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athspr基因在拟南芥叶片形态发生及侧根发育中的功能及其机制

AtHSPR基因在拟南芥叶片形态发生及侧根发育中的功能及其机制

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作者：黄益军兰州大学

学位级别：硕士

植物器官的形态发生一般包括细胞扩展、细胞分化及细胞分裂三个方面,其中细胞扩展是决定植物器官最终大小和形状的关键因素,因而解析植物细胞扩展的调控机制是当今植物发育生物学研究的重点。本课题组在前期研究中在拟南芥C24生态型中... 详细信息

植物器官的形态发生一般包括细胞扩展、细胞分化及细胞分裂三个方面,其中细胞扩展是决定植物器官最终大小和形状的关键因素,因而解析植物细胞扩展的调控机制是当今植物发育生物学研究的重点。本课题组在前期研究中在拟南芥C24生态型中分离到一个T-DNA插入突变体athspr(Arabidopsis thaliana heat shock protein-related),与野生型相比,athspr突变体表现出莲座叶半径变小及叶脉闭合异常等缺陷表型,发现athspr基因在叶脉及侧根处大量表达,athspr蛋白可能与26S蛋白酶体的核心亚基PAD1(20S PROTEASOME ALPHA SUBUNIT 1)及生长素信号抑制蛋白IAA27(INDOLE-3-ACETIC ACID INDUCIBLE 27)存在相互作用,由此我们推测athspr基因可能参与调控拟南芥叶器官的形态发生及侧根的发育,但是其详细功能及其机制还不清楚。因此,本研究以拟南芥野生型、athspr、iaa27和pad1单突变体、iaa27/athspr、pad1/athspr和iaa27/pad1双突变体以及iaa27/pad1/athspr三突变体为材料,通过形态学比较、显微结构差异分析、生理生化分析及转录组测序等方法,探究了athspr基因在拟南芥叶器官的细胞扩展、叶脉发育及侧根发育中的功能,其主要研究结果如下:1.通过对athspr突变体的表型分析发现:与野生型相比,athspr突变体的叶表皮细胞面积减小且叶脉异常比例提高,表明athspr基因可能促进拟南芥叶表皮细胞的扩展,并同时参与叶脉的发育过程;2.转录组测序分析表明:与野生型相比,athspr突变体的生长素响应、生长素极性运输及细胞壁松弛相关基因发生异常表达,表明athspr可能通过调控生长素响应、生长素极性运输及细胞壁松弛相关基因的表达来参与拟南芥的生长发育过程;3.通过GST pull-down和双分子荧光互补实验表明athspr与PAD1及IAA27确实存在相互作用,并且其互作区域为athspr的N端结构域;4.通过对拟南芥野生型、athspr、iaa27和pad1单突变体以及iaa27/athspr和pad1/athspr双突变体的叶表皮细胞形态分析发现:pad1与iaa27单突变体的叶表皮细胞面积显著大于野生型,而pad1/athspr双突变体的叶表皮细胞面积与野生型一致,但是iaa27/athspr双突变体的叶表皮细胞面积介于野生型与athspr突变体之间,表明PAD1与IAA27可能抑制叶表皮细胞的扩展,并且athspr通过与PAD1及IAA27相互作用共同调控拟南芥叶表皮细胞的扩展;5.通过观察拟南芥野生型、athspr和iaa27单突变体及iaa27/athspr双突变体的侧根数目发现:athspr突变体的侧根数目显著少于野生型,iaa27突变体的侧根数目与野生型一致,而iaa27/athspr双突变体的侧根数目则介于野生型与athspr突变体之间。此外,athspr基因在侧根发生处大量表达。以上结果表明athspr参与调控拟南芥侧根的发育,并且其功能可能部分依赖于IAA27;6.通过GST pull-down及双分子荧光互补实验证明了PAD1与IAA27也存在相互作用;7.通过观察拟南芥野生型、athspr、iaa27和pad1单突变体、iaa27/athspr、pad1/athspr和iaa27/pad1双突变体以及iaa27/pad1/athspr三突变体的叶表细胞形态发现:iaa27/pad1双突变体的叶表皮细胞面积与pad1一致,iaa27/pad1/athspr三突变体的叶表皮细胞面积与野生型无差异,表明PAD1与IAA27可能通过抑制athspr的功能来调控拟南芥叶表皮细胞的扩展过程;8.通过分析拟南芥野生型、athspr、iaa27和pad1单突变体、iaa27/athspr、pad1/athspr和iaa27/pad1双突变体以及iaa27/pad1/athspr三突变体的叶脉发育模式发现:athspr与iaa27单突变体及iaa27/athspr双突变体的叶脉闭合程度显著低于野生型,而其它株系如iaa27/pad1双突变体及iaa27/pad1/athspr三突变体的叶脉闭合程度则与野生型无差异,表明athspr与PAD1及IAA27共同调控拟南芥叶脉的发育模式;9.通过分析拟南芥野生型、athspr、iaa27和pad1单突变体、iaa27/athspr、pad1/athspr和iaa27/pad1双突变体以及iaa27/pad1/athspr三突变体的生长素运输抑制剂的敏感性发现:athspr突变体与野生型相比对生长素运输抑制剂表现出较强的敏感性,而iaa27/pad

