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大鼠核转录因子atoh1的克隆表达及鉴定

听力学及言语疾病杂志 2011年第5期19卷 438-443页

作者：郑国玺祝康侯瑾朱珠韦俊荣许珉西安交通大学医学院第二附属医院耳鼻咽喉头颈外病院西安710004

目的利用基因工程方法克隆SD大鼠atoh1基因CDS区序列,构建大鼠核转录因子atoh1的真核表达载体并在真核细胞中表达。方法从两只SD大鼠结肠黏膜提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增atoh1基因CDS区序列并亚克隆于PMD-19T载体中。测序鉴定后将At... 详细信息

目的利用基因工程方法克隆SD大鼠atoh1基因CDS区序列,构建大鼠核转录因子atoh1的真核表达载体并在真核细胞中表达。方法从两只SD大鼠结肠黏膜提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增atoh1基因CDS区序列并亚克隆于PMD-19T载体中。测序鉴定后将atoh1基因连接于含有EGFP和内部核糖体转入位点(IRES)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,对重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,荧光显微镜和Western blot检测其在293T细胞中的表达。结果扩增得到大鼠atoh1 CDS区长1 056 bp,编码351个氨基酸,与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基应为单核苷酸多态性(SNP),突变为无义突变,不影响蛋白表达。双酶切和测序结果证明atoh1已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,荧光显微镜和Western blot证实atoh1目的蛋白能在293T细胞中稳定表达。结论基因工程方法可成功克隆出atoh1编码序列,真核表达载体patoh1-IRES2-EGFP构建成功并可以在293T细胞中表达。

关键词：感音神经性聋 atoh1 基因克隆真核表达载体

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HBx蛋白通过转录因子atoh1下调ARID2的表达促进肝细胞肝癌发生

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HBx蛋白通过转录因子ATOH1下调ARID2的表达促进肝细胞肝癌发生

作者：高庆祝重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是我国肝细胞肝癌发生的主要原因,乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)在HBV感染所致肝癌的发生过程中具有重要的作用。作为多功能调节蛋白,HBx参与调控细胞凋亡、细胞周... 详细信息

目的:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是我国肝细胞肝癌发生的主要原因,乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)在HBV感染所致肝癌的发生过程中具有重要的作用。作为多功能调节蛋白,HBx参与调控细胞凋亡、细胞周期进程、细胞增殖和迁移等多种细胞内过程。HBx作为一个反式激活子,可以和转录因子相互作用进而调节宿主基因表达。有研究表明许多细胞内基因,增强子/启动子元件,转录因子如(AP)-1、NF-κB、CREB、(ATF)/cAMP等参与HBx介导的肝癌发生。然而,HBx通过调节基因转录进而诱导肝癌发生的具体机制至今尚未明确。ARID2(AT-rich interactive domain-containing protein 2)基因是SWI/SNF复合物中PBAF(Polybromo-associated BRG1-associated factor)家族的一个亚基。ARID2有2个典型的结构域:即N-端保守的ARID结构域和C-端两个保守的C2H2锌指结构。锌指结构不仅能结合DNA,也能结合RNA,蛋白质等。ARID相关蛋白通过核受体参与配体依赖的转录激活,具有细胞系基因调节、胚胎发育、细胞周期控制等多种生物学功能,ARID2基因也参与肿瘤的发生发展。近年来,在多种实体肿瘤中发现ARID2存在失活突变,如肝癌,黑色素瘤,非小细胞肺癌,胃癌等。本课题组之前研究发现肝癌组织中ARID2的表达明显下调,且ARID2的低表达与肝癌细胞的增殖迁移能力密切相关。本研究旨在深入观察hbx对arid2的转录调节及调控的具体分子机制,以进一步理解hbv参与肝细胞癌发生的致病机理。方法:1)分别在hbv复制的肝癌细胞、hbx瞬时或稳定表达肝癌细胞株以及hbv转基因小鼠中,通过westernblot检测arid2的表达水平。在hbv相关肝癌组织标本中,通过免疫组化检测arid2的蛋白表达水平,通过real-timepcr技术检测arid2与hbx表达水平的相关性;2)在肝癌细胞中,构建arid2启动子pgl3-arid2和间隔逐段缺失的arid2启动子荧光素酶报告质粒,观察hbx对arid2启动子活性的影响及hbx调控arid2启动子的关键区域;chip(染色质免疫共沉淀)观察hbx调控arid2基因启动子区的结合变化;3)根据筛出的关键区域寻找特异性转录因子,在肝癌细胞中通过双荧光素酶活性、染色质免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)、免疫共沉淀(immunoprecipitation,ip)等实验进行验证;4)在稳定表达hbx的肝癌细胞中观察arid2过表达对肝癌细胞增殖、迁移能力的改变。结果:westernblot实验发现:在肝癌细胞和hbv转基因小鼠中,hbv复制可以下调arid2表达,其中hbx可以显著下调arid2蛋白的表达,其他蛋白如hbc,hbs作用不显著;相比野生型hbv复制肝癌细胞,hbv复制细胞中含hbx缺失突变可以有效回复arid2的表达,在此基础上外源性补充hbx蛋白,arid2的回复表达被拮抗;在肝癌细胞中,瞬时和稳定表达hbx均可以明显下调arid2的表达。免疫组化发现:在hbv相关肝癌组织标本中,与癌旁组织相比,肿瘤组织中arid2表达明显下调;相关性分析表明hbx与arid2的表达呈负相关。双荧光素酶活性实验发现:与pgl3-basic相比,arid2基础活性增高显著,约15倍;过表达hbx后,arid2启动子活性受到明显抑制,且呈剂量依赖关系;hbx调控arid2基因表达的关键区域位于启动子上游-1040to-601bp附近;chip(染色质免疫共沉淀)实验证实hbx不能直接作用于arid2启动子区。提示hbx在转录水平间接抑制arid2的表达。转录因子预测软件预测、real-timepcr和westernblot筛选出差异表达转录因子atoh1;双荧光素酶活性实验发现:过表达atoh1可回复hbx介导的arid2转录抑制作用;在稳定表达hbx的肝癌细胞系中,过表达atoh1可使hbx介导的arid2抑制作用消失;chip实验结果表明:过表达hbx可以抑制atoh1结合于arid2的启动子区;atoh1敲低后arid2的表达下调;双荧光素酶活性实验发现:与野生型相比较,hbx对atoh1结合位点突变的arid2抑制活性几乎完全消除。ip实验证实:hbx不能与atoh1直接结合。综上,hbx通过抑制atoh1表达进而转录抑制arid2的表达。transwell和edu实验证实:过表达arid2能够部分逆转hbx促肝癌细胞迁移和增殖效应。westernblot实验发现:过表达arid2诱导emt标志物e

