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雌激素对去卵巢大鼠骨组织自噬相关基因表达的影响

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雌激素对去卵巢大鼠骨组织自噬相关基因表达的影响

作者：罗松福建医科大学

学位级别：硕士

目的:1、观察雌激素对去卵巢大鼠骨密度的影响;2、观察雌激素对去卵巢大鼠胫骨atg5、atg7、Ulk1和p62 m RNA表达的影响,探究雌激素是否改变大鼠自噬水平从而影响大鼠骨量。方法:将27只6月龄,体重约250±20g的SD(Sprague-Dawley)雌性大... 详细信息

目的:1、观察雌激素对去卵巢大鼠骨密度的影响;2、观察雌激素对去卵巢大鼠胫骨atg5、atg7、Ulk1和p62 m RNA表达的影响,探究雌激素是否改变大鼠自噬水平从而影响大鼠骨量。方法:将27只6月龄,体重约250±20g的SD(Sprague-Dawley)雌性大鼠随机分为去卵巢组18只及假手术组(Sham)9只,去卵巢组再随机平均分为单纯去卵巢组(OVX)和雌激素干预组(E2)。雌激素组(E2)每周用雌二醇0.1mg/kg肌肉注射;去卵巢组(OVX)与假手术组(Sham)每周等量生理盐水肌肉注射。干预24周。每组随机选取三只大鼠于干预前、干预后采用双能X线测量骨密度,同时于干预后取左侧胫骨骨组织制作HE染色病理切片,于光学显微镜下观察并用图像分析软件统计各组骨量;各组剩余6只大鼠,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR法)检测左侧胫骨骨组织atg5、atg7、Ulk1和p62 m RNA表达水平并进行统计比较。结果:1、干预前,各组大鼠体重及骨密度均无明显差异(P>0.05)。干预六个月后,各组大鼠的体重均明显增加,OVX组体重升高更显著(P0.05)。2、干预前,各组大鼠全身BMD无明显差异(P>0.05)。干预六个月后,OVX组大鼠全身BMD显著低于Sham组、E2组大鼠(P0.05)。而在显微镜下观察骨组织HE染色病理切片发现Sham组及E2组骨小梁致密程度明显优于OVX组,Sham组与E2组差异不明显。图像分析各组骨小梁面积占骨髓腔比例提示,OVX组明显低于Sham组与E2组(Patg5、Ulk1 m RNA表达量较Sham组、E2组显著升高(patg7 m RNA表达量较Sham组、E2组增高,且有统计学意义(P0.05)。E2组与Sham组之间的对照,atg5、atg7、Ulk1与p62 m RNA的表达量差别均无统计学意义(P>0.05)。结论:1、建立去卵巢大鼠骨质疏松模型成功;2、去卵巢大鼠体内自噬水平升高,雌激素逆转升高的自噬水平,改善骨质疏松。

关键词：雌激素骨质疏松自噬骨密度 atg5 atg7 Ulk1 p62

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新风胶囊治疗大鼠骨关节炎

中成药 2015年第10期37卷 2114-2120页

作者：阮丽萍刘健王亚黎叶文芳万磊安徽中医药大学研究生部安徽合肥230038 安徽中医药大学第一附属医院安徽合肥230031

目的主要观察新风胶囊(黄芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣)对骨关节炎大鼠外周血免疫球蛋白IgG1、IgG2α及细胞因子IL-4、TNF-α,软骨、胸腺、脾脏自噬基因(atg5、atg7、atg12)的表达的影响。方法大鼠随机设正常对照组和模型对照组(均予生理盐... 详细信息

