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小麦蓝矮植原体效应蛋白SWP1与转录因子TCP12的互作研究

小麦蓝矮植原体效应蛋白SWP1与转录因子TCP12的互作研究

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作者：羊海珍西北农林科技大学

学位级别：硕士

由植原体侵染引起的小麦蓝矮病(wheat blue dwarf disease,WBD)是威胁小麦生产的一种重要病害,主要发生在我国的西北地区,给农业造成了巨大的损失。前期研究发现,WBD植原体可以编码多个分泌蛋白(SWP),其中SWP1可以引起本氏烟和拟南芥侧... 详细信息

由植原体侵染引起的小麦蓝矮病(wheat blue dwarf disease,WBD)是威胁小麦生产的一种重要病害,主要发生在我国的西北地区,给农业造成了巨大的损失。前期研究发现,WBD植原体可以编码多个分泌蛋白(SWP),其中SWP1可以引起本氏烟和拟南芥侧枝增多,是一个关键的致病效应蛋白。为了深入了解SWP1效应蛋白引起侧枝增多的分子机理,我们对SWP1与植物因子的互作进行了研究。TCP家族转录因子中的classⅡ亚类对植物叶片形态建成、分枝发育等过程具有重要的调控作用,其中的一些成员能与SWP1的同源蛋白——翠菊黄化植原体侧枝增多株系编码的SAP11蛋白以及苹果丛生植原体编码SAP11-like蛋白发生互作。为此,本文首先采用酵母双杂技术探究了SWP1效应蛋白与拟南芥ClassⅡTCP家族所有成员的互作关系,并围绕其中一个与分枝调控相关的互作靶标attcp12,展开其与SWP1的互作机理研究。主要研究结果如下:1.克隆了拟南芥ClassⅡTCPs家族的11个转录因子,并成功构建到酵母双杂诱饵载体pGADT7上。将11个诱饵质粒pGADT7-TCPs分别与猎物质粒pGBKT7-SWP1共转化酵母细胞,通过观察转化子在营养缺陷型培养中的生长情况分析互作关系。结果显示SWP1能与其中的5个转录因子:TCP1、TCP2、TCP4、TCP12、TCP18、TCP24相互作用,与其余6个转录因子不互作。2.采用双分子荧光互补(BiFC)技术,进一步证明了SWP1能与attcp12互作,且互作发生在细胞核内。在本氏烟中共表达融合了红色荧光蛋白mCherry的attcp12和融合了绿色荧光蛋白GFP的SWP1,共聚焦显微镜观察发现SWP1与At TCP12共定位于细胞核。3.为了明确SWP1与attcp12互作中的关键结构域,构建了两个attcp12的缺失突变体attcp12△TCP、attcp12△R,酵母双杂验证其与SWP1的互作关系;构建三个SWP1的缺失突变体SWP1△NLS、SWP1△CC、SWP1△N,验证与attcp12的互作关系。结果表明,attcp12的TCP结构和SWP1的卷曲螺旋(CC)结构在两个蛋白的互作中发挥关键作用。4.采用实时荧光定量PCR检测了野生型和SWP1转基因拟南芥株系中attcp12的转录水平,结果表明SWP1的两个转基因株系中attcp12的mRNA水平都低于野生型。在本氏烟中共表达GFP-SWP1和3HA-attcp12,并以共表达GFP与3HA-attcp12为对照。Western blot和半定量RT-PCR的结果显示,与对照组相比,共表达SWP1的样品中attcp12的mRNA水平和蛋白水平均下调。综上所述,SWP1效应蛋白通过与attcp12转录因子互作,负调控attcp12的表达,干扰其正常功能的发挥,是SWP1引起拟南芥侧枝增多重要原因。

关键词：小麦蓝矮植原体效应蛋白SWP1 attcp12 TCP转录因子

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