关键词： HBV感染相关肝癌 HBV HBx ARID2 atoh1

Espin对atoh1过表达耳蜗上皮中静纤毛再生和保护的作用研究

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Espin对Atoh1过表达耳蜗上皮中静纤毛再生和保护的作用研究

作者：杨雪纯华南理工大学

学位级别：硕士

研究背景据世界卫生组织(WHO)统计,到2050年预计将近25亿人有不同程度的听力损失,至少7亿人需要听力康复治疗,因此寻找有效的治疗方法迫在眉睫。在哺乳动物中,毛细胞(HC)的丢失可导致永久性感音神经性听力损失,这一过程是不可逆转的,因... 详细信息

研究背景据世界卫生组织(WHO)统计,到2050年预计将近25亿人有不同程度的听力损失,至少7亿人需要听力康复治疗,因此寻找有效的治疗方法迫在眉睫。在哺乳动物中,毛细胞(HC)的丢失可导致永久性感音神经性听力损失,这一过程是不可逆转的,因为HC不能在成熟的耳蜗中自发再生。相比之下,非哺乳动物脊椎动物的HC在受损后可以通过触发相邻支持细胞(SC)的转分化而再生,重建相关的听力和前庭功能。因此,众多科研团队考虑通过类似的模式使耳聋的哺乳动物恢复听力。已有研究表明,在哺乳动物中调控转录因子和/或信号通路可以诱导SCs转分化为HCs,这为听力损失的治疗带来了巨大的希望。基因治疗已被证明是可应用于临床的有效工具,不仅能将有益的基因表达引入各种组织,还可以对某些突变的基因位点进行编辑。最近通过AAV介导基因来治疗遗传性内耳疾病方面已取得了巨大的进步,因此通过基因疗法再生HC从而恢复听力的前景是非常广阔的。atoh1过表达可促进出生后耳蜗中的HCs再生,但再生的HCs不具备原位HCs的成熟结构和功能特征。其中静纤毛作为声音传导的一级结构,功能性静纤毛的再生是治疗后恢复听力的关键基础。而Espin是一种肌动蛋白捆绑蛋白,在静纤毛的发育和结构维持中起着重要作用。已有研究发现联合调控多个基因可以使再生HCs成熟化,因此我们考虑将atoh1与Espin协同调控是否会让再生HCs的结构和功能更加成熟。这样不仅为诱导再生HCs中静纤毛成熟创建了有效的方法,又为SCs转分化为功能性HCs铺平了道路。研究目的1.研究Espin过表达对于atoh1诱导再生毛细胞表面静纤毛的影响作用。2.探讨Espin过表达能否挽救atoh1持续过表达对原位毛细胞静纤毛的损伤作用。研究方法1.通过质粒转染、体外干细胞成球以及外植体培养实验,验证体外环境下Espin过表达对毛细胞纤毛的促增长作用;2.利用免疫荧光染色及生物扫描电镜显示再生毛细胞及原位毛细胞的静纤毛形态对比情况,然后通过苯乙烯基染料(FM1-43)摄取荧光强度比较静纤毛的功能状态,以此来探讨双基因协同调控的效果。研究结果1.在HEK293T细胞、类器官以及外植体培养中,Espin过表达促进了纤毛的形成和增长;***和SEM的统计结果均显示AAV-AE组再生HCs静纤毛的形态更规则,接近原位HCs的形态。此外,FM1-43摄取实验证明AAV-AE组再生HCs静纤毛的摄取功能更强,即生理功能更成熟;***1的长期过表达对HCs会造成较大的损伤,Espin和atoh1共同过表达时原位IHCs静纤毛的形态更规律。此外,FM1-43摄取实验指示AAV-AE组原位IHCs的静纤毛生理功能更强。研究结论***在体外过表达促进毛细胞纤毛的形成和增长;***过表达可以促进atoh1诱导再生毛细胞的静纤毛形态和功能成熟;***1在原位和再生毛细胞中持续性过表达会导致静纤毛严重受损,但上调Espin能够减轻atoh1持续过表达对原位内毛细胞和再生毛细胞静纤毛造成的损伤。

