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靶向arl13b与smo相互作用多肽抑制剂的发现研究

靶向Arl13b与Smo相互作用多肽抑制剂的发现研究

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作者：施唯南昌大学

学位级别：硕士

背景:Hedgehog(Hh)信号通路最初于1980年由Nüsslein-Vollhard和Wieschaus在研究影响果蝇体节发育的基因突变遗传分析时被发现。近年的研究发现,Hh信号通路不仅仅在在哺乳动物的胚胎发育、成熟器官形成及形态维持中扮演了重要角色,它的... 详细信息

背景:Hedgehog(Hh)信号通路最初于1980年由Nüsslein-Vollhard和Wieschaus在研究影响果蝇体节发育的基因突变遗传分析时被发现。近年的研究发现,Hh信号通路不仅仅在在哺乳动物的胚胎发育、成熟器官形成及形态维持中扮演了重要角色,它的异常激活参与了多种恶性肿瘤发生和发展。在胃癌、肺癌等恶性肿瘤中陆续发现Hh信号通路均有不同程度的异常活化,部分Hh信号通路的抑制剂已用于一些癌症的临床治疗。smoothened(smo)是Hh信号通路中至关重要的信号转导元件,介导信号在初级纤毛中的传递,并激活一系列下游靶基因的表达,在Hh通路中起着“开关”的作用。以smo作为靶点的抑制剂已投入临床使用,并在多种癌症的临床治疗中得到广泛应用。然而,在治疗时发现smo的突变常常导致肿瘤对smo抑制剂产生抵抗,大大降低了其疗效。因此,寻找和发现抑制Hh信号通路活性的新的靶点和其抑制剂具有十分重大的意义。arl13b属于小GTP酶,定位在初生纤毛上,是最重要的纤毛蛋白。它参与了纤毛的形成和纤毛功能的维持,比如囊泡转运、细胞运动和形成细胞骨架等,这提示arl13b可能与高度依赖初级纤毛的Shh信号通路密切相关。因此,靶向arl13b与smo的相互作用可以作为一个抑制Hh信号通路的的新靶点,靶向arl13b与smo相互作用的抑制剂可用于癌症的治疗,从而解决smo耐药的治疗难题。研究目的:1、验证arl13b与smo的直接相互作用;2、鉴定与smo相互作用的arl13b的最小片段,设计并合成多肽;3、验证arl13b小分子多肽对Hh信号通路的影响;4、研究arl13b小分子多肽与smo抑制剂环靶明的协同作用。研究方法:1、利用pMAL蛋白融合纯化系统,诱导并纯化MbP-smo(550-787aa),与His-arl13b19蛋白进行MbP-Pulldown,验证两者之间是否为直接相互作用。用Western blot方法,检测arl13b对Hh通路活性的作用、以及免疫荧光方法检测arl13b对smo在细胞膜和初级纤毛上定位的影响。2、在功能学方面,用克隆形成、Transwell和裸鼠移植瘤方法检测敲除arl13b对细胞增殖、侵袭、肿瘤形成的影响。3、利用I-TASSER网站预测arl13b的二级结构,并根据其二级结构对其进行不同大小的分段,构建分段质粒,利用MbP-Pulldown确定arl13b与smo相互作用的最小分段,并用CO-IP方法验证抑制arl13b-smo相互作用的多肽片段。4、向293T转染arl13b多肽片段质粒,或同时用环靶明处理,检测多肽片段或协同环靶明对Hh通路活性的影响,并且进一步检测多肽片段或其协同环靶明抑制胃癌细胞增殖的作用。研究结果:1、arl13b能通过与smo的直接相互作用,促进smo在细胞膜表面和初级纤毛上聚集,从而激活Hh信号通路。下调arl13b则能抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和肿瘤形成能力。2、发现并鉴定能抑制arl13b与smo相互作用的arl13b多肽片段,并且该arl13b多肽片段对Hh通路的活性有抑制作用,能抑制胃癌细胞的增殖。并且,arl13b多肽片段与smo抑制剂环靶明协同抑制Hh信号通路活性和胃癌细胞增殖。靶向arl13b-smo相互作用的抑制剂能为临床上Shh激活的肿瘤的治疗提供新的靶点,解决单独smo抑制剂给药抵抗的治疗难题。

关键词： arl13b-smo相互作用多肽抑制剂胃癌 Hh信号通路

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