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Asia1型口蹄疫病毒VP2蛋白b细胞线性表位的鉴定

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畜牧兽医学报 2009年第10期40卷 1508-1513页

作者：徐宗香高明春李勐李爽刘思莹葛兰云张润祥马波王君伟东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

为了对Asia1型口蹄疫病毒VP2蛋白进行抗原表位作图,设计了7个相互重叠15个氨基酸、覆盖整个VP2蛋白的重叠短肽,经克隆并在大肠杆菌中实现了融合表达。用Asia1型口蹄疫感染血清对7个融合蛋白进行免疫印迹分析,结果初步鉴定出VP2蛋白b细... 详细信息

为了对Asia1型口蹄疫病毒VP2蛋白进行抗原表位作图,设计了7个相互重叠15个氨基酸、覆盖整个VP2蛋白的重叠短肽,经克隆并在大肠杆菌中实现了融合表达。用Asia1型口蹄疫感染血清对7个融合蛋白进行免疫印迹分析,结果初步鉴定出VP2蛋白b细胞线性抗原表位位于氨基末端的第1-44氨基酸区域,并且证实O型、A型、C型口蹄疫标准血清和感染SAT2型口蹄疫康复期的牛血清也能识别融合蛋白F1(1-44 aa)。在此基础上,针对F1(1-44 aa)短肽,设计了6个相互重叠5个氨基酸的短肽片段,进一步鉴定出了VP2蛋白b细胞线性表位位于氨基末端的第6-15氨基酸区域。

关键词：口蹄疫病毒 VP2蛋白 b细胞线性表位鉴定

猪流行性腹泻病毒流行株S蛋白高变区b细胞线性表位肽的鉴定

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微生物学通报 2019年第7期46卷 1772-1784页

作者：刘英杰李凤平董世娟王瑞阳于瑞嵩王燕李震齐鲁工业大学生物工程学院(山东省科学院) 山东济南250353 上海种猪工程技术研究中心上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海201106 上海市农业遗传育种重点实验室上海201106 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

【背景】对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)经典毒株与流行毒株S蛋白氨基酸序列比对显示,变异位点主要集中在S蛋白的N端。【目的】鉴定PEDV流行毒株S蛋白高变区(S10A,1-496 aa)的b细胞线性表位肽,特别是流行毒... 详细信息

【背景】对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)经典毒株与流行毒株S蛋白氨基酸序列比对显示,变异位点主要集中在S蛋白的N端。【目的】鉴定PEDV流行毒株S蛋白高变区(S10A,1-496 aa)的b细胞线性表位肽,特别是流行毒株特异性b细胞表位肽。【方法】以SDS-PAGE割胶纯化大肠杆菌表达的PEDV流行株SD2014 S蛋白高变区片段(S10A^SD2014),免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;在***中谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferase,GST)融合表达覆盖S10A^SD2014序列全长且彼此重叠8个氨基酸残基的系列16肽。以制备的抗S10A^SD2014多抗为一抗,通过Western blot筛选系列16肽中的阳性反应性16肽,鉴定S10A^SD2014上的b细胞线性表位肽;利用抗PEDV经典毒株(CV777)S蛋白高变区片段(S10A^CV777)多抗血清鉴定S10A^SD2014上的保守性b细胞线性表位肽。【结果】重组表达的S10A^SD2014相对分子质量约为72 kD;纯化的S10A^SD2014表位肽能被PEDV阳性血清识别。制备的抗S10A^SD2014多抗可以识别PEDV DR13弱毒株。利用抗S10A^SD2014血清和抗S10A^CV777血清从61个GST融合表达的16肽中鉴定到28个阳性反应16肽,其中13个为2种血清共同识别16肽。对24株PEDV不同亚群代表毒株的对应区域进行同源性分析表明2个阳性16肽为保守性表位肽。【结论】确定了PEDV流行株SD2014 S蛋白高变区的b细胞线性表位肽,b细胞线性表位肽,特别是流行毒株特异性表位肽的确定有助于了解S蛋白的结构与功能,为建立以表位为基础的PEDV感染检测方法打下良好基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒纤突蛋白高变区多克隆抗体 b细胞线性表位

