检索结果-南通市图书馆

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

YB-1蛋白在胰腺癌中的功能研究

YB-1蛋白在胰腺癌中的功能研究

作者：乔炎炎北京协和医学院

学位级别：硕士

胰腺癌是恶性程度较高的消化道肿瘤,其发病率和死亡率较高,且其死亡率位于所有致死肿瘤的第七位。YB-1蛋白属冷休克蛋白家族,是多功能转录因子,影响肿瘤生长、分化、转移、耐药及凋亡等多个层面。YB-1在肿瘤发生发展中的作用已被研究多... 详细信息

胰腺癌是恶性程度较高的消化道肿瘤,其发病率和死亡率较高,且其死亡率位于所有致死肿瘤的第七位。YB-1蛋白属冷休克蛋白家族,是多功能转录因子,影响肿瘤生长、分化、转移、耐药及凋亡等多个层面。YB-1在肿瘤发生发展中的作用已被研究多年,但其功能和作用机制仍未被完全揭示。本实验室前期研究表明YB-1与胰腺癌的TNM分期显著相关,且YB-1高表达组总生存期显著低于YB-1低表达组,YB-1高表达组病人其生存期较短。自噬在胰腺癌中的表达水平较高,且随着胰腺癌恶性程度的升高而增加。由此推测,自噬在胰腺癌的发生发展中也发挥着重要的作用。因此明确YB-1在胰腺癌中的功能,研究YB-1对胰腺癌中自噬过程的影响及分子机制,可进一步阐明胰腺癌的发生发展过程,为胰腺癌的诊断治疗提供理论基础。本研究利用Western Blot检测YB-1蛋白在胰腺癌细胞系中的表达,选取YB-1表达量较高的细胞系BxPC3及表达量较低的细胞系AsPCl,分别敲降和高表达YB-1。利用免疫荧光及Western Blot检测细胞内自噬小体与细胞内LC3-Ⅱ蛋白变化量,结果在完全培养基及血清饥饿的条件下,高表达YB-1均能显著降低细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达量及自噬小体数量;利用GFP-LC3质粒示踪同样发现YB-1对胰腺癌自噬具有抑制作用。利用慢病毒构建YB-1稳定敲降细胞系BxPC3-shYB-l(shRNA)及对照细胞系BxPC3-shNC(shNC),Bafilomycin Al(BAFM)处理稳转细胞系,阻断自噬小体与溶酶体的结合,Western Blot检测细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达量变化及自噬小体的变化,并与DMSO处理组对比,发现细胞自噬变化趋势相同;在BxPC3-shYB-1细胞内瞬时转染mRFP-GFP-LC3质粒,免疫荧光分析自噬流的变化,结果表明YB-1主要通过抑制细胞内自噬小体的形成从而抑制胰腺癌细胞自噬;深入研究表明YB-1通过调节Atg5与Atg12表达,影响Atg5-Atg12-Atg16复合物形成,进而影响自噬小体的形成过程。YB-1蛋白能够抑制胰腺癌的自噬水平,但是其对胰腺癌各类恶性表型的影响还未知。为此,我们进一步探究YB-1对胰腺癌恶性表型的影响。结果表明YB-1可促进胰腺癌细胞迁移,克隆形成;xCELLigence Real-time Cell Analyzer(RTCA)-MP系统实验表明YB-1促进细胞增殖;流式细胞术检测表明YB-1可抑制顺铂诱导的胰腺癌细胞凋亡。鉴于YB-1在胰腺癌恶性表型中的显著作用,我们进一步探索YB-1是否也会影响其他类型肿瘤细胞的恶性表型。我们选取KYES450与YES2为实验材料,检测了 YB-1对食管鳞癌细胞的恶性表型影响,发现YB-1同样能够促进食管鳞癌细胞侵袭、迁移、增殖和克隆形成。裸鼠尾静脉肺转移模型结果表明YB-1可促进胰腺癌细胞的肺转移。免疫组织化学结果表明,在106例胰腺癌组织中YB-1与auroraA的表达具有显著正相关,并且YB-1可通过抑制aurora a的泛素化降解而提高其蛋白表达水平。综上所述,本文发现YB-1蛋白抑制胰腺癌细胞自噬,并且促进胰腺癌及食管鳞癌恶性表型,提示YB-1有可能作为胰腺癌的治疗靶点,为胰腺癌诊断治疗提供新思路。

关键词： YB-1 胰腺癌食管鳞癌 aurora a 自噬

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

二芳基吡唑类衍生物合成及生物活性评价

二芳基吡唑类衍生物合成及生物活性评价

作者：邢曼南京大学

学位级别：硕士

吡唑环是一类非常重要的含氮杂环,吡唑类杂环衍生物具有广泛的生物活性。在医药领域,吡唑类衍生物对许多疾病具有治疗作用,研究表明吡唑类化合物具有抗癌、杀菌、抑菌、消炎、止痛等药理活性。在农药领域,吡唑类化合物具有杀菌、杀虫和... 详细信息