关键词： athspr 细胞扩展叶脉模式侧根发生

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拟南芥athspr基因在细胞扩展中的作用及athspr启动子的维管组织特异性表达分析

拟南芥Athspr基因在细胞扩展中的作用及Athspr启动子的维管组织特...

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作者：李孝影兰州大学

学位级别：硕士

植物细胞扩展是植物组织器官形态建成中的重要环节,而维管组织和细胞骨架在组织器官发育及形态建成中也具有重要作用。此外,细胞骨架对于植物的抗逆性也至关重要。本实验室采用T-DNA介导的基因诱捕技术筛选得到一个具有多效表型的拟南... 详细信息

植物细胞扩展是植物组织器官形态建成中的重要环节,而维管组织和细胞骨架在组织器官发育及形态建成中也具有重要作用。此外,细胞骨架对于植物的抗逆性也至关重要。本实验室采用T-DNA介导的基因诱捕技术筛选得到一个具有多效表型的拟南芥突变体,根据前期对突变体基因的分析将其命名为athspr (Arabidopsis thaliana heat shock protein related)突变体。与野生型C24相比,athspr突变体的各组织器官体积均减小,其中果荚缩短变粗是突变体的稳定表型,athspr突变体还对NaCl胁迫十分敏感。此外,athspr突变体中携带的GUS标签普遍表达于拟南芥各组织器官的维管系统。根据前期研究,我们推测athspr突变体的矮化表型可能是由细胞形态发生变化或维管组织发育异常所致。而细胞骨架作为细胞中普遍存在的结构,维管组织的发育同样需要正常细胞骨架的维持。为了进一步研究athspr基因在细胞形态建成及维管组织发育中的作用,本研究采用组织化学及荧光染色、载体构建和转基因技术,结合显微观察,从组织和细胞水平对athspr突变体进行了分析,研究了athspr基因在植物细胞形态建成、维管组织发育及盐耐受性中的可能作用。主要结果如下：1.通过石蜡切片和扫描电镜观察发现,与野生型C24相比,athspr突变体下胚轴表皮细胞、叶柄细胞和花柱顶端的乳头状细胞显著缩短,瓣膜外表皮细胞径向扩展且形状不规则,胚座框及其中的维管束变细,子房内胚珠发育相对滞后。2.通过细胞骨架荧光染色观察,发现athspr突变体与野生型下胚轴细胞中的微丝骨架存在差异,即正常生长条件下,athspr突变体下胚轴拥有正常形态微丝的细胞比例低于野生型,且突变体下胚轴具有径向分布微丝的细胞比例高于野生型：用50mM NaCl处理后,athspr突变体中微丝骨架紊乱程度显著提高,其中在athspr突变体下胚轴中,微丝紊乱的细胞所占比例比野生型高出12.6%。3.在athspr突变体和17k-proathspr::GUS转基因植株中,athspr基因启动子驱动的GUS广泛表达于各组织器官的维管组织,主要在花序茎中的维管形成层、木质部及韧皮部中表达,且在SAM、真叶叶脉、叶柄、下胚轴与根的交接处以及侧根分支点处表达强烈。4.通过克隆4.3k(4235bp)的athspr基因长启动子,构建该启动子驱动的GUS表达载体proathspr::GUS,将该载体转化拟南芥野生型C24,筛选得到17个T1代转基因系。通过GUS染色观察,发现在该转基因植株所有组织器官的维管组织中均有GUS表达,包括萼片、花瓣、花丝,以及果荚中的花柱、胚座框、瓣膜和隔膜中的维管组织。5.用不同的植物激素处理10天大的athspr突变体和:GUS转基因幼苗,结果发现在转基因系中athspr启动子驱动的GUS表达均可被50μM IAA、GA和6-BA诱导上调,其中GA诱导的GUS表达染色最深,而突变体对上述激素处理不敏感。以上研究结果表明athspr基因在植物细胞形态建成和拟南芥维管组织发育中可能具有重要作用,且athspr基因可能参与了微丝骨架形态结构的维持。此外,athspr基因可能通过微丝骨架参与盐胁迫应答,且athspr基因的表达和功能发挥可能受到不同激素信号的调控。