鹅细小病毒VP3蛋白b细胞线性表位的精确定位

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畜牧兽医学报 2010年第8期41卷 988-994页

作者：郭鹭鞠环宇于天飞荆志强马波王君伟东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

本试验旨在利用获得的4株抗鹅细小病毒(GPV)VP3的单克隆抗体,进一步对GPV VP3 b细胞线性抗原表位精确定位。根据笔者实验室已鉴定的线性抗原表位区结果,筛选出单抗所针对的优势抗原表位区。设计并合成互相重叠5 aa的10 aa短肽寡聚核酸片... 详细信息

本试验旨在利用获得的4株抗鹅细小病毒(GPV)VP3的单克隆抗体,进一步对GPV VP3 b细胞线性抗原表位精确定位。根据笔者实验室已鉴定的线性抗原表位区结果,筛选出单抗所针对的优势抗原表位区。设计并合成互相重叠5 aa的10 aa短肽寡聚核酸片段,退火后,连入pET-32a载体,经转化鉴定,诱导表达后,获得相应的小片段融合蛋白,并利用单抗通过Western blot进行抗原性鉴定。同样方法进行短肽片段两端氨基酸的逐个缺失设计,进一步精确定位,结果鉴定出2个抗原表位,分别为430-435 aa和643-647 aa。

关键词：鹅细小病毒 VP3蛋白单克隆抗体 b细胞线性表位

拟态弧菌溶血素VMH蛋白b细胞线性表位的预测与鉴定

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安徽农业大学学报 2017年第2期44卷 208-213页

作者：曹际陶会竹赵雨婷肖宁李槿年安徽农业大学动物科技学院合肥230036

为了定位拟态弧菌热不稳定溶血素VMH蛋白的b细胞线性表位,以VMH蛋白全长氨基酸序列为基础,联合利用AbCpred和bepi Pred网络服务器综合分析预测VMH蛋白b细胞线性表位。同时,以霍乱弧菌Cytolysin蛋白为同源建模模板,利用Modeller 9.14软... 详细信息

为了定位拟态弧菌热不稳定溶血素VMH蛋白的b细胞线性表位,以VMH蛋白全长氨基酸序列为基础,联合利用AbCpred和bepi Pred网络服务器综合分析预测VMH蛋白b细胞线性表位。同时,以霍乱弧菌Cytolysin蛋白为同源建模模板,利用Modeller 9.14软件构建VMH蛋白的3D结构,并使用Py Mol软件展示预测表位,确定其在3D结构中的位置。共预测出6个最有可能的b细胞线性表位,它们分别位于VMH蛋白N端P130-141、P192-203、P236-247、P281-292、P425-436和P464-475区域,且完全或大部分暴露于蛋白3D结构表面。人工合成6条预测表位肽,分别采用肽ELISA、肽抑制性免疫印迹反应和溶血活性试验进行鉴定。结果发现6个预测表位肽均能与兔抗VMH蛋白抗体发生结合反应;除预测表位P281-292外,其余5个预测表位肽能明显抑制兔抗VMH蛋白抗体与VMH蛋白间的免疫印迹反应,且具有溶血活性。结果表明,预测表位P130-141、P192-203、P236-247、P425-436和P464-475是拟态弧菌VMH蛋白的真正b细胞线性表位。

关键词：拟态弧菌 VMH蛋白 b细胞线性表位免疫反应性溶血活性

金黄色葡萄球菌SEG蛋白b细胞线性表位的预测与验证

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安徽农业大学学报 2013年第3期40卷 426-429页

作者：梁明燕戚莉芳李槿年张婷婷安徽农业大学动物科技学院合肥230036

以金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923的肠毒素G蛋白(SEG)氨基酸序列为分析材料,应用DNAstar软件对该蛋白的二级结构、柔性区域、亲水性、表面可能性和抗原指数等参数进行综合分析,预测出SEG蛋白5个可能的b细胞线性表位,它们分别位于蛋白N端... 详细信息

以金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923的肠毒素G蛋白(SEG)氨基酸序列为分析材料,应用DNAstar软件对该蛋白的二级结构、柔性区域、亲水性、表面可能性和抗原指数等参数进行综合分析,预测出SEG蛋白5个可能的b细胞线性表位,它们分别位于蛋白N端第24～31、37～46、80～84、120～127和141～149区域,且预测的表位2(aa 37～46)、表位4(aa120～127)和表位5(aa141～149)位于SEG蛋白三维结构表面。合成位于蛋白三维结构表面的3个预测表位,采用肽ELISA方法加以鉴定。结果表明,它们均能与抗重组SEG蛋白纯化抗体发生特异性结合反应,是SEG蛋白的b细胞线性表位。