吡唑环是一类非常重要的含氮杂环,吡唑类杂环衍生物具有广泛的生物活性。在医药领域,吡唑类衍生物对许多疾病具有治疗作用,研究表明吡唑类化合物具有抗癌、杀菌、抑菌、消炎、止痛等药理活性。在农药领域,吡唑类化合物具有杀菌、杀虫和除草活性。MAPK信号传导通路是生物体内重要的信号转导通路之一,在真核生物细胞的生长,增值,存活和分化过程中发挥着重要的作用。细胞信号转导的过度激活与肿瘤的发生有关。RAF激酶在MAPK信号传导通路起着重要的作用。在哺乳动物细胞中RAF家族包括ARAF, BRAF和CRAF三个成员。大约8%的人类肿瘤发生BRAF突变,BRAF绝大多数的突变形式为BRAFV600E突变,主要发生于黑色素瘤、甲状腺癌和结肠癌中。因此,BRApV600E成为了当今抗肿瘤药物研发的热门靶标。BRAFV600E抑制剂的基本结构包含一个氢键供体,通常是吡唑,吡啶或咪唑的杂环和取代的芳族基团与疏水口袋相互作用。为了获得一个更好的具有氢键和疏水作用的合适长度基团,我们合成了一系列(1,3-二苯基-1H-吡唑-4-基)甲基苯甲酸酯衍生物。体外测试目标化合物对A375和WM266.4的抗增殖活性,实验表明,大部分化合物低毒并具有较强的抗肿瘤活性,其中化合物10a活性最强,其对A375和WM266.4的IC50分别为IC50=1.36μM,0.94μM(阳性对照vemurafenib对A375和WM266.4的IC50分别为0.20μM和0.06μM)。体外测试化合物的BRAFV600E抑制活性,化合物10a的BRAFV600E抑制活性依然最好。为进一步探讨目标化合物可能作用机制,进行了计算机模拟对接研究,研究表明化合物10a紧紧的嵌入到蛋白的活性结合口袋。这说明化合物10a可能是很好有研究前景的以BRAFV600E为靶点的抗癌先导化合物。为了进一步确定所得衍生物的结构,我们培养出其中产物9c的单晶,用单晶X射线衍射技术测定了它的晶体结构。极光激酶是一类高度保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,在细胞有丝分裂过程中有着重要的作用。在哺乳动物中发现有三种极光激酶：极光激酶A,极光激酶B和极光激酶C。极光激酶A在细胞中的异常表达会导致中心体扩增,干扰极光激酶A的功能会引起中心体功能缺陷,星体微管长度缩短,不能形成纺锤体,进而影响有丝分裂。研究证实,aurora a在大多数恶性肿瘤中均高表达,如乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌等。因此,有针对性地抑制极光激酶A已经成为癌症治疗的一个具有吸引力的治疗发展策略,已有超过10个极光激酶抑制剂进入早期临床评估。研究发现的激光激酶抑制剂的主要活性骨架分为四个部分A-D即(A)含有1,4,5,6.四氢吡咯并[3,4-c]吡唑核心：(B)含有吡咯并[2,3-b]嘧啶核心： (c)含有喹啉的核心和(D)含有的2=苯胺基-二氨基嘧啶核心。基于上述我们合成了一系列二芳基吡唑苯甲酰胺类衍生物,并对其进行了生物活性性评价。实验表明,人部分化合物具有较强的抗肿瘤活性,其中化合物10e活性最强,其对HCT116和MCF.7的IC50分别为0.39±0.06μM和0.46±0.04μM,(阳性对照VX-680对HCT116和MCF-7的IC50分别为0.30±0.03μM和0.38±0.02μM)。体外抗aurora-A试验表明10e具有最强的蛋白激酶抑制活性(IC50=0.16±0.03 μM)。计算机模拟对接研究表明化合物10e紧紧的嵌入到蛋白的活性结合u袋。Weston blot实验表明10e对HCT116具有良好的肿瘤抑制活性。由此推测,化合物10e可能是一类具有较好研究前景的以aurora a为抗肿瘤靶点的先导化合物

关键词：吡唑 BRAFV600E aurora a 苯甲酸酯苯甲酰胺抗癌分子对接

Spindlin 1定位与功能的关键位点分析及鉴定

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

Spindlin 1定位与功能的关键位点分析及鉴定

作者：丛斌中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

卵母细胞的发育与成熟一直是生命研究的重点,对此过程中相关蛋白功能的研究将有助于深入了解生命起始本质。自上世纪70年代以来,越来越多的研究关注精子、卵母细胞以及受精卵早期发育相关蛋白。在这其中,一个30kD的蛋白在多个研究小组... 详细信息