关键词：拟南芥 athspr 维管发育细胞骨架启动子 GUS

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拟南芥athspr突变体的耐热性分析及athspr基因的原核表达

拟南芥Athspr突变体的耐热性分析及Athspr基因的原核表达

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作者：王云珑兰州大学

学位级别：硕士

本课题组通过启动子诱捕技术获得一个多效突变体,T-DNA的插入造成的基因功能改变使拟南芥植株具有生长发育迟缓,叶片卷曲,植株矮化,抗逆性降低等特征。通过对相关基因的克隆和生物信息学分析发现,该基因是一个全新的,与热激蛋白相关的基... 详细信息

本课题组通过启动子诱捕技术获得一个多效突变体,T-DNA的插入造成的基因功能改变使拟南芥植株具有生长发育迟缓,叶片卷曲,植株矮化,抗逆性降低等特征。通过对相关基因的克隆和生物信息学分析发现,该基因是一个全新的,与热激蛋白相关的基因,并命名为athspr (heat shock protein-related in Arabidopsis thaliana)。本研究以拟南芥athspr突变体作为材料,对野生型和突变体athspr的耐热性进行了比较,利用原核表达技术和Ni柱亲和层析技术表达纯化出具有序列特异性的融合蛋白。主要研究成果如下： 1.分析比较了不同的热激胁迫下突变体和野生型的表型差异。在短期热激胁迫中植株未表现出稳定的表型差异。当降低预热激时间(90min→10min)时,突变体表现出更高的致死率;长期的轻微热激胁迫(30℃)后,拟南芥植株具有不同的表型变化,在MS培养基中,上述条件对植株具有致死性,而在长期土培热激胁迫中,植株有稳定表型差异,突变体表现出叶片卷曲严重,营养生长阶段延长,植株不能进入生殖生长等表型。同时对种子进行了热激胁迫,与野生型相比突变体萌发率降低;2.通过SDS-PAGE凝胶电泳分离athspr蛋白并初步分析热激条件下athspr蛋白在拟南芥植株中的表达情况。比较了不同蛋白提取法提取athspr蛋白的优劣,最终证明硫酸铵分步沉淀法能较好的提取athspr蛋白。在热激后,拟南芥植株中athspr蛋白均有表达,突变体中蛋白表达量降低;3.通过生物信息学分析,选择位于athspr基因第三个外显子的957个特异性碱基作为外源基因,利用原核表达,在Trans Rosetta(DE3)中表达出了具有序列特异性的融合athspr蛋白,并通过Ni Sepharose6 Fast Flow凝胶纯化得到了纯度较高的蛋白,为研究蛋白的表达模式和功能奠定了良好的基础。以上结果表明,T-DNA插入引起的插入位点基因功能的改变,导致了突变体热耐受性的降低。说明athspr基因可能是调节拟南芥正常生长发育信号通路中极为重要的一员,同时对于拟南芥的热耐受能力的发挥也具有重要的作用。