目的主要观察新风胶囊(黄芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣)对骨关节炎大鼠外周血免疫球蛋白IgG1、IgG2α及细胞因子IL-4、TNF-α,软骨、胸腺、脾脏自噬基因(atg5、atg7、atg12)的表达的影响。方法大鼠随机设正常对照组和模型对照组(均予生理盐水)、氨基葡萄糖对照组,以及新风胶囊组,每组10只。除正常对照组外,采用关节腔注射木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸方法制成骨关节炎大鼠模型,造模后第14天给药30 d。以光镜对大鼠软骨进行Mankin标准评分;采用ELISA法检测血清细胞因子IgG1、IgG2α、IL-4,和TNF-α;采用RT-PCR对骨关节炎大鼠软骨、胸腺、脾脏中的自噬相关基因atg5、atg7和atg12进行检测。结果给药后,与正常组比较,模型组体质量明显下降,Mankin评分明显升高,血清IgG1、IgG2α、TNF-α升高,IL-4降低,在胸腺、脾脏、软骨等各组织中,atg存在不同程度的降低(Patg5、atg7、atg12升高(P<0.01或P<0.05)。结论新风胶囊可以抑制炎症反应,调节大鼠整体自噬水平,达到治疗骨关节炎。

关键词：膝骨关节炎新风胶囊免疫球蛋白 IgG1 IgG2α IL-4 TNF-α 自噬基因 atg5 atg7 atg12

津力达颗粒联合通心络胶囊对2型糖尿病大鼠胰腺组织自噬的影响

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中国实验方剂学杂志 2015年第23期21卷 92-96页

作者：孙颖金鑫郭勇英刘红利崔雯雯魏聪南京中医药大学南京210046 黑龙江中医药大学哈尔滨150000 河北医科大学石家庄050017 河北以岭医药研究院石家庄050035 国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病) 石家庄050035 河北省络病重点实验室石家庄050035

目的:观察中药复方津力达颗粒联合通心络胶囊对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠胰岛β细胞超微结构损伤情况、胰岛β细胞功能及胰腺组织自噬相关蛋白Beclin-1,atg7,p62表达的影响。方法:采用高脂喂养结合小剂量链脲佐菌素... 详细信息

目的:观察中药复方津力达颗粒联合通心络胶囊对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠胰岛β细胞超微结构损伤情况、胰岛β细胞功能及胰腺组织自噬相关蛋白Beclin-1,atg7,p62表达的影响。方法:采用高脂喂养结合小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)30 mg·kg-1ip建立T2DM大鼠模型,15只雄性SD大鼠设为正常组正常饲料喂养,75只雄性SD大鼠高脂饲料喂养6周后STZ腹腔注射,根据血糖随机分为:模型组,津力达组(JLD),通心络胶囊组(TXL),联合用药组(JT),吡格列酮组(PLZ),JLD组于模型成功后给予津力达颗粒(3.0 g·kg-1·d-1),TXL组于模型成功后给予通心络胶囊(0.4 g·kg-1·d-1),JT组于模型成功后给予津力达颗粒(3.0 g·kg-1·d-1)加通心络胶囊(0.4 g·kg-1·d-1),PLZ组于模型成功后给予吡格列酮(10 mg·kg-1·d-1),连续ig 6周后,检测空腹血糖及血清胰岛素以计算胰岛β细胞功能指数,电镜观察各组大鼠胰岛β细胞超微结构;Western blot方法检测胰腺组织Beclin-1,atg7,p62蛋白的表达变化。结果:与正常组相比较,模型组大鼠胰岛β细胞损伤减轻,胰岛β细胞功能指数明显降低,胰腺组织Beclin-1,atg7蛋白表达明显减少,p62蛋白表达明显增加(Patg7表达升高,p62蛋白表达减少(Patg7表达升高,p62蛋白表达减少(P<0.05)。结论:津力达颗粒联合通心络胶囊可以提高胰岛β细胞功能指数,其作用可能与促进胰岛自噬有关,而维持胰腺组织自噬水平可能是延缓糖尿病进展的有效措施。

关键词：津力达颗粒通心络胶囊胰岛β细胞胰腺自噬 Beclin-1 atg7 p62

宿主因子HSF1调控流感病毒复制的作用机制研究

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宿主因子HSF1调控流感病毒复制的作用机制研究

作者：钟颖媛南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景:季节性流感是一种在全球范围内肆虐且容易在人际间传播的急性病毒感染。由于目前临床上的抗流感药物主要靶向于病毒蛋白,且流感病毒耐药株的频繁出现,限制了抗流感药物的研究和疗效。宿主与病毒之间关系密不可分,于是研究人员... 详细信息

