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atoh1过表达水平对异位耳蜗毛细胞样细胞的prestin表达及纤毛形态的影响

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复旦学报（医学版） 2020年第2期47卷 197-204页

作者：郑宇马锐迟放鲁赵萌复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科研究院上海200031 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科上海200031 上海市听觉医学临床中心上海200031 国家卫生健康委员会听觉医学重点实验室上海200031 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院实验中心上海200031

目的探讨atoh1过表达水平对体外培养的耳蜗小上皮嵴区域毛细胞样细胞数量、prestin表达情况及其表面纤毛形态的影响。方法取出生后第1天的大鼠耳蜗中圈进行体外培养,之后采用不同浓度的带有atoh1基因的腺病毒(含报告基因EGFP)进行转染,... 详细信息

目的探讨atoh1过表达水平对体外培养的耳蜗小上皮嵴区域毛细胞样细胞数量、prestin表达情况及其表面纤毛形态的影响。方法取出生后第1天的大鼠耳蜗中圈进行体外培养,之后采用不同浓度的带有atoh1基因的腺病毒(含报告基因EGFP)进行转染,检测腺病毒转染后不同时间点体外培养组织的atoh1 mRNA相对表达量,同时观察小上皮嵴区域绿色荧光蛋白信号强度、毛细胞样细胞数量、毛细胞样细胞的prestin表达情况及其表面纤毛形态。结果带有atoh1基因的腺病毒转染浓度越高,atoh1的mRNA表达水平越高,小上皮嵴区域绿色荧光蛋白信号越强,同时该区域生成的毛细胞样细胞数量越多,表达prestin的毛细胞样细胞数量也越多(Patoh1过表达水平与诱导生成的能够表达prestin的异位耳蜗毛细胞样细胞数量正相关,并且atoh1过表达水平越高,这些细胞的表面纤毛形态越规则。

关键词： atoh1 小上皮嵴 prestin 纤毛毛细胞样细胞

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小脑发育过程中atoh1时空表达模式

解剖学报 2023年第2期54卷 134-141页

作者：薛赛赛陈丽萍李莹吴燕吴海涛青岛大学基础医学院生理学与病理生理学系青岛266071 军事科学院军事医学研究院军事认知与脑科学研究所北京100850 首都医科大学基础医学院神经生物学系北京100069

目的探究小脑发育过程中转录因子atoh1 mRNA及其蛋白的时空表达模式。方法取不同发育阶段的小鼠小脑冷冻切片,RNA scope技术分析atoh1 mRNA在小脑中的时空表达模式,每组n=3。同时,使用atoh1转基因和基因敲入两种不同遗传学策略的报告小... 详细信息

目的探究小脑发育过程中转录因子atoh1 mRNA及其蛋白的时空表达模式。方法取不同发育阶段的小鼠小脑冷冻切片,RNA scope技术分析atoh1 mRNA在小脑中的时空表达模式,每组n=3。同时,使用atoh1转基因和基因敲入两种不同遗传学策略的报告小鼠,采用免疫荧光染色技术分析atoh1在蛋白水平的时空表达,每组n=3。结果atoh1 mRNA在胚胎小脑菱唇和外颗粒细胞层中呈高表达;atoh1-3*V5-P2A-tdTomato/+基因敲入小鼠染色结果显示,atoh1主要表达在菱唇和有增殖能力的外颗粒细胞层的外层;atoh1-Cre;tdTomato/+转基因小鼠显示,atoh1阳性细胞在菱唇和整个颗粒细胞发育过程中包括外颗粒细胞层和内颗粒细胞层中均呈高表达。结论小脑发育过程中,atoh1 mRNA和蛋白在胚胎期的菱唇和出生后的外颗粒细胞层中高丰度表达;但在蛋白水平上,基因敲入小鼠和转基因小鼠atoh1在菱唇和外颗粒细胞层中的表达略有不同。

关键词：小脑发育 atoh1 颗粒前体细胞 RNAscope 小鼠

大鼠atoh1基因真核表达载体的构建及转染293T细胞的实验研究

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南方医科大学学报 2011年第7期31卷 1131-1137页