关键词：毛细胞再生静纤毛 AAV-ie Espin atoh1

MicroRNA-613调控atoh1和FMNL2对结肠癌发生发展的影响

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医学信息 2021年第17期34卷 83-86页

作者：查作霖陈福军佳木斯大学附属第一医院肛肠科

目的研究在结肠癌发生发展中microRNA-613调控atoh1和FMNL2的作用和相关性。方法选择2019年12月-2020年12月在佳木斯大学附属第一医院肛肠科进行治疗的结肠癌患者40例作为研究对象,根据病理分化程度将其分为轻度组、重度组,各20例,取癌... 详细信息

目的研究在结肠癌发生发展中microRNA-613调控atoh1和FMNL2的作用和相关性。方法选择2019年12月-2020年12月在佳木斯大学附属第一医院肛肠科进行治疗的结肠癌患者40例作为研究对象,根据病理分化程度将其分为轻度组、重度组,各20例,取癌旁正常组织作为对照组,检测各组microRNA-613、atoh1和FMNL2表达情况,分析microRNA-613与atoh1和FMNL2的相关性。结果对照组、轻度组、重度组microRNA-613表达水平逐渐升高,且各组microRNA-613表达水平比较,差异有统计学意义(Patoh1表达量逐渐升高,各组比较,差异有统计学意义(P13与atoh1和FMNL2均呈负相关(r=-0.581、-0.679,P13可以调控atoh1和FMNL2的表达,可以作为预测结肠癌发病严重程度的分子标志物。

关键词： MicroRNA-613 atoh1 FMNL2 结肠癌

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atoh1基因在肿瘤中的研究进展

中国实用乡村医生杂志 2013年第14期20卷 17-19页

作者：李木子中国医科大学沈阳110001

atoh1基因是一种新发现的肿瘤有关的基因，参与调节细胞分化的最后步骤，保证细胞正确定型。与此同时，atoh1基因是参与细胞恶变的重要的细胞信号通路Notch和Wnt的作用结点。如果可以掌握具体的调节机制以及有效控制atoh1基因的方法，... 详细信息

atoh1基因是一种新发现的肿瘤有关的基因，参与调节细胞分化的最后步骤，保证细胞正确定型。与此同时，atoh1基因是参与细胞恶变的重要的细胞信号通路Notch和Wnt的作用结点。如果可以掌握具体的调节机制以及有效控制atoh1基因的方法，将会成为治疗癌症的利器。本文结合文献，综述atoh1基因在肿瘤中的研究进展。

关键词： atoh1 肿瘤信号通路进展

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髓母细胞瘤中atoh1与Wnt/β-catenin和Shh通路的关系研究进展

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中国神经肿瘤杂志 2012年第4期10卷 267-271页

作者：李昱唐俐重庆医科大学病理教研室重庆400016 重庆医科大学病理生理教研室重庆400016

髓母细胞瘤(medulloblastoma,MB)是儿童最常见的脑肿瘤,Wnt与Shh信号通路与MB的发生密切相关。Wnt通路中的β-catenin能抑制atoh1,而atoh1调节Shh通路中的Gli2表达,atoh1作为一个交汇点介导这两条通路的cross-talk。有关Wnt/β-catenin与Shh通路cross-talk的作用机制研究将有助于阐明髓母细胞瘤的发病机制,有望为髓母细胞瘤的治疗提供一种新的策略。

