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抗SARS-CoV-2与SARS-CoV广谱中和抗体筛选及功能验证

抗SARS-CoV-2与SARS-CoV广谱中和抗体筛选及功能验证

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作者：罗玲安徽农业大学

学位级别：硕士

冠状病毒是一类包膜RNA病毒,目前有7种冠状病毒是能够感染人类的,其中3种具有高致病性,4种具有低致病性。严重急性呼吸综合症冠状病毒-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)和严重急性呼吸综合征冠状病毒(Sev... 详细信息

冠状病毒是一类包膜RNA病毒,目前有7种冠状病毒是能够感染人类的,其中3种具有高致病性,4种具有低致病性。严重急性呼吸综合症冠状病毒-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)和严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus,SARS-CoV)均为β冠状病毒属的两种高致病性冠状病毒,二者的基因组序列相似性约为80%,两种病毒均通过结合细胞表面的血管紧张素转化酶II(ACE2)进入细胞。SARS-CoV-2致死率(3%)低于SARS-CoV(10%),但具有极强的传染性。截止2023年2月10日,据WHO统计,全球累计SARS-CoV-2确诊病例已超6亿例,死亡病例超683万例。为此,针对该病毒的疫苗开发和中和抗体类药物的生产等备受关注,并且目前已有多种获批紧急使用或上市的疫苗和中和抗体药物。然而SARS-CoV-2 Omicron病毒株对目前积极使用的中和抗体药物可产生极强的免疫逃逸,并且这些中和抗体不能中和SARS-CoV。因此,筛选出中和SARS-CoV-2和SARS-CoV的广谱中和抗体对防控类似SARS-CoV-2和SARS-CoV等的β冠状病毒感染具有重要应用价值。本研究主要以SARS-CoV-2和SARS-CoV广谱性中和性抗体的筛选为目标,为后续广谱类中和抗体药物的开发提供一些思路。为此,我们制备了以SARS-CoV-2RbD为免疫原的m RNA疫苗对小鼠进行免疫,并诱导大量抗原特异性抗体的产生,再通过高通量单细胞测序技术构建出SARS-CoV-2特异性抗体库,从抗体库中我们合成并表达了出现频率最高的前100株单克隆抗体,通过基因座分析、结合效应分析、亲和力测定、中和活性评价以及阻断效应评价等方法,完成了抗SARS-CoV-2和SARS-CoV广谱中和抗体筛选的一系列工作。研究结果显示,利用SARS-CoV-2 RbD m RNA疫苗免疫可以快速诱导抗原特异性的抗体库产生,且该抗体库在基因座的使用上具有一定的聚焦性。我们从抗体库中选取了100株抗体进行基因合成并表达,从中我们筛选到能特异性结合SARS-CoV-2RbD的抗体有65株,能结合SARS-CoV-2 RbD和SARS-CoV RbD的抗体有8株。从这8株抗体中,我们筛选出2株能中和SARS-CoV-2和SARS-CoV的广谱中和抗体,分别为R30和R100抗体。其中,R30抗体可完全阻断两种病毒RbD蛋白与受体结合,R100抗体可完全阻断SARS-CoV-2 RbD与受体结合,可部分阻断SARSCoV RbD与受体结合。经过抗体表位竞争实验初步分析出R100中和抗体的结合表位可能与I类抗体的结合位点有很大重合,而R30中和抗体可能靶向于一个新的抗原表位。此外,我们还从这8株抗体中筛选到了包括R30和R100抗体在内的5株广谱中和SARS-CoV-2及其Delta变异株和beta变异株的中和抗体,且均能够完全阻断SARS-CoV-2 RbD与受体结合。综上,本研究中利用高通量单细胞测序技术成功完成了SARS-CoV-2特异性抗体库的建库及测序工作,且通过这种大规模的筛选方式可筛选到2株中和SARS-CoV-2和SARS-CoV广谱中和抗体,尽管这两株抗体的中和活性不强,但后续通过抗体工程技术对其进行改造以及对其中和机制的深入研究将对未来广谱类疫苗及中和抗体的开发提供一些新的研究方向。

关键词： SARS-CoV-2 SARS-CoV b细胞抗体库广谱中和抗体

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