研究背景:季节性流感是一种在全球范围内肆虐且容易在人际间传播的急性病毒感染。由于目前临床上的抗流感药物主要靶向于病毒蛋白,且流感病毒耐药株的频繁出现,限制了抗流感药物的研究和疗效。宿主与病毒之间关系密不可分,于是研究人员提出了靶向宿主的抗流感策略。流感病毒进入靶细胞和进行复制的过程,都需要细胞中的大量的宿主因子的协助。高热是流感常见的症状,在高温的情况下,往往会激起机体的热休克反应,而热休克因子1(HSF1)是参与热休克反应的主要因子。通过查阅文献发现,HSF1是重要的调控转录的宿主因子,能够调节各种细胞功能以对抗多种外界刺激,如热刺激、化学刺激、病毒感染等等。HSF1不仅在热休克反应中发挥功能,而且在衰老和疾病中都具有多种作用。研究已经发现HSF1与HIV病毒潜伏,登革热病毒以及其他RNA病毒的复制有关。因此,我们猜测HSF1是否会通过调控各种细胞功能,从而参与甲型流感病毒的复制过程。研究目的:本课题选用HSF1作为研究对象,探究宿主因子HSF1对甲型流感病毒复制的影响,并进一步阐明HSF1在病毒感染中的机制,为寻找新的抗病毒靶点提供依据和思路,致力于寻找新靶点以对抗流感病毒。实验方法:1.通过CRISPR-Cas9基因敲除技术、高速流式细胞分离技术并用嘌呤霉素筛选细胞,构建稳定敲除HSF1的A549细胞株。2.运用Western blotting、qRT-PCR、空斑实验以及间接免疫荧光实验检测HSF1对流感病毒感染的调控作用。3.采用Mini-replicon实验、Time-of-addition实验检测HSF1对流感病毒的复制阶段的影响。实验结果:1.流感病毒感染细胞后,细胞内的HSF1 326位上磷酸化蛋白随着感染时间延长,其表达出现上调趋势。但是,HSF1总蛋白以及mRNA水平上的表达并没有明显变化。2.细胞沉默HSF1后,流感病毒NP蛋白的表达呈现下调趋势,同时,子代病毒的释放减少。细胞被热激后或过表达HSF1后,子代流感病毒的释放增加。3.使用HSF1抑制剂后,流感病毒蛋白的表达呈现下调趋势,同时,子代病毒的释放减少。4.在病毒感染后2-5小时使用HSF1抑制剂,可以明显抑制NP蛋白的表达。也可以抑制流感病毒核糖核蛋白复合物vRNP的活性且抑制早期vRNA、cRNA和mRNA的合成。***1抑制剂降低了流感病毒和雷帕霉素导致的细胞自噬,同时也降低了自噬相关基因atg7的表达,敲低atg7可以减少流感病毒的复制。结论:1.流感病毒可以激活细胞中的HSF1的表达。2.内源性HSF1对流感病毒的感染具有调控作用。***1抑制剂可以抑制流感病毒的复制。***1影响流感病毒复制的早期阶段,并且调控vRNP活性,从而影响cRNA、vRNA和mRNA的早期合成。***1抑制剂可以通过调控自噬相关基因atg7来降低流感病毒导致的细胞自噬,从而抑制病毒的复制。

关键词： HSF1 宿主因子甲型流感病毒 vRNP 自噬 atg7

MicroRNA-210在退变椎间盘中高表达抑制髓核细胞自噬

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MicroRNA-210在退变椎间盘中高表达抑制髓核细胞自噬

作者：杜世也中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

第一部分:人退变椎间盘组织中自噬水平以及microRNA-210表达水平的改变目的:提取椎间盘退变(IDD)病人和腰椎骨折病人椎间盘组织髓核细胞作为病例组和对照组,研究退变椎间盘组织中髓核细胞自噬水平以及microRNA-210表达水平的改变。方法... 详细信息