关键词：拟南芥 athspr HSP101 获得耐热性蛋白分离原核表达

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拟南芥athspr突变体纯合性的鉴定、细胞结构分析及athspr 蛋白的抗体制备

拟南芥Athspr突变体纯合性的鉴定、细胞结构分析及AtHSPR 蛋白的...

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作者：王丽艳兰州大学

学位级别：硕士

本实验室通过T-DNA介导的启动子诱捕技术分离到一个拟南芥多效突变体,在前期的工作中,利用TAIL-PCR技术对突变体相关基因进行了克隆和定位,并通过对该基因的生物信息学分析发现,该基因是一个与热激蛋白相关且功能未知的新基因,因此将该... 详细信息

本实验室通过T-DNA介导的启动子诱捕技术分离到一个拟南芥多效突变体,在前期的工作中,利用TAIL-PCR技术对突变体相关基因进行了克隆和定位,并通过对该基因的生物信息学分析发现,该基因是一个与热激蛋白相关且功能未知的新基因,因此将该突变体及其基因命名为athspr （heat shock protein-related in Arabidopsis thaliana）。athspr突变体具有植株矮小,叶片卷曲,下胚轴、叶柄缩短,叶片颜色深绿,生殖生长阶段延迟、果荚粗短等表型特征。为了进一步从细胞水平、分子水平及蛋白水平研究athspr基因的功能,本文对athspr突变体的纯合性进行了PCR鉴定,研究了突变体叶、茎、下胚轴等组织器官内部的细胞结构变化,同时利用athspr基因的特异性序列制备了athspr蛋白的多克隆抗体,主要研究结果如下： 1.通过PCR技术确定了athspr突变体为纯合体,T-DNA的RB端发生了17bp的缺失和5bp的错配,但插入位点处的athspr基因序列并未发生变化。 2.通过各种显微技术对叶片细胞结构的观察和统计结果表明：（1）athspr突变体叶片主脉区、栅栏组织及海绵组织中的叶肉细胞面积均不同程度地小于野生型,同时叶片表皮细胞的面积也表现出同样的趋势;（2）突变体主脉区的木质部细胞数目及面积均小于野生型;（3）突变体叶肉细胞中的叶绿体不论单位面积或单位细胞中的数目均大于野生型,这使得突变体的叶片颜色更为深绿。（4）突变体叶绿体超微结构中类囊体片层结构比野生型略为稀少。 3.通过扫描电子显微镜和半薄切片对拟南芥茎、下胚轴、果荚等进行观察发现：（1）athspr突变体茎S-cell细胞长宽比减小;（2）突变体下胚轴细胞形态变宽变短,细胞排列整齐;（3）突变体茎、果荚、种子的表皮细胞面积均出现不同程度的减小。 4.经生物信息学分析,选择athspr基因第三个外显子的957bp的特异序列构建pET-30a-At957表达载体,经IPTG诱导表达、His柱亲和层析纯化、透析等步骤获得高纯度的At957-His6重组蛋白。 5.以高纯度的At957-His6重组蛋白作为抗原,免疫新西兰兔获得抗血清,并利用CNBr epharose4B亲和纯化的方法制备athspr蛋白的多克隆抗体,该抗体能够与植物天然的athspr蛋白进行特异性结合。综上所述,T-DNA插入确实造成了athspr蛋白功能的变化,使得athspr突变体宏观表型及各组织器官内部细胞结构均发生了不同程度的变化,这些变化说明athspr基因在植物生长发育方面的重要作用。