关键词：金黄色葡萄球菌 SEG蛋白 b细胞线性表位预测肽ELISA

HPV16型E6蛋白的b细胞线性表位预测及分析

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中国病原生物学杂志 2015年第3期10卷 220-223,227页

作者：杨恩张燕侯柏龙杜王琪张丽芳温州医科大学第一临床医学院浙江温州325035 温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室

目的对高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)16型E6蛋白的b细胞线性表位进行预测。方法以HPV16型E6蛋白(P03126)的全长氨基酸序列为基础,采用EXPASY网站上的生物信息学软件和DNAstar软件包中的Protean软件分析E6蛋白的二级结构,跨... 详细信息

目的对高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)16型E6蛋白的b细胞线性表位进行预测。方法以HPV16型E6蛋白(P03126)的全长氨基酸序列为基础,采用EXPASY网站上的生物信息学软件和DNAstar软件包中的Protean软件分析E6蛋白的二级结构,跨膜趋势及其亲水性,表面可及性,抗原性,极性和柔韧性等特性。综合以上参数预测HPV16型E6蛋白的b细胞线性表位,并进一步进行同源性匹配分析。结果综合多个参数分析显示b细胞线性表位可能位于E6蛋白N端2-7、9-19、30-36、45-49、105-109、119-125和148-158区段及其附近,进一步同源性匹配分析支持其中区段2-7、9-19、119-125及148-158为可能的b细胞线性表位,其中区段148-158(RSSRTRRETQL)为HPV16型E6蛋白所特有的序列,而区段2-7(HQKRTA)、9-19(FQDPQERPRKL)与HPV9型E6蛋白具有同源性,区段119-125(PEEKQRH)与HPV31型E6蛋白具有同源性。结论综合分析预测HPV16型E6蛋白的b细胞线性表位可能位于E6蛋白N端2-7、9-19、119-125及148-158区段,为HPV16型E6蛋白的进一步研究奠定了基础。

关键词： HPV16型 E6蛋白 b细胞线性表位预测同源性匹配分析

牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3 b细胞线性表位的鉴定

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牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3 B细胞线性表位的鉴定

作者：李岩东北农业大学

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻病毒(bovine Viral Diarrhea Virus)隶属于黄病毒科(Flaviridae)、瘟病毒属(Pestivirus)。该病毒可以造成牛只的持续性感染,并且不表现出显著的症状,也可引发牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea, bVD),临床表现为白细胞减... 详细信息

牛病毒性腹泻病毒(bovine Viral Diarrhea Virus)隶属于黄病毒科(Flaviridae)、瘟病毒属(Pestivirus)。该病毒可以造成牛只的持续性感染,并且不表现出显著的症状,也可引发牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea, bVD),临床表现为白细胞减少、黏膜糜烂溃疡、腹泻及怀孕母牛流产或产出畸形胎。该病的流行已经给世界养牛业造成了巨大的经济损失。NS3蛋白具有较高的免疫原性,在病毒感染过程中,免疫系统的CD4 T细胞主要识别NS3和E2两种蛋白,并可诱导免疫细胞产生针对该蛋白的抗体。因此检测NS3蛋白抗体水平可以作为检测牛病毒性腹泻病毒感染的有效指标之一。本研究利用大肠杆菌表达系统分段表达重组NS3蛋白,利用标准阳性血清筛选NS3蛋白b细胞线性表位区,共筛选出6段具有反应原性的蛋白肽段;(1VCKKITEHERCHVNI15),(20AFFGVMPRGTTPRAPVR36),(46RRGLETGWAYTHQGGI61),(281EGDMATGITYASYGYFC297),(426YSGEDPANLRVVTSQSPYVVVATNAIESGV455)和(481FIVTGLKRMAVTVGEQA497)。筛选出的表位不但可以作为bVDV的检测抗原建立多种检测血清学检测手段,亦为今后开展非结构蛋白NS3的抗原结构甚至致病机理的研究提供理论依据。同时本研究应用套式RT-PCR方法扩增出牛病毒性腹泻病毒VEDEVAC株编码NS3蛋白的基因,克隆至表达载体pET-30a(+),并进行测序。对瘟病毒属病毒NS3基因进行氨基酸差异性分析显示平均P-distance为0.07,基于NS3的系统进化树分析表明VEDEVAC株隶属于bVDV 1型。