第一部分:人退变椎间盘组织中自噬水平以及microRNA-210表达水平的改变目的:提取椎间盘退变(IDD)病人和腰椎骨折病人椎间盘组织髓核细胞作为病例组和对照组,研究退变椎间盘组织中髓核细胞自噬水平以及microRNA-210表达水平的改变。方法:随机选取腰椎骨折病人6例(5男1女,平均年龄22.2岁,年龄段分布18-25岁)作为对照组,椎间盘退变病人24例(16男8女,平均年龄51.4岁,年龄段分布39-60岁)作为病例组。提取髓核细胞,western blot检测病例组和对照组髓核细胞LC3Ⅱ/Ⅰ,Beclin-1表达量;qRT PCR分别测定病例组和对照组髓核细胞microRNA-210表达量。结果:western blot检测结果病例组(椎间盘退变病人)比对照组(腰椎骨折病人)髓核细胞LC3Ⅱ/Ⅰ,Beclin-1表达量明显降低;MDC染色显示病例组自噬水平低于对照组;qRT PCR测定结果病例组(椎间盘退变病人)比对照组(腰椎骨折病人)髓核细胞microRNA-210表达量明显升高(1.01±0.11比0.64±0.11,t=8.239,Patg7为micro RNA-210的靶基因并参与退变髓核细胞外基质代谢目的:验证micro RNA-210直接与靶基因atg7的3’UTR结合;atg7参与退变髓核细胞外基质代谢。方法:(1)通过Target Scan预测分析micro RNA-210可能的靶基因及存在的结合位点。构建具有micro RNA-210预测结合位点的野生型双荧光素酶报告质粒和突变型双荧光素酶报告质粒,将micro RNA-210 mimic,micro RNA-210 inhibitor,mimic control,inhibitor control转染到退变椎间盘髓核细胞中,双荧光素酶检测系统检测荧光活性。(2)将atg7 si RNA和micro RNA-210 inhibitor转染髓核细胞,分四组:A组.micro RNA-210 inhibitor(-),atg7 si RNA(-);B组.micro RNA-210 inhibitor(-),atg7 si RNA(+);C组.micro RNA-210 inhibitor(+),atg7 si R

关键词：椎间盘退变髓核细胞自噬 microRNA-210 micro RNA-210 髓核细胞自噬细胞外基质代谢 micro RNA-210 atg7 髓核细胞外基质降解

运动对骨骼肌氧化应激及自噬相关基因表达的影响

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运动对骨骼肌氧化应激及自噬相关基因表达的影响

作者：钱帅伟华东师范大学

学位级别：硕士

氧化应激是由细胞内源性氧化系统不能有效清除大量产生的自由基,氧化系统和抗氧化系统之间的动态平衡被打破,自由基在体内大量聚集所引起的。氧化应激能使线粒体DNA损伤、脂质过氧化、线粒体ATP和Ca2+含量下降、线粒体肿胀,从而导致线... 详细信息

