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犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立

犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立

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作者：孙伟伟西藏大学

学位级别：硕士

犬瘟热(canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)感染引起的消化道、呼吸道、神经系统异常以及机体免疫抑制的传染性疾病。近年来,我国CD呈现出新的流行特点:毒株变异快、感染谱不断扩大、混合感染现象普遍,由... 详细信息

犬瘟热(canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)感染引起的消化道、呼吸道、神经系统异常以及机体免疫抑制的传染性疾病。近年来,我国CD呈现出新的流行特点:毒株变异快、感染谱不断扩大、混合感染现象普遍,由其引发的免疫抑制致使疫苗免疫失败时有发生,对养犬业和毛皮动物养殖造成的直接及间接经济损失巨大,寻求防控该病已成为亟待解决的重大科学与生产实际问题。为此,本研究旨在了解江苏部分地区犬瘟热流行情况,分析病毒H蛋白的遗传变异规律,丰富了CDV流行毒株资源库;同时,扩充已建立的CDV单克隆抗体杂交瘤细胞株库,从中筛选具有广谱中和活性单克隆抗体;基于重组H蛋白和单克隆抗体建立CDV抗原与抗体竞争ELISA检测方法,用于CD病原学和血清学检测,为CDV的感染监测提供技术支撑。主要研究内容包括:本研究收集了60份2017-2019年江苏部分地区疑似犬瘟热病料,采用RT-PCR法鉴定了22份病料样品为CDV核酸阳性,进一步通过扩增完整H基因、核酸测序、BLAST比对、同源性比对、遗传进化分析和N-糖基化位点统计分析显示,其中18份America-1型毒株与疫苗株(Ondetstepoort株)高度同源;其余4份属asia-1型毒株(分别命名为YZ-4、NJ-13、NJ-21、YZ-27),与疫苗株氨基酸同源性在90.1%-91.2%之间,毒株间同源性为97.2%-99.8%,与国内流行asia-1型毒株同源性较高(99.7%-100%);4株asia-1型毒株在H蛋白584-586位点均具有潜在的N-糖基化修饰,具有asia-1型强毒株的分子特征;另外,YZ-4株、NJ-21株和YZ-27株H蛋白SLAM受体结合区域未发生改变(519R/530G/549Y),而NJ-13株的受体结合区域突变为519R/530G/549H,提示该毒株与宿主结合能力可能发生改变。本研究扩充了CDV单克隆抗体杂交瘤细胞株库,基于重组H蛋白的间接ELISA法筛选获得7株稳定分泌抗H蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(分别命名为3B1、3B5、3C5、3D5、5A6、4G12和7B2),由此产生的抗体亚类均鉴定为Ig G1κ。间接免疫荧光试验显示上述单克隆抗体均能与CDV发生反应,不与犬细小病毒、犬冠状病毒以及犬流感病毒反应,具有良好特异性;病毒中和试验测定其培养上清的抗体中和效价为2-2,诱生BALB/c小鼠腹水的抗体中和效价为10-10,其中3B5、5A6、4G12、7B2之间的叠加系数均在50%以上,表明这4株单克隆抗体识别不同抗原表位;连续传代检测显示在第20代仍具有高效分泌抗体的能力,表明其稳定性良好;另外,3B5、5A6、4G12和7B2除能中和Ondetstepoort疫苗株(America-1型)外,还能中和当前流行的asia-1型CDV毒株,其中3B5抗Ondetstepoort株和YZ-4株的中和效价分别为2和2,具有较好的广谱中和活性。本研究以HRP酶标的3B5单克隆抗体和重组H蛋白为基础建立了CDV抗体竞争ELISA检测方法,采用方阵滴定法CDV抗体竞争ELISA检测方法的最佳包被抗原(重组H蛋白)浓度为4μg/m L,H-RP酶标3B5抗体最佳稀释浓度为1:3 200,待检血清最佳稀释浓度为1:8,血清样本抑制率(PI)≥45%判定为阳性,与国外商品化的犬瘟热抗体试剂盒相比,检测结果符合率为97%,具有良好的特异性和敏感性。本研究以HRP酶标的重组H蛋白和3B5单克隆抗体为基础建立了CDV抗原竞争ELISA检测方法,采用方阵滴定法确定CDV抗原竞争ELISA检测方法的最佳包被抗体(3B5)浓度为2μg/m L、HRP酶标重组H蛋白最佳稀释浓度为1:1 600,经反应条件优化,该方法最低病毒检测量为10TCID/m L,特异性和重复稳定性良好,与RT-PCR法检测临床样品的符合率达100%。综上,本研究对江苏部分地区开展了CDV分子流行病学调查,分析流行毒株的遗传变异规律,及时总结其流行病学态势和分子变异情况;同时,扩充了CDV毒株资源库和CDV单克隆抗体杂交瘤细胞株库,筛选了具有广谱中和活性的抗H蛋白单克隆抗体;以此建立了CDV抗原和抗体竞争ELISA检测方法,完善CD病原学和血清学检测方法和评价CDV感染水平,为科学防控CD提供技术支撑。

关键词：犬瘟热病毒 asia-1型毒株 H蛋白单克隆抗体竞争ELISA

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