关键词：髓母细胞瘤 atoh1 Wnt/β-catenin通路 Shh通路

内耳毛细胞分化过程中的关键基因atoh1的下游调控因子

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内耳毛细胞分化过程中的关键基因Atoh1的下游调控因子

浙江省动物学会第十二届会员代表大会暨学术讨论会

作者：钟超黄晓浙江大学生命科学学院细胞与发育生物学研究所

柯蒂氏器是位于哺乳动物耳蜗内的高度特化的感觉上皮,由毛细胞和支持细胞组成。其中毛细胞负责将机械刺激转化为神经信号,进而通过听神经传导至大脑产生听觉。听觉毛细胞的不可逆损伤是造成感音神经性耳聋的重要原因。碱性螺旋-环-螺旋(... 详细信息

柯蒂氏器是位于哺乳动物耳蜗内的高度特化的感觉上皮,由毛细胞和支持细胞组成。其中毛细胞负责将机械刺激转化为神经信号,进而通过听神经传导至大脑产生听觉。听觉毛细胞的不可逆损伤是造成感音神经性耳聋的重要原因。碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子atohl是内耳毛细胞分化所必需的关键因子,它通过作用于下游靶基因从而启动内耳毛细胞的分化。因此,研究内耳毛细胞发育过程中atohl调控的下游靶基因,阐明内耳毛细胞分化的分子机理对于感音神经性耳聋的治疗具有重要意义。通过分析小鼠小脑颗粒神经元前体细胞(CGP)的atohl CMP-Seq以及基于FACS和RNA-Seq的小鼠内耳细胞特异性基因表达谱数据,我们发现Neurod6很可能是内耳毛细胞分化过程中atohl直接调控的靶基因。ICR小鼠(新生1天)耳蜗感觉上皮的整体免疫荧光显示,Neurod6在听觉毛细胞当中特异性表达。分析Neurod6的启动子序列,共发现了4个高度保守的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子作用的靶序列E-box(CANNTG),其中含有两个atohl特异结合的AtEAM(atohl E-Box Associated Motif)。将包含这4个E-box在内的高度保守的序列(582bp)构建至EGFP报告载体上,然后转染能够内源性表达atohl的HEK293T细胞,48h后观察到明显的绿色荧光,表明该段序列具有启动子活性。构建atohl碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域与engrailed repressor的融合表达载体Engrailed-atohlbHLH domain,与上述具有Neurod6启动子活性的EGFP报告载体Neurod6 promoter EGFP共转染HEK293T细胞,48h后观察荧光,结果显示,与对照组只转染Neurod6 promoter EGFP报告载体相比,共转染实验组的绿色荧光强度明显减弱,说明atohl bHLH结构域能够特异性的结合到含E-box的Neurod6的启动子上。

关键词：内耳毛细胞 atoh1 下游靶基因 Neurod6 E-box

来源： cnki会议评论

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耳蜗毛细胞与血管纹的相互依存关系的研究

中华耳科学杂志 2014年第3期12卷 475-480页

作者：李轶刘会占龚树生何志洲首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科北京100730 Department of Biomedical Sciences Creighton Universityusa68178

目的通过对atoh1条件基因敲除小鼠及Mitf基因突变小鼠两个动物模型的研究,来验证毛细胞及血管纹两者的存活是否相互依赖,以及在内耳中是否存在钾离子从血管纹—毛细胞—支持细胞—血管纹循环通路。方法分别对一月龄两种模型小鼠进行ABR... 详细信息

目的通过对atoh1条件基因敲除小鼠及Mitf基因突变小鼠两个动物模型的研究,来验证毛细胞及血管纹两者的存活是否相互依赖,以及在内耳中是否存在钾离子从血管纹—毛细胞—支持细胞—血管纹循环通路。方法分别对一月龄两种模型小鼠进行ABR、CM、CAP和EP的测量。并用免疫组化和共聚焦显微镜以及耳蜗铺片、切片对两种模型小鼠的耳蜗Corti’s器和血管纹进行形态学观察。结果内淋巴的缺损可造成外毛细胞的凋亡,但内毛细胞依然能够存活。20 mV的内淋巴电位是外毛细胞存活所必须的。血管纹的生存及功能并不需要功能正常的Corti’s器的支持,同时内淋巴电位的产生及维持并不依赖毛细胞及支持细胞的钾离子循环的支持。结论成熟毛细胞的存活依赖于正常的血管纹功能和内淋巴的离子环境。然而,血管纹的存活及功能却并不依赖Corti’s器的功能。

关键词： Corti’s器血管纹内淋巴电位 Mitf atoh1

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