氧化应激是由细胞内源性氧化系统不能有效清除大量产生的自由基,氧化系统和抗氧化系统之间的动态平衡被打破,自由基在体内大量聚集所引起的。氧化应激能使线粒体DNA损伤、脂质过氧化、线粒体ATP和Ca2+含量下降、线粒体肿胀,从而导致线粒体损伤。线粒体损伤则引起自噬、自噬性细胞死亡（Ⅱ型程序性细胞死亡）、凋亡和坏死。细胞自噬是真核细胞中普遍存在的一种生命现象,是将胞内变形、损伤、衰老或非功能性蛋白质和细胞器运送到溶酶体中形成自噬溶酶体,降解内容物,实现自身代谢需要和物质再度更新的过程。细胞自噬不仅参与细胞程序性死亡、先天性免疫、发育、分化等生理进程,还与肿瘤的发生发展、心血管系统疾病、神经退行性变、提前衰老等病理进程密切相关。当细胞遭受运动刺激、能量缺乏、氧化应激、损伤等刺激,抑或胞内损伤性细胞器、非功能蛋白质大量积累时,都能改变细胞自噬水平。自噬相关基因（atg）是自噬发生阶段的特异性基因。目前已经鉴定出了30多种与自噬相关的特异性基因,其中atg7、atg9、Beclin1（?）LC-3是自噬发生过程中非常关键的基因。近几年来,人们对骨骼肌细胞自噬分子机制的相关研究越来越深入,在该领域取得了丰硕的研究成果。通过运动干预的方式探索氧化应激对骨骼肌自噬的影响机理将为今后预防或减轻各种自噬相关疾病以及合理安排运动训练的强度和时间提供理论依据。目的：通过建立递增负荷运动及其恢复过程的时相模型,检测ICR小鼠骨骼肌氧化应激情况以及atg1、atg9、Beclin1和LC-3等自噬关键基因表达水平的时相性变化,探究递增负荷运动诱导的骨骼肌氧化应激与细胞自噬的相关性,阐述递增负荷运动对骨骼肌自噬的影响机理。希望通过探求适宜的运动强度和运动时间从而适度调节细胞自噬水平,为我们今后合理的安排运动训练的强度和时间提供理论依据。方法：将80只健康雄性ICR小鼠,7-8周龄,体重19-21g左右随机分为10组,每组8只。分别为：安静对照组（R）、递增负荷运动45min（E45）、90min（E90）、120min（E120）、150min（E150）组以及递增负荷运动150min后恢复3h（ER3）、6h（ER6）、12h（ER12）、18h（ER18）、24h（ER24）组。小鼠进行适应性跑台训练,坡度为0°,速度0.8km/h,持续时间5min,共训练3天。正式训练按照以下程序进行：第1级负荷：lkm/h,15min;第2级负荷：1.2km/h,15min;第3级负荷：1.3-1.5km/h,各组分别运动至相应时间。酶标仪测定骨骼肌MDA含量、SOD活性和H202浓度变化并进行比较分析。Real-time PCR测定小鼠骨骼肌自噬相关基因atg7、atg9、Beclinl和LC-3mRNA相对表达量。结果：①骨骼肌MDA含量和H202浓度均在递增负荷运动的早期阶段急剧上升并达到一定的峰值,在递增负荷运动的晚期阶段又开始稳步下降,一直延续到运动结束;在递增负荷运动的恢复期阶段,骨骼肌MDA和H2O2首先维持这种低浓度态势,随后又有所升高,最后稳定在一定的水平。②骨骼肌SOD活性在递增负荷运动的早期阶段急剧下降,但在递增负荷运动的晚期阶段又略微上升;在递增负荷运动恢复期的早期阶段,骨骼肌SOD活性急剧上升,随后又有所下降,最后稳定在一定的水平。③骨骼肌atg7、atg9、Beclinl和LC-3mRNA相对表达量在递增负荷运动的早期阶段急剧上升并达到一定的峰值,在递增负荷运动的晚期阶段各自噬相关基因相对表达量又呈现出稳步下降的态势。④骨骼肌自噬相关基因atg7、atg9、Beclinl和LC-3mRNA相对表达量在递增负荷运动恢复过程的早期阶段虽然依旧呈现较低水平,但却始终存在稳步上升的态势,一直到递增负荷运动恢复过程的晚期阶段才稳定于一定的水平。结论：①骨骼肌氧化应激水平在递增负荷运动的早期阶段急剧上升,到达一定水平后又开始稳步下降;在递增负荷运动的恢复期阶段,骨骼肌氧化应激水平首先维持这种较低态势,之后又有所回升,最终稳定在一定的水平。②骨骼肌自噬水平在递增负荷运动的早期阶段急剧上升并达到一定的峰值,在递增负荷运动的晚期阶段又呈现出稳步下降的态势。③骨骼肌自噬水平在递增负荷运动恢复过程的早期阶段虽然依旧呈现较低状态,但却始终存在稳步上升的态势,一直到递增负荷运动恢复过程的晚期阶段,骨骼肌自噬水平才趋于稳定。④骨骼肌自噬水平的时相性变化与骨骼肌氧化应激水平的时相性变化具有同步性。