关键词：牛病毒性腹泻黏膜病感染 b细胞线性表位非结构蛋白进化树差异性分析

寨卡病毒ddPCR和RT-qPCR检测方法的建立及b细胞线性表位分析

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寨卡病毒ddPCR和RT-qPCR检测方法的建立及B细胞线性表位分析

作者：惠媛南方医科大学

学位级别：硕士

背景寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)为单股正链RNA病毒,属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)。最初是1947年在乌干达森林里分离的,通过蚊虫叮咬传播,特别是埃及伊蚊和白纹伊蚊。ZIKV感染者的临床表现包括轻度发烧(37.8-38.5℃)... 详细信息

背景寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)为单股正链RNA病毒,属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)。最初是1947年在乌干达森林里分离的,通过蚊虫叮咬传播,特别是埃及伊蚊和白纹伊蚊。ZIKV感染者的临床表现包括轻度发烧(37.8-38.5℃)、关节疼痛(尤其是手和脚疼痛)、肌痛、头痛、眼眶疼痛、结膜炎、皮疹,还可引起小头畸形和Guillain-barre综合症。ZIKV编码3个结构蛋白(衣壳蛋白C、前体蛋白prM、包膜蛋白E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2b、NS3、NS4A、NS4b 和 NS5)。对于ZIKV检测,主要有血清学检测和核酸分子检测两种方法。由于寨卡病毒和其他黄病毒存在交叉反应抗原,在同时存在其它黄病毒的流行区,血清学检测可能产生假阳性结果。现有的量化核酸检测方法在检测极低病毒浓度的血清样本时,敏感性和准确性受到一定限制。微滴式数字聚合酶链式反应(Micro-droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)是一种新的分子检测方法,它和RT-qPCR使用相同的引物和探针,但不需要外部标准曲线或参考就能精确地检测和量化核酸。近年来,ddPCR在医学检验、环境监测和食品安全控制中的应用越来越多,但尚未有在ZIKV检测中应用的报道。本论文第一部分拟建立基于寨卡病毒NS5基因的ddPCR和RT-qPCR方法,对比它们的灵敏度和特异性,旨在为检测低滴度和/或寨卡病毒早期感染提供更准确性的方法。接种疫苗预防寨卡病毒感染最有效的方法。但是目前尚没有批准上市的寨卡疫苗,寨卡疫苗的研发迫在眉睫。b细胞抗原表位是指抗原分子表面可被b细胞表面受体(b cell receptor,bCR)或抗体Fab部分特异性识别并结合的化学基团,是引起体液免疫的物质基础。b细胞抗原表位作为抗原的核心部分,是研究免疫诊断和免疫治疗的重点,对它的生物信息学预测可以节约实验室工作量,在一定程度上避免传统表位研究的盲目性。各种研究表明,表位驱动疫苗能够有效地刺激多种病原体的保护性免疫反应,如流感病毒、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。b细胞抗原表位的鉴定对于表位疫苗的发展很重要,免疫信息学在疫苗开发领域正变得越来越重要,该领域利用基因组和蛋白质组的信息,为预测潜在的候选疫苗提供了高质量的信息。本文第二部分拟通过对寨卡病毒Z16006株蛋白序列抗原性预测、基本理化性质和二级结构分析预测b细胞抗原表位,最终得出寨卡病毒蛋白b细胞优势表位区段。应用多参数方法预测寨卡病毒蛋白b细胞表位,为进一步实验鉴定其表位进而制备单克隆抗体奠定基础。目的建立寨卡病毒微滴式数字 PCR(micro-droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)和实时荧光定量 PCR(real-time quantification PCR,RT-qPCR)检测技术,并评估两种方法的检测范围、灵敏度和重复性。运用生物信息学的方法,发现寨卡病毒Z16006株全长蛋白潜在的b细胞线性抗原表位。方法对于ddPCR方法的建立,首先使用软件设计寨卡病毒NS5基因的引物和探针,制备质粒标准品,建立RT-qPCR以及ddPCR方法,并比较两种检测方法的灵敏性和准确性。以本科室现有的寨卡病毒株Z16006(Accession:AMR39830.1)为研究对象,从NCbI上获得Z16006蛋白序列,用在线软件VaxiJen v2.0对其抗原性进行评分,在ProParam软件中分析Z16006蛋白序列的基本理化性质,利用SOPMA软件进行二级结构预测,随后通过IEDb软件和AbCpred在线服务器对寨卡病毒Z16006株蛋白各蛋白序列b抗原表位进行预测分析。结果1.基于寨卡病毒NS5基因设计PCR引物和探针,使用RT-q PCR对质粒标准品进行检测,其标准曲线R2为0.999,扩增效率为92.203%,在101-108 copy/μL范围内循环阈值(the cycle threshold value,Ct)和拷贝数有比较好的线性关系,但是浓度为1 copy/μL的样品不能被检测到。DdPCR线性范围从101-104 copy/μL,并且可以检测浓度低至1 copy/μL的样品。对于临床阳性血液样品,RT-qPCR适合高浓度样品(101 copy/μL),ddPCR对于低拷贝数样品具有良好的准确性和敏感性。2.应用VaxiJen v2.0、ProtParam服务器、SOPMA、IEDb生物信息学服务器、AbCpred在线服务器,对寨卡病毒Z16006株蛋白各蛋白表位参数综合分析来预测了 b细胞表位。共预测分析得出52个b细胞潜在优势抗原表位。结论:1.本研究建