作者：郑国玺祝康朱珠侯瑾韦俊荣许珉西安交通大学医学院第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科病院陕西西安710004

目的利用基因工程方法克隆SD大鼠atoh1基因CDS,构建大鼠核转录因子atoh1的真核表达载体并在真核细胞中表达。方法从SD大鼠结肠粘膜提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增atoh1基因CDS区序列并TA克隆至PMD-19T载体中。测序鉴定后将atoh1基因连... 详细信息

目的利用基因工程方法克隆SD大鼠atoh1基因CDS,构建大鼠核转录因子atoh1的真核表达载体并在真核细胞中表达。方法从SD大鼠结肠粘膜提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增atoh1基因CDS区序列并TA克隆至PMD-19T载体中。测序鉴定后将atoh1基因连接于含有EGFP和内部核糖体转入位点(internal ribosome entrysite,IRES)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,对重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,荧光显微镜、PT-PCR和Western blot检测其在293T细胞中的表达。结果扩增得到大鼠atoh1CDS区长1056bp,编码351个氨基酸,与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基应为单核苷酸多态性(SNP),突变为无义突变,不影响蛋白表达。双酶切和测序结果证明atoh1已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,转染293T细胞48h后,荧光显微镜下观察到荧光蛋白的表达,PT-PCR和Western blot证实atoh1的mRNA和蛋白能在293T细胞中正确表达。结论成功构建了真核表达载体patoh1-IRES2-EGFP,并在293T细胞中成功表达,为进一步研究atoh1的功能、作用机制及感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。

关键词：感音神经性耳聋 atoh1 基因克隆真核表达载体

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atoh1相关的毛细胞再生新进展

中华耳科学杂志 2023年第2期21卷 250-253页

作者：刘宇昕段清川张杰国家儿童医学中心首都医科大学附属北京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科北京100045 儿童耳鼻咽喉头颈外科疾病北京市重点实验室北京100045

耳聋已成为全球主要的健康问题之一,越来越多的人受其困扰。听觉系统中耳蜗毛细胞扮演着重要角色,毛细胞损伤后不可自发再生,当毛细胞损伤或死亡累积到一定数量时,也就会导致永久性的感音神经性耳聋。一直以来毛细胞的损伤、生长发育、... 详细信息

耳聋已成为全球主要的健康问题之一,越来越多的人受其困扰。听觉系统中耳蜗毛细胞扮演着重要角色,毛细胞损伤后不可自发再生,当毛细胞损伤或死亡累积到一定数量时,也就会导致永久性的感音神经性耳聋。一直以来毛细胞的损伤、生长发育、再生机制是本领域的研究热点。atoh1基因过表达产生毛细胞样细胞,但还未能成功再生正常功能的毛细胞,atoh1与多基因联合表达是未来毛细胞再生研究的关键,本文就atoh1与其他基因共同表达时的毛细胞再生进展进行讨论。

关键词： atoh1 感应神经性耳聋毛细胞再生

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atoh1调控毛细胞再生与分化的研究进展

中华耳科学杂志 2023年第2期21卷 254-257页

作者：栾珺韩锋产滨州医学院生物化学与分子生物学教研室山东省医药卫生耳科遗传病重点实验室烟台264003

哺乳动物耳蜗毛细胞受损后无法再生,从而造成听力障碍。atoh1是bHLH转录因子家族中的一员,是正性调控毛细胞再生与分化的关键因子之一。研究发现,atoh1可与其上游调控基因(Eya1、Six1、Sox2)和下游调节基因(Gfi,Pou4f3,Barhl1)协同作用... 详细信息

哺乳动物耳蜗毛细胞受损后无法再生,从而造成听力障碍。atoh1是bHLH转录因子家族中的一员,是正性调控毛细胞再生与分化的关键因子之一。研究发现,atoh1可与其上游调控基因(Eya1、Six1、Sox2)和下游调节基因(Gfi,Pou4f3,Barhl1)协同作用,调节多种细胞信号转导通路(如Notch,Wnt/β-catenin,SHH,FGF等),诱导耳蜗毛细胞再生。干细胞具有分化成毛细胞样细胞的潜能,该过程依赖atoh1的表达。因此,调控atoh1依赖性耳祖细胞或干细胞的定向分化,将为毛细胞损害的临床治疗提供新途径。