关键词：骨骼肌氧化应激细胞白噬 MDA SOD H2O2 LC-3 Beclin1 atg7 atg9 递增负荷运动不同时相动物实验

LncRNA HULC调节自噬在肝细胞癌侵袭转移中的作用

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LncRNA HULC调节自噬在肝细胞癌侵袭转移中的作用

作者：王振天津医科大学

学位级别：硕士

目的:探索Lnc RNA HULC调节自噬对肝癌细胞侵袭转移的作用。方法:HULC si RNA转染肝癌细胞系SMMC-7721、Huh-6降低HULC的表达。GFP-RFP-LC3双标腺病毒检测自噬活性变化;Western blot检测肝癌细胞atg7、p62、LC3、E-cadherin和β-Catenin的表达水平。饥饿处理诱导低表达HULC的肝癌细胞自噬活性增强,Western blot和细胞免疫荧光检测肝癌细胞E-cadherin、β-Catenin、Vimentin和MMP2的表达水平;Transwell检测其侵袭转移能力。免疫组化检测HULC（L）组和HULC（H）组中atg7、E-cadherin和N-cadherin的表达情况。q RT-PCR检测临床标本中HULC、mi R-137和atg7 m RNA的表达和相关性;验证Lnc RNA HULC通过ce RNA作用特异性结合mi R-137。q RT-PCR和Western blot验证mi R-137靶向调控atg7,影响肝癌细胞自噬活性和上皮间质转化。裸鼠皮下移植瘤模型观察肿瘤生长情况;PCR检测两组皮下移植瘤中HULC和mi R-137表达水平;Western blot检测atg7、p62、LC3表达水平。免疫组化检测两组皮下移植瘤Ki67、N-cadherin和atg7表达及分布情况。原位移植瘤模型HE染色观察两组移植瘤肝内转移情况;免疫组化检测原位移植瘤Vimentin和atg7表达及分布情况。结果:在肝癌细胞系SMMC-7721、Huh-6中敲低HULC的表达后,atg7表达及自噬活性降低,同时上皮间质转化能力降低。饥饿处理低表达HULC的肝癌细胞后,自噬活性和侵袭转移能力增强。临床标本检测中,HULC与atg7表达正相关,与mi R-137表达负相关;HULC（H）组较HULC（L）组相比,atg7和N-cadherin表达增加,E-cadherin表达降低。肝癌细胞系中敲低HULC表达,mi R-137表达量增加;转染mi R-137 mimics后,HULC表达量降低;转染mi R-137 inhbitor后,HULC表达量增加。q RT-PCR和Western blot检测结果显示mi R-137负性调控atg7,抑制肝癌细胞自噬活性和N-cadherin的表达。裸鼠皮下移植瘤模型结果显示敲低HULC抑制皮下移植瘤的生长;q RT-PCR检测mi R-137表达增加,atg7m RNA表达降低;Western blot检测自噬水平降低。免疫组化结果显示实验组Ki67、atg7和N-cadherin表达降低。原位移植瘤模型结果显示降低HULC的表达,肿瘤肝内转移能力降低。免疫组化结果显示实验组atg7和Vimentin表达降低。结论:Lnc RNA HULC通过ce RNA作用特异性结合mi R-137,减弱其对atg7的抑制作用,提高肝癌细胞自噬活性,进而促进肝细胞癌的侵袭转移。

关键词： LncRNA HULC 自噬 atg7 上皮间质转化肝细胞癌

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PPARδ抑制肿瘤细胞自噬机制

PPARδ抑制肿瘤细胞自噬机制

作者：江毅丹江苏大学

学位级别：硕士

背景:过氧化物酶体增殖物激活受体家族(PPARs)包括PPARα、PPARγ、PPARδ。PPARs是细胞核受体转录子,PPARs与视黄醇类X受体(RXRs)形成二聚体(PPARs/RXRs),随后结合在靶基因启动子上并调控基因的表达。大量研究表明,PPARδ异常表达或激... 详细信息