关键词： athspr T-DNA插入半薄切片纯合性原核表达抗体

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拟南芥athspr基因在GA介导的开花发育中的功能研究

拟南芥AtHSPR基因在GA介导的开花发育中的功能研究

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作者：王永丽兰州大学

学位级别：硕士

赤霉素是植物生长发育过程中一类重要的植物激素,影响植物的种子萌发、叶和根的生长、成花诱导、以及花和果实的发育。花与果荚的发育是拟南芥发育的重要组成部分。植物的开花主要由自主途径、春化途径、光依赖途径以及赤霉素途径协同控... 详细信息

赤霉素是植物生长发育过程中一类重要的植物激素,影响植物的种子萌发、叶和根的生长、成花诱导、以及花和果实的发育。花与果荚的发育是拟南芥发育的重要组成部分。植物的开花主要由自主途径、春化途径、光依赖途径以及赤霉素途径协同控制,赤霉素同时在控制拟南芥的果荚发育中也发挥着重要的作用。本实验室在拟南芥C24生态型中通过T-DNA插入筛选获得了一个多效表型的突变体athspr(Arabidopsis thaliana heat shock protein trlated)。与野生型拟南芥(WT)相比,athspr突变体开花时间延迟,且该差异在短日照条件下更为显著。同时,在短日照条件下,athspr突变体果荚的育性显著降低。为了揭示At HSPR在拟南芥开花与果荚发育上的功能,本研究采用常规的表型差异观察统计、启动子诱导表达分析、外源GA处理与q RT-PCR等方法和技术,研究了At HSPR在开花与果荚发育中的重要作用。主要研究结果如下:1.通过在线启动子分析网站Plant CARE分析At HSPR启动子发现,At HSPR启动子中存在诸多响应GA与光信号的顺式作用元件。并且,外源施加10μM、25μM和50μM的赤霉素处理10天大的WT以及pro At HSPR::GUS转基因系,发现At HSPR启动子的活性可以被GA诱导表达上调。2.在长日照(LD)条件下,对pro At HSPR::At HSPR过表达系(OE)、WT与athspr突变体的开花时间、株高及莲座叶数目的统计分析发现,OE的开花时间早于WT,而athspr突变体的开花时间则晚于WT。同时,开花时间越早伴随着株高越高、莲座叶数目越少。表明At HSPR参与调控拟南芥的开花。3.在LD条件下,对21天大的OE、WT与athspr突变体外源施加100μM GA处理后发现,athspr突变体的开花时间可以部分恢复至WT水平,同时莲座叶数目减少,株高增高。q RT-PCR结果显示开花基因FT(FLOWERING LOCUS T)与SOC1(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1)在athspr突变体中表达量降低,结果表明,At HSPR可能通过影响FT和SOC1的表达来参与调控拟南芥的开花。4.在短日照(SD)条件下,athspr突变体与WT开花时间之间的差异更为显著,且外源GA处理可以部分恢复athspr突变体开花延迟的表型,说明在排除光信号途径的干扰后,At HSPR功能的缺失可部分通过外源GA来弥补。q RT-PCR结果显示在athspr突变体中,LFY、SOC1开花基因下调,GA受体GID基因表达无显著性差异,GA合成中的关键酶基因GA20ox1、GA20ox2和GA3ox1合成降低,同时促进开花相关基因SVP与SPL的表达。以上结果表明,At HSPR基因参与GA介导的开花调控。5.对所有株系的拟南芥果荚类型进行统计,结果显示:WT与OE系在SD和LD条件下,不育性果荚均较少,无显著性差异。但是athspr突变体在SD条件下比在LD条件下果荚的育性显著降低。在SD条件下,外源100μM GA处理后,athspr突变体可育性果荚比例增加约20%。说明At HSPR参与GA介导的拟南芥的果荚发育。由上述结果可知,与WT相比,athspr突变体开花延迟、莲座叶数目增多、株高降低。同时,在短日照条件下,athspr突变体的果荚育性显著降低。外源GA的处理可以部分恢复athspr突变体的开花时间与果荚的育性至WT水平。q RT-PCR结果显示,athspr突变体开花延迟是由于GA合成过程中GA20ox1、GA20ox2、GA3ox1关键酶基因的表达水平降低以及FT、SOC1、LFY等开花基因表达水平的降低引起的。因此,At HSPR参与了GA介导的拟南芥的开花与果荚发育。