关键词： atoh1 信号转导毛细胞再生干细胞听力障碍

大鼠atoh1真核表达载体patoh1-IRES2-EGFP的构建及转染293T细胞的研究

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临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 2011年第16期25卷 751-755页

作者：郑国玺朱珠祝康侯瑾韦俊荣许珉西安交通大学医学院第二附属医院耳鼻咽喉头颈外病院西安710004

目的:利用基因工程方法克隆SD大鼠atoh1基因编码区序列,构建atoh1的真核表达载体pA-toh1-IRES2-EGFP,并验证其在293T细胞中的表达。方法:通过RT-PCR从SD大鼠结肠组织内扩增出atoh1基因全长CDS序列,并TA克隆于PMD-19T载体中。纯化回收的... 详细信息

目的:利用基因工程方法克隆SD大鼠atoh1基因编码区序列,构建atoh1的真核表达载体pA-toh1-IRES2-EGFP,并验证其在293T细胞中的表达。方法:通过RT-PCR从SD大鼠结肠组织内扩增出atoh1基因全长CDS序列,并TA克隆于PMD-19T载体中。纯化回收的目的片段测序后连接于真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,构建patoh1-IRES2-EGFP真核表达载体。再次测序后脂质体介导重组质粒转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:测序后将扩增得到的大鼠atoh1CDS序列与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基应为单核苷酸多态性,突变为无义突变,不影响蛋白表达。双酶切和测序结果证明atoh1已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,重组质粒转染293T细胞24h后荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达。结论:获得正确atoh1编码序列,真核表达载体patoh1-IRES2-EGFP构建成功并可以在293T细胞中表达,为进一步对感音神经性聋的基因治疗奠定了基础。

关键词：听觉丧失感音神经性 atoh1 基因克隆真核表达载体

SD大鼠atoh1基因CDS区的克隆及序列分析

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西安交通大学学报（医学版） 2011年第4期32卷 466-469页

作者：郑国玺祝康朱珠侯瑾韦俊荣许珉西安交通大学医学院第二附属医院耳鼻喉病院陕西西安710004

目的利用基因工程方法克隆SD大鼠atoh1 cDNA编码序列并测定分析其克隆序列。方法采用非对称互补引物/模板法,制备atoh1 cDNA的编码序列,将其克隆入PMD-19T载体中并测序。结果经酶切鉴定、测序分析表明,扩增得到的大鼠atoh1基因CDS区全长... 详细信息

目的利用基因工程方法克隆SD大鼠atoh1 cDNA编码序列并测定分析其克隆序列。方法采用非对称互补引物/模板法,制备atoh1 cDNA的编码序列,将其克隆入PMD-19T载体中并测序。结果经酶切鉴定、测序分析表明,扩增得到的大鼠atoh1基因CDS区全长为1 056 bp,编码351个氨基酸;测定序列与GenBank中公布的参考序列对比,有2处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致。这两处碱基应为单核苷酸多态性(SNP)位点,突变为无义突变,不影响蛋白的表达。结论成功克隆了atoh1 cDNA编码序列,为进一步对感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。

关键词：感音神经性耳聋 atoh1 基因克隆耳蜗毛细胞

Ad5-atoh1/EGFP在体诱导近成年豚鼠耳蜗产生毛细胞样细胞

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临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 2012年第10期26卷 463-465页

作者：韩朝丛宁杨娟梅黄一波靳楷李雯复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻咽候头颈外科上海200031 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院中心实验室

目的:在近成年豚鼠耳蜗内携带atoh1/EGFP基因的腺病毒是否能够将基膜上残留的支持细胞转分化为新的毛细胞。方法:选用体重在200～250g的健康花豚鼠12只,将构建同时表达atoh1和EGFP基因的E1/E3区缺失的人类免疫5型腺病毒5μl,通过耳蜗侧... 详细信息