背景:过氧化物酶体增殖物激活受体家族(PPARs)包括PPARα、PPARγ、PPARδ。PPARs是细胞核受体转录子,PPARs与视黄醇类X受体(RXRs)形成二聚体(PPARs/RXRs),随后结合在靶基因启动子上并调控基因的表达。大量研究表明,PPARδ异常表达或激活促进炎症、代谢及肿瘤发生。我们课题组以前的研究表明,PPARδ过表达或激活促进肿瘤细胞代谢,增强肠道炎-癌转化。此外,虽然我们之前的研究表明PPARα促进肿瘤细胞自噬,增强肿瘤细胞化疗药物敏感性,但是PPARδ对肿瘤细胞自噬的影响目前尚不清楚。自噬是细胞内重要的催化降解过程,其通过溶酶体降解细胞内大分子物质(蛋白质、脂类等)或细胞器(线粒体、细胞核等)。在自噬形成过程中,自噬相关蛋白7(atg7)发挥了重要的作用。基于此,本课题将揭示PPARδ与atg7的相关性及其对肿瘤细胞自噬的影响机制。方法:利用CRISPR/Cas9方法建立了PPARδ基因敲除SW480细胞系;构建PPARδsh RNA质粒及PPARδ质粒并转染细胞;利用Western blot分析相关蛋白的表达水平;利用免疫荧光分析细胞内自噬体形成;利用荧光定量PCR分析相关基因的表达水平;建立异植瘤模型(Xenograft)分析PPARδ过表达或激活条件下对肿瘤生长的影响。结果:Western blot和免疫荧光分析结果表明,PPARδ基因敲除或沉默增加肿瘤细胞自噬相关蛋白LC3-II的积累和自噬体的形成,与此相反,PPARδ过表达抑制这一现象。荧光定量PCR分析结果表明,PPARδ过表达抑制atg7基因表达,进而降低atg7蛋白水平,与此相反,PPARδ基因敲除或沉默逆转这一现象。异植瘤裸鼠模型分析表明,PPARδ过表达显著促进肿瘤生长,且Western blot分析表明PPARδ显著降低肿瘤组织atg7蛋白水平及减少LC3-II的积累。此外,PPARδ激活子GW501516降低肿瘤细胞atg7表达及减少LC3-II的积累,进一步分析表明,GW501516显著促进肿瘤生长,且Western blot分析表明激活子降低肿瘤组织中atg7蛋白表达和LC3-II的积累。结论:PPARδ抑制atg7基因和蛋白的表达,从而抑制自噬形成;此外,PPARδ促进肿瘤生长与抑制肿瘤细胞自噬相关。进一步分析表明,PPARδ激活子GW501516促进肿瘤生长并抑制肿瘤细胞自噬形成。

关键词： PPARδ atg7 自噬激活子肿瘤生长

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miR-210在食管鳞癌发生中的功能研究

miR-210在食管鳞癌发生中的功能研究

作者：杨万里中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

[背景]食管癌是全球第七大常见恶性肿瘤,也是第六大癌症致死病因。目前,全世界约有超过57万的食管癌患者,其发病率仍在逐年上升。由于缺乏有效的早诊及治疗手段,其五年生存率极低。因此,发现新的早诊标志物分子、建立有效的治疗策略、... 详细信息

