高;通过批内重复和批间重复检测标准阴阳性血清各1份、待检血清4份，结果显示其变异系数分别为0.23%-4.32%和1.59%-5.83%，小于15%，表明该方法重复性良好;经临床试验表明该方法能检测多个地区的山羊血清和进行疫苗的免疫效果评估。以上结果表明，本实验成功克隆了羊口疮病毒保守性基因b2l、F1l和VIR，获得了b2l和VIR可溶性蛋白，建立了以b2l蛋白为包被抗原的羊口疮抗体ElISA检测方法，能进行羊口疮流行病学监测和疫苗免疫效果评估。

关键词：羊口疮病毒 b2l 肝素结合蛋白干扰素连接蛋白 ElISA

羊口疮病毒的分离鉴定及其ElISA检测方法的建立

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羊口疮病毒的分离鉴定及其ELISA检测方法的建立

作者：张海瑞中国农业科学院

学位级别：硕士

羊口疮又称羊接触传染性脓疱性皮炎,是由羊口疮病毒引起的绵羊、山羊和某些野生反刍动物的一种常见的接触性、嗜上皮性传染病,该病毒也可感染人。羊口疮病毒属于痘病毒科副痘病毒属,该属病毒还包括牛丘疹性口炎病毒、假牛痘病毒以及红... 详细信息

羊口疮又称羊接触传染性脓疱性皮炎,是由羊口疮病毒引起的绵羊、山羊和某些野生反刍动物的一种常见的接触性、嗜上皮性传染病,该病毒也可感染人。羊口疮病毒属于痘病毒科副痘病毒属,该属病毒还包括牛丘疹性口炎病毒、假牛痘病毒以及红鹿、松鼠、海豹副痘病毒。羊口疮呈世界性分布,近年来发病率逐年上升,引起人们广泛关注。羊口疮病毒基因组由双链线状DNA组成,大约138kbp,编码132个假定基因;其中羊口疮病毒b2l基因编码约42kDa是具有高免疫原性的主要囊膜蛋白,该蛋白与牛痘病毒主要囊抗原p37K同源。人们已根据保守的b2l基因进行羊口疮病毒的检测,分子特征描述和进化树分析。随着羊口疮流行范围的日益扩大,亟需建立统一标准的诊断方法,对羊口疮的流行状况进行评估,进而为防控羊口疮提供技术支撑。基于此,本实验进行了如下研究:1羊口疮病毒甘肃株的分离与鉴定利用Hela细胞从甘肃某地发病绵羊痂皮病例中分离羊口疮病毒;根据NCbI羊口疮病毒b2l基因序列,采用Oligo6.0生物软件设计一对特异性引物,PCR扩增保守b2l基因;运用MEGA4.0.2对获得羊口疮病毒株b2l基因核苷酸序列和其它羊口疮毒株以及副痘病毒属其它成员进行多序列比对,最大似然法构建系统发育进化树。结果表明:接种羊口疮病毒的Hela细胞在接种后3～4d内产生细胞病变(CPE),表现为细胞聚集、融合、圆缩,直至脱落的特征性病变;用设计的特异性引物对病毒基因组DNA进行PCR扩增,电泳显示扩增出约1137bp的清晰条带,与目的基因片段长度一致;与参考序列相似性为99%,提交NCbI获得登录号HQ694772;系统发育进化树表明分离的羊口疮病毒属于Ⅰ支,与羊口疮病毒吉林分离株亲缘关系近。以上结果说明成功分离到羊口疮病毒,将其命名为Orf-GS株。2羊口疮病毒b2l重组蛋白的原核表达及纯化在大肠杆菌Rosetta(DE3)plyS中成功表达了b2l重组蛋白,并对TPTG浓度、诱导时间和温度等诱导条件进行优化,最终确定温度28℃、IPTG浓度0.4mmol/l、诱导表达4h为b2l融合蛋白的最佳诱导表达条件;由于该蛋白以包涵体的形式表达,采用DOC和SKl对包涵体进行处理,经镍株纯化b2l融合蛋白,SAS-PAGE电泳结果表明在42 kDa左右获得纯化目的蛋白;免疫印迹结果分析显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应原性。3羊口疮ElISA检测方法的建立选用重组b2l蛋白作为包被抗原,探索重组蛋白作为诊断抗原建立间接ElISA检测方法的一系列条件。通过方阵试验,确定了抗原最佳包被浓度为0.5μg/孔,血清的最佳稀释度为1:100。实验证实该ElISA检测方法的特异性、敏感性、重复性均较好。

关键词：羊口疮病毒分离鉴定 b2l 原核表达酶联免疫吸附试验