卵母细胞的发育与成熟一直是生命研究的重点,对此过程中相关蛋白功能的研究将有助于深入了解生命起始本质。自上世纪70年代以来,越来越多的研究关注精子、卵母细胞以及受精卵早期发育相关蛋白。在这其中,一个30kD的蛋白在多个研究小组的报道中出现,1997年Bermseok小组在对小鼠卵母细胞发育过程进行研究时将其分离并命名为spindlin.研究表明,小鼠Spindlin蛋白表达具有时空特异性,在减数分裂过程中与纺锤体密切相关,表达随着卵母细胞成熟过程逐渐增高;在2细胞时期开始降低,随着受精卵发育其表达逐渐消失;鼠Spindlin蛋白可作为MOS/MAPK的作用底物在信号通路中被磷酸化修饰后发挥作用。之后文献陆续报道Spindlin在鸟类、鱼类等生殖细胞中表达,与精子发生期特异转录子Ssty (Y-linked spermiogenesis specific transcript)共同组成一个进化高度保守的与生殖细胞发育密切相关的Spin/Ssty家族。我们研究小组最早从人卵巢癌细胞中克隆获得了与鼠spindlin基因高度同源的基因并命名为spindlin1。前期研究结果表明,Spindlin1定位于细胞核,为参与细胞周期调控的核蛋白,外源性spindlin1的表达可以引起细胞丝裂灾变以及染色体不稳定,使NIH3T3细胞发生恶性转化;进一步的分析表明spindlin1可能通过对β-catenin/ T cell factor (TCF-4)通路发挥其对细胞周期的调控作用。为更深入了解spindlin1功能和作用机制,我们原核表达spindlin1蛋白,纯化后制备晶体,并对其晶体结构进行分析,结果表明spindlin1蛋白具有三个序列上非常类似的Spin/Ssty重复结构域,每个结构域都由4～5个反向平行的β-折叠构成。那么,在Spindlin1结构分析的基础上通过构建、突变与探讨蛋白质之间的相互作用等方法确认影响蛋白定位与功能的关键氨基酸位点无疑是进一步研究的重要内容。一.spindlin 1突变体质粒的构建我室从人类卵巢癌样本中分离克隆获得了该家族成员——人类spindlin基因,命名为spindlin1。该基因cDNA全长4375bp,含714bp的开放读框,编码237个氨基酸的蛋白。在我们前期的研究中,我们对其结构生物学进行探讨,结果表明Spindlin1蛋白结构分为三个序列上非常类似的Spin/Ssty重复结构域。为深入阐明spindlin1的生物功能,了解其作用的分子机制,我们在生物信息学和蛋白晶体结构解析的基础上,构建了一系列突变体,将spindlin1蛋白中14、84、99位丝氨酸突变成丙氨酸,得到Ser14M,Ser84M,Ser99M,Ser14+84M,Ser14+99M,Ser84+99M,Ser14+84+99M等七种突变质粒。为下一步的研究定位和功能关键位点的确定打下基础。二.spindlin 1突变对其定位和功能的影响在获得野生型和突变表达载体后,我们首先以蛋白亚细胞定位作为其功能变化的直观标示,期望能从中找到在Spindlin1生物功能发挥中具有重要作用的位点。我们将野生型及七种突变质粒转染Hela细胞,观察Spindlin1-EGFP融合蛋白亚细胞定位。结果表明:野生型的Spindlin1定位于细胞核,再我们构建的七个不同突变体中,Ser14+Ser84,Ser84+Ser99,Ser14+Ser84+Ser99的联合突变均能使野生型融合蛋白在细胞核内集中分布的特性消失,成为全细胞弥散分布,而Ser14,Ser84,Ser99各位点的单独突变及Ser14+Ser99的联合突变均对Spindlin1蛋白的细胞核内分布没有影响;提示Ser84在Spindlin1蛋白的定位中发挥重要作用。我们之前的实验初步提示Spindlin1蛋白可能通过与转录因子TCF-4结合而发挥作用,在本实验中我们利用GST-pulldown的方法证实Spindlin1和TCF-4之间在体外具有相互作用,并且证实了外源性Spindlin1表达对TCF-4荧光素报告基因的转录活性有激活作用.为了进一步验证Ser84在Spindlin1功能发挥中的作用。我们将pEGFP-spindlin1野生型表达载体或spindin1的突变载体分别与TCF-4荧光素酶报告基因载体pTOPFlash和作为转染对照的β-galactosidase载体共转染Hela细胞,荧光素酶活性分析显示与对照载体pEGFP-C1质粒相比,pEGFP-spindlin1与TCF-4荧光素酶报告基因载体pTOPFlash载体共转染后,TCF-4荧光素酶报告基因的转录活性明显上升,而Ser14+Ser84,Ser84+Ser99,Ser14+Ser84+Ser99