关键词：寨卡病毒 NS5基因核酸检测 ddPCR RT-qPCR b细胞线性表位

流产布鲁氏菌bP26蛋白b细胞线性表位的鉴定

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流产布鲁氏菌BP26蛋白B细胞线性表位的鉴定

作者：羡东堡东北农业大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌病（brucellosis）是由布鲁氏菌（brucella）引起的传染性疾病,给畜牧业的发展造成巨大的的经济损失。该菌能经过皮肤粘膜和呼吸道等途径侵入机体引起感染和发病。布鲁氏菌病的易感动物种类很多,其中羊、牛、猪最易感。bP26具... 详细信息

布鲁氏菌病（brucellosis）是由布鲁氏菌（brucella）引起的传染性疾病,给畜牧业的发展造成巨大的的经济损失。该菌能经过皮肤粘膜和呼吸道等途径侵入机体引起感染和发病。布鲁氏菌病的易感动物种类很多,其中羊、牛、猪最易感。bP26具有良好的抗原性,是由细胞内向外释放的可溶性外周蛋白,相对于固定的外膜蛋白,具有易于检测的的特点。bP26在各布鲁氏菌种中的相似性较高,所以适合做布鲁氏菌病的诊断抗原。为了对流产布鲁氏菌bP26蛋白进行抗原表位研究,设计了3个相互重叠15个氨基酸、覆盖整个bP26蛋白的重叠短肽,经克隆并在大肠杆菌中实现了融合表达。用流产型布鲁氏菌感染的阳性血清对3个融合蛋白进行免疫印迹分析,初步鉴定出bP26蛋白b细胞线性抗原表位位于第51～165aa处。根据上述结果,针对bP262（51～165aa）短肽,将其分为5个相互重叠10个氨基酸的短肽片段,进一步鉴定出了bP26蛋白b细胞线性表位位于第109～141aa氨基酸区域。此基础上,又进行了第三轮的抗原表位筛选,针对bP262.4（109～141aa）短肽设计了6个相互重叠5个氨基酸的短肽片段,经磷酸化退火后与表达载体pET-32a进行融合表达及纯化,通过VVestern-blot鉴定具有抗原性的片段为第118～132aa处。最后,为了进一步缩短bP26蛋白的b细胞线性表位,进行了第四轮的筛选,针对bP262.4.3（118～127aa）和bP262.4.4（123～132aa）短肽设计了9个氨基酸的短肽片段,经磷酸化退火后与表达载体pET-32a进行融合表达及纯化,通过、Vestern-blot鉴定结果显示,bP26蛋白b细胞线性表位区位于N端的123～127aa处。综合上述研究结果,流产布鲁氏菌bP26蛋白的b细胞线性抗原表位区位于第123～127aa区域,而此区域在其他布鲁氏菌中是一个高度保守的区域。对流产布鲁氏菌bP26蛋白的b细胞线性抗原表位鉴定,从而进一步了解布鲁氏菌的抗原结构提供理论数据支持。

关键词：流产布鲁氏菌 bP26蛋白 b细胞线性表位鉴定