关键词：拟南芥 athspr 赤霉素开花调控果荚发育

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拟南芥athspr新基因的耐盐功能分析

拟南芥Athspr新基因的耐盐功能分析

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细胞—生命的基础——中国细胞生物学学会2013年全国学术大会·武汉

作者：张亮杨涛汪冉冉李孝影郝红艳孙英莉王新宇王崇英兰州大学生命科学学院细胞生物学研究所

耐盐新基因的挖掘是阐明植物耐盐机制、培育抗盐作物的基础。我们分离到一个对盐十分敏感的拟南芥athspr突变体,与野生型相比,该突变体植株矮化、各器官体积减小、抽薹延迟、耐盐性降低等。平板实验发现14天大的突变体对钠盐和氯化锂十... 详细信息

耐盐新基因的挖掘是阐明植物耐盐机制、培育抗盐作物的基础。我们分离到一个对盐十分敏感的拟南芥athspr突变体,与野生型相比,该突变体植株矮化、各器官体积减小、抽薹延迟、耐盐性降低等。平板实验发现14天大的突变体对钠盐和氯化锂十分敏感,而在渗透胁迫下(KCl,甘露醇),突变体与野生型无显著差异;一定浓度的Na或Li造成突变体幼苗的叶片萎蔫白化,而对其根的影响并不显著;200mM NaCl或15 mM LiCl则致其完全死亡,而野生型幼苗的生长

关键词：拟南芥 athspr 耐盐性时空表达

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拟南芥athspr基因参与水杨酸介导的植物免疫反应

拟南芥AtHSPR基因参与水杨酸介导的植物免疫反应

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2018全国植物生物学大会

作者：边志远杨涛高振晟廉玉科轩利娟张燕康继红王新宇王崇英兰州大学生命科学学院细胞活动与逆境适应教育部重点实验室

病原菌严重影响着植物的生长发育,导致多种农作物大幅减产。水杨酸(SA)作为植物抗病反应中重要的信号分子,在植物抵抗病原菌的过程中发挥重要的作用。本实验室前期在拟南芥中分离到一个T-DNA插入型突变体athspr(Arabidopsis thaliana he... 详细信息

病原菌严重影响着植物的生长发育,导致多种农作物大幅减产。水杨酸(SA)作为植物抗病反应中重要的信号分子,在植物抵抗病原菌的过程中发挥重要的作用。本实验室前期在拟南芥中分离到一个T-DNA插入型突变体athspr(Arabidopsis thaliana heat shock protein-related),与野生型相比,该突变体器官体积减小,对环境因子敏感性增强。病原菌敏感性分析发现athspr突变体对丁香假单胞杆菌Pst DC3000敏感,而过表达athspr的转基因株系抗病性提高,表明athspr基因正向参与调节植物的抗病性。通过qRT-PCR结果发现,athspr基因受到病原菌的诱导上调表达;与野生型相比,athspr突变体中抗病相关基因PR1、PR2、KTI1和FRK1的表达量显著下调,而SA合成基因ICS1与SA代谢基因NPR1的表达量显著升高;并且通过LC/MS分析发现athspr突变体植株中积累了大量水杨酸,表明athspr基因可能通过影响SA信号来参与调控拟南芥的免疫应答。此外,通过蛋白互作筛选发现athspr蛋白与拟南芥甲拌磷金属内肽酶TOP1(THIMET METALLOENDOPEPTIDASE 1)可以相互作用,其中TOP1参与调节SA介导的信号传导和免疫反应。以上结果表明:拟南芥athspr蛋白可能与TOP1蛋白相互作用,通过SA介导的信号途径来调控植物的抗病性。

关键词：拟南芥 athspr 抗病水杨酸 TOP1

来源： cnki会议评论

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