关键词： spindlin 磷酸化位点点突变亚细胞定位 aurora a GST-pulldown

Azu-1及PinX1蛋白质在细胞有丝分裂中的功能解析

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

Azu-1及PinX1蛋白质在细胞有丝分裂中的功能解析

作者：李娜中国科学技术大学

学位级别：硕士

在动物细胞中,中心体是主要的微管组织中心,它在细胞极性的产生,胞间运输以及细胞分裂过程中发挥着重要作用。细胞通过调控中心体的正常复制与分离,可以防止细胞分裂时染色体的异常分离。当中心体功能出现障碍时,往往伴随染色体分离异常... 详细信息

在动物细胞中,中心体是主要的微管组织中心,它在细胞极性的产生,胞间运输以及细胞分裂过程中发挥着重要作用。细胞通过调控中心体的正常复制与分离,可以防止细胞分裂时染色体的异常分离。当中心体功能出现障碍时,往往伴随染色体分离异常,从而导致癌症的发生。作为aurora serine/threonine蛋白激酶家族的成员之一,aurora a定位于中心体,在细胞有丝分裂过程中,调节中心体的成熟和双极纺锤体的组装。aurora a的缺失会导致中心粒的分离出现问题,或者令染色体不能正确的排列到赤道板上。最近的研究的发现,在果蝇和爪蟾系统中,aurora a能够磷酸化TACC(Transforming acidic coiled coil)蛋白,并招募TACC蛋白到中心体上,与微管结合蛋白一起参与调控中心体微管的稳定性。人类存在三种TACC蛋白(TACC1、TACC2和TACC3),其中TACC3已经被证明能够被aurora a磷酸化,而有关于TACC2的报道却很少。在这里,我们主要研究了人类TACC家族中的Azu-1(anti-zuai-1),它是TACC2蛋白的异构体。我们的研究结果表明Azu-1通过其N端与aurora a相互作用,Azu-1与aurora a在有丝分裂期的HeLa细胞中共定位于中心体,并且Azu-1能够被aurora a磷酸化,这个磷酸酸化事件对于Azu-1定位到中心体上是相当重要的。另一方面,在细胞分裂过程中,从DNA的复制到染色体的配对,以及与微管相互作用,到最后正确分离到子代细胞,这一系列重要事件都受到细胞周期检验点的精密监视及调控。而当染色体出现错误时或者动点没有完全被微管捕获时,纺锤体装配检验点(Spindle assembly checkpoint)被激活。随后一系列信号转导事件将修正染色体动点与微管之间不正确的连接,最后动点完全正确的排列在赤道板上,细胞周期得以从中期进入后期。纺锤体装配检验点可以保证染色体正确分离。从最简单的单细胞真核生物酵母,到复杂的后生生物,例如我们人类自己,这些进行调控的分子事件都是高度保守的。PinX1是一个潜在的间期端粒酶抑制因子,它在细胞有丝分裂期中的报道很少。在这里我们证明了PinX1在染色体的正常分离过程中起着很重要的作用。去卷积显微镜观察结果显示PinX1在间期时定位于核仁和端粒,在有丝分裂期时定位于染色体周边以及动点上。我们设计的缺失突变体实验证明了PinX1的动点定位依赖于它的中间区域,而染色体周边的定位依赖于它的C端。有趣的是,PinX1的动点定位依赖于Hec1和CENP-E,同时我们的生化数据显示PinX1是一个重要的微管结合蛋白。我们的实时图像分析表明在抑制了PinX1的表达后,染色体不能正常的排列到赤道板上,导致有丝分裂期染色体桥以及间期小核的发生,意味着PinX1在染色体稳定性方面所起的作用。另外,我们还找到了PinX1的结合蛋白Nucleolin,它是一个染色体周边蛋白,通过PinX1的C端与PinX1相互作用。去卷积显微镜结果显示在前中期时,PinX1主要与Nucleolin共定位于染色体周边。更进一步的研究发现,Nucleolin的缺失会破坏PinX1的染色体周边定位,暗示着PinX1与Nucleolin在功能上的相互关系。实时图像数据表明,当PinX1和Nucleolin的表达同时被抑制时,染色体的分离不能正常进行。我们认为PinX1能够被Nucleolin招募到染色体周边,而PinX1和Nucleolin复合物对于染色体正常排列到赤道板这个过程中起着重要作用。

关键词： Azu-1 aurora a Nucleolin PinX1 TACC 中心体染色体周边