目的:在近成年豚鼠耳蜗内携带atoh1/EGFP基因的腺病毒是否能够将基膜上残留的支持细胞转分化为新的毛细胞。方法:选用体重在200～250g的健康花豚鼠12只,将构建同时表达atoh1和EGFP基因的E1/E3区缺失的人类免疫5型腺病毒5μl,通过耳蜗侧壁打孔灌注导入中阶内淋巴系统。其中6只于灌注2周后处死,6只灌注4周后处死,基膜铺片观察EGFP、毛细胞标记物myosinⅦa和Dapi核染色情况。结果:灌注2周处死的6只豚鼠中有2只在基膜外毛细胞外区域发现有散在的细胞核大、细胞体梭形的、表达EGFP的新生细胞。灌注4周的动物中有3只在基膜原外毛细胞位置和外毛细胞外区域发现有相似的同时表达EGFP和Myo-sinⅦa的新生细胞。结论:atoh1基因可以在近成年豚鼠体内将部分支持细胞转分化为毛细胞样细胞。这部分支持细胞位于外毛细胞位置和外毛细胞外区域的基膜上。

关键词：腺病毒 atoh1 豚鼠毛细胞转分化

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atoh1抑制结直肠癌侵袭迁移及机制研究

ATOH1抑制结直肠癌侵袭迁移及机制研究

作者：贾慧彪中国医科大学

学位级别：硕士

目的:atoh1在结直肠癌中起重要作用,本研究的目的是验证atoh1与结直肠癌EMT之间的关系,并阐明其潜在机制。方法:选择2019年1月-2022年6月在中国医科大学附属第一医院胃肠外科疝进行治疗的结肠癌患者87例作为研究对象,对87对结直肠癌标... 详细信息

目的:atoh1在结直肠癌中起重要作用,本研究的目的是验证atoh1与结直肠癌EMT之间的关系,并阐明其潜在机制。方法:选择2019年1月-2022年6月在中国医科大学附属第一医院胃肠外科疝进行治疗的结肠癌患者87例作为研究对象,对87对结直肠癌标本及其癌旁组织进行q RT-PCR检测,从RNA水平验证atoh1在结直肠癌中的表达。然后我们对31对结直肠癌组织及癌旁组织进行Western blot检测,对87例结直肠癌标本进行免疫组化检测,从蛋白水平上验证atoh1在结直肠癌中的表达。接下来,我们过表达或敲除atoh1,观察其对结直肠癌细胞侵袭迁移能力的影响以及下游蛋白的变化。然后,我们用TGFB1刺激结直肠癌细胞,检测atoh1的表达,探讨atoh1对EMT的影响是否TGFB依赖性。最后,通过种植肿瘤细胞在裸鼠身上,观察atoh1的改变对小鼠肿瘤肝转移的影响。结果:在mRNA水平上,atoh1在结直肠癌组织中的表达明显低于正常结直肠组织(p1)。在蛋白水平上,atoh1在结直肠癌组织中的表达明显低于癌旁组织(p=0.0398),atoh1低表达预后较差。此外,结果显示atoh1可以抑制结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力。同时,atoh1对Snail2和ZEB1蛋白的表达有负向调控作用。过表达实验结果表明,过表达atoh1抑制了ZEB1/Snail2的表达。TGFB刺激后atoh1表达下调,提示atoh1对EMT的影响是TGFB依赖性的。敲除atoh1的肿瘤细胞注射小鼠体内后,肝转移肿瘤显著增多增大。而过表达atoh1的小鼠体内肝转移肿瘤显著减少。结论:atoh1在结直肠癌组织中显著下调,抑制了结直肠癌细胞的侵袭迁移能力。它还与结直肠癌的不良预后有关。此外,atoh1通过调节TGFB依赖的ZEB1/Snail2通路影响结直肠癌的上皮-间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)。

关键词： atoh1 EMT CRC ZEB-1 Vimentin