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转atmet1/AtDME基因84K杨的获得及雌激素诱导表达

转AtMET1/AtDME基因84K杨的获得及雌激素诱导表达

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作者：吴晓娟中国林业科学研究院

学位级别：硕士

DNA甲基化修饰是一种重要的表观遗传修饰,在植物生长发育、环境响应等过程中发挥重要的作用。植物基因组DNA甲基化的水平主要是由DNA甲基转移酶类和DNA去甲基化酶类协同调控,使植物在不同发育时期、不同环境条件下呈现动态的DNA甲基化... 详细信息

DNA甲基化修饰是一种重要的表观遗传修饰,在植物生长发育、环境响应等过程中发挥重要的作用。植物基因组DNA甲基化的水平主要是由DNA甲基转移酶类和DNA去甲基化酶类协同调控,使植物在不同发育时期、不同环境条件下呈现动态的DNA甲基化水平。研究表明,植物基因组中有多个基因参与DNA的甲基化、去甲基化过程,其中,DNA甲基转移酶MET1(Methytransferase1)的主要功能是维持对称性CG位点的甲基化;转葡糖基酶(DEMETER,DME)能通过切除5-甲基胞嘧啶(5C)来催化DNA去甲基化。本研究以白杨派优良品种84K杨(Populus alba×***‘84K’)为试验材料,将化学诱导启动子及其调控下的拟南芥甲基化/去甲基化关键基因——甲基转移酶基因At MET1、转葡糖基酶基因At DME分别导入84K杨基因组中,获得转基因植株,通过化学诱导剂17-β-雌二醇的处理实现目的基因的人为控制表达,并诱导其叶片再生获得了一系列表型变异的84K杨群体。论文主要研究结果如下:1.通过农杆菌介导的遗传转化,获得了18个转At MET1的84K杨株系。以84K杨无菌苗叶片为材料,采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与拟南芥甲基化转移酶基因At MET1导入84K杨基因组中,共获得了潮霉素抗性芽648个,经生根筛选获得有18株抗性植株,经PCR、DNA测序等方法检测,证实全部为转基因植株(AM-1～18#)。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行化学诱导处理,q RT-PCR结果显示,化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时,目的基因At MET1的表达量即达到最大值,随后在6 h时表达量下降,12 h时有所回升,24 h以后表达量降低至不足12 h时的一半。说明化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中At MET1的表达,为进一步研究MET1在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础。2.通过农杆菌介导的遗传转化,获得了6个转At DME的84K杨株系。以84K杨无菌苗叶片为材料,采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与拟南芥去甲基化基因At DME导入84K杨基因组中,共获得了潮霉素抗性芽224个,经生根筛选获得6株抗性植株,经过PCR及DNA测序等方法检测,证实全部为转基因植株(AD-1～6#)。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行化学诱导处理,q RT-PCR结果显示,化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时,目的基因At DME的表达量基本达到最大值,效果持续至12 h后逐渐减弱。说明化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中At DME的表达,为进一步研究DME在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础。3.通过雌激素处理获得了转At MET1表型变异群体。将雌二醇处理不同时间的叶盘转移至分化培养基中,培养获得再生芽140个,生根培养后获得88株再生植株,其中0 h处理获得35株,3 h处理获得17株,6 h处理获得7株,12 h处理获得9株,24 h处理获得7株,48 h处理获得5株,96 h处理获得5株,144 h处理获得3株,扩繁后总计获得192株。取诱导处理3、12、24 h叶盘获得的再生植株,以及未诱导的转基因对照、非转基因对照,移栽至全自动日光温室,测定其生理生化指标。结果表明,转At MET1植株叶片处理后再生植株与非转基因对照相比,12 h处理株系2的苗高极显著低于对照;3个处理均有株系的叶长宽比、Pn、Gs以及可溶性蛋白含量极显著低于对照;12、24 h处理有株系的Ci显著低于对照,可溶性糖含量显著高于对照;而3 h处理株系2的Tr极显著低于对照,WUE极显著高于对照,处理3、12 h有株系的POD酶活性显著高于对照,其他差异均不显著。4.通过雌激素处理获得了转At DME表型变异群体。将雌二醇处理不同时间的叶盘转移至分化培养基中,培养获得再生芽188个,生根培养后获得141株再生植株,其中0h处理获得40株,3 h处理获得15株,6 h处理获得15株,12 h处理获得16株,24 h处理获得18株,48 h处理获得16株,96 h处理获得13株,144 h处理获得8株,扩繁后总计获得227株。取诱导处理3、12、24 h叶盘获得的再生植株,以及未诱导的转基因对照、非转基因对照,移栽至温室,测定其生理生化指标。结果表明,转At DME植株叶片诱导表达再生植株与非转基因对照及转At DME诱导0 h植株相比,3个处理都有株系的叶长宽比、Gs、Ci、Tr以及可溶性蛋白含量极显著低于对照,相对叶绿素含量、WUE和保护酶活性显著高于对照;处理3、12 h有株系的Pn极显著高于对照,处理3、24 h均有株系的可溶性糖含

关键词： P.alba×P.glandulosa‘84K’ atmet1 AtDME 遗传转化化学诱导表达

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