[背景]食管癌是全球第七大常见恶性肿瘤,也是第六大癌症致死病因。目前,全世界约有超过57万的食管癌患者,其发病率仍在逐年上升。由于缺乏有效的早诊及治疗手段,其五年生存率极低。因此,发现新的早诊标志物分子、建立有效的治疗策略、提高患者的生存质量是食管癌研究领域迫切需要解决的问题。microRNAs(miRNAs)是一类长度为18-25个核苷酸的非编码小RNA。miRNAs通过抑制下游靶分子的翻译进而发挥其功能,这一过程在细胞的生理及病理过程中发挥着重要作用。前期,课题组检测了25例食管鳞癌患者的癌组织及癌旁组织中miR-210的表达水平,发现miR-210在食管鳞癌组织中表达降低,且低表达miR-210的食管鳞癌患者临床预后较差。但miR-210在食管鳞癌中的具体作用及分子机制尚不明确,本课题将对此展开深入研究。[目的]1.检测miR-210在食管鳞癌组织和细胞中的表达水平。2.探究miR-210对食管鳞癌恶性表型的影响。3.探讨miR-210影响食管鳞癌发生发展的分子机制。[方法]***检测miR-210在食管鳞癌细胞及组织中的表达。2.构建miR-210的过表达和低表达慢病毒载体,合成miR-210 mimic和inhibitor。分别通过稳定转染或瞬时转染建立miR-210过表达和低表达的细胞模型及相应的对照细胞模型。3.通过CCK-8实验及平板克隆形成实验研究miR-210对食管鳞癌细胞增殖的影响;运用流式细胞仪检测miR-210对食管鳞癌细胞周期和细胞凋亡的影响;利用Transwell实验观察miR-210对食管鳞癌细胞侵袭和迁移的影响;通过裸鼠成瘤实验和裸鼠尾静脉转移实验观察miR-210对食管鳞癌细胞体内成瘤能力及体内转移能力的影响。4.联合生物信息学分析与全基因组表达谱芯片筛选miR-210的下游靶基因;通过qPCR、Western Blot及双荧光素酶报告基因实验验证miR-210的下游靶基因。5.探究miR-210调控食管鳞癌转移的相关分子机制。[结果]1.与正常食管上皮细胞系Het-1A相比,miR-210在食管鳞癌细胞系中低表达;与癌旁组织相比,miR-210在食管鳞癌组织中的表达降低。2.成功建立了过表达和低表达miR-210的食管鳞癌细胞模型。CCK-8实验及平板克隆形成实验表明miR-210能够抑制食管鳞癌细胞的体外增殖及克隆形成能力;Transwell实验表明miR-210能够抑制食管鳞癌细胞的体外侵袭和迁移能力;流式细胞检测发现miR-210可促进化疗药物ADR或VCR诱导的食管鳞癌细胞凋亡;同时,miR-210可抑制细胞周期进展;裸鼠成瘤实验及裸鼠尾静脉转移实验表明miR-210可抑制食管鳞癌细胞的体内生长及转移能力。3.通过基因芯片、生物信息学分析、qPCR、Western Blot、报告基因实验等方法证实atg7为miR-210的下游直接靶基因。4.通过功能实验及分子生物学实验等证实miR-210可以通过抑制atg7进而抑制自噬发生。通过挽救实验和机制研究发现miR-210可通过atg7/Wnt/β-catenin通路抑制食管鳞癌的侵袭和转移。[结论]本研究明确了miR-210在食管鳞癌细胞和组织中处于低表达水平,提示miR-210表达降低可能与食管鳞癌的发生发展相关。此外,我们研究了miR-210在调控食管鳞癌恶性表型中所发挥的功能,结果表明miR-210在食管鳞癌中起到抑制细胞增殖、抑制细胞侵袭转移、促进化疗药物诱导的细胞凋亡等作用。同时,我们还发现miR-210对食管鳞癌细胞自噬具有调控作用,研究结果表明miR-210可以通过抑制atg7表达进而抑制细胞自噬。最后,本研究提出并阐明miR-210可通过atg7/Wnt/β-catenin通路抑制食管鳞癌的侵袭转移。本研究为深入了解miR-210在食管鳞癌恶性表型中发挥的作用与调控机制提供了理论依据,因此,miR-210有望成为食管鳞癌治疗中的新靶点。

关键词：食管鳞癌 miR-210 自噬增殖转移 atg7