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关键氨基酸对花生致敏原ara h 2致敏性的影响

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关键氨基酸对花生致敏原Ara h 2致敏性的影响

作者：周晓娅南昌大学

学位级别：硕士

花生是世界上最常见的过敏食物之一,花生致敏原中ara h 2是致敏性最强的组分之一。严格避免摄入是对过敏患者唯一可靠的预防方式。然而,由于花生和花生产品在食品中的广泛使用,这种做法非常困难,因此人们试图将视线转移到食品本身。蛋... 详细信息

花生是世界上最常见的过敏食物之一,花生致敏原中ara h 2是致敏性最强的组分之一。严格避免摄入是对过敏患者唯一可靠的预防方式。然而,由于花生和花生产品在食品中的广泛使用,这种做法非常困难,因此人们试图将视线转移到食品本身。蛋白质结构会影响致敏性,但影响致敏性的分子机制仍不清楚,特别是决定致敏性的蛋白关键结构仍有待研究。本论文以发现影响蛋白质潜在致敏性的局部结构为出发点。通过关键氨基酸的突变分别破坏线性表位、二硫键、疏水核心、电荷核心四种结构,从而定向改造致敏原ara h 2。实验表征突变前后ara h 2整体结构变化,软件模拟突变前后ara h 2局部结构变化,通过血清学、细胞学、动物实验系统地评价突变前后ara h 2潜在致敏性变化。对比结构变化与潜在致敏性变化,以期找到影响致敏原致敏性的关键结构。本文的研究方法、主要结果与结论如下:1、选取疏水核心及电荷核心中关键氨基酸,将其突变为理化性质相反的氨基酸,设计5个突变体。疏水核心破坏后疏水氨基酸间距离变远,电荷核心破坏后局部静电势能面完全改变,结构变化与设计预期基本一致,突变体设计成功。加上破坏致敏原ara h 2二硫键、优势表位的3个突变体,共8个突变体。天然ara h 2通过天然花生脱脂再由阴离子交换层析柱纯化,野生型ara h2和8个突变体通过大肠杆菌原核表达,利用镍离子亲和柱纯化,所有样品纯度均在85%之上。2、通过圆二色谱和紫外吸收光谱法表征突变前后ara h 2整体结构变化,通过分子动力学Gromacs模拟结构并借助Py MOL、VMD、Elli Pro等软件分析局部结构变化。结果显示,氨基酸突变不仅会影响局部结构同样也会影响远程结构,不同氨基酸突变可能带来某个局部结构静电势的相似变化,如RDPYSPSQDPYSPS。破坏二硫键后,α-螺旋含量降低,β-转角含量增加,芳香族氨基酸的溶剂可及表面积减小。破坏疏水核心后内部紧凑结构被破坏,整体结构向外扩散。破坏电荷核心后螺旋结构变得更加紧凑,无规则卷曲可能部分转化为螺旋。3、通过间接竞争ELISA法检测Ig E结合能力。结果发现,ara h 2中不同结构对其与Ig E结合能力的影响排序为:疏水核心>结构更加紧凑的电荷核心=所有二硫键>线性表位>电荷核心。疏水核心对Ig E结合有关键作用,突变疏水氨基酸残基后Ig E结合能力降低最明显,其中疏水核心L、M、F、L影响更大。疏水核心破坏后蛋白溶剂可及表面积和疏水残基溶剂可及表面积增加,而苯丙氨酸的溶剂可及表面积减小,苯丙氨酸F、F可能是致敏原ara h 2与Ig E结合的关键位点之一。4、基于KU812细胞株脱颗粒模型、Balb/c小鼠模型评价突变前后ara h 2的致敏性变化。通过细胞炎症因子分泌、小鼠临床症状、血清中特异性抗体、血清中肥大细胞蛋白酶1及食物过敏相关细胞因子综合评价突变前后ara h 2的致敏性变化。结果表明,二硫键对于对ara h 2的潜在致敏性强弱至关重要,破坏二硫键后致敏性强弱与芳香族氨基酸的溶剂可及表面积大小正相关。疏水核心L、A可以抑制组胺的形成。破坏电荷核心后螺旋结构更加紧凑,局部结构的负电势减少,潜在致敏性减弱。

关键词： ara h 2 关键氨基酸分子动力学模拟致敏性评价

基于IgE表位精准识别检测花生主要过敏原ara h 2的研究

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基于IgE表位精准识别检测花生主要过敏原Ara h 2的研究

作者：燕燕赣南医学院

学位级别：硕士

目的:食物过敏已成为严重的全球性食品安全问题,且目前尚无有效根治方法。花生作为八大过敏性食物之一,花生过敏具有严重性、高发性等特点,通常难以治愈且伴随终生。Ig E表位是引起食物过敏反应的特异性氨基酸片段,以Ig E表位为靶点,对... 详细信息

目的:食物过敏已成为严重的全球性食品安全问题,且目前尚无有效根治方法。花生作为八大过敏性食物之一,花生过敏具有严重性、高发性等特点,通常难以治愈且伴随终生。Ig E表位是引起食物过敏反应的特异性氨基酸片段,以Ig E表位为靶点,对精准检测过敏原及预测其潜在致敏性具有重要意义。本研究以花生主要过敏原ara h 2及其Ig E表位为研究对象,通过分离纯化从花生中获得ara h 2,同时遴选并合成ara h 2的主要Ig E表位肽,制备表位单克隆抗体和表位多克隆抗体,基于Ig E表位抗体建立一种检测ara h 2的夹心ELISA方法,并评估所建方法的检测性能,旨在为花生过敏原的精准检测提供方法,为通过精准检测ara h 2 Ig E表位含量来快速评价花生致敏性提供核心元件和方法。方法:1.通过丙酮脱脂,利用Tris-hCl缓冲液提取花生脱脂粉中的蛋白,采用阴离子交换色谱层析技术和切胶回收技术对ara h 2进行分离纯化,通过SDS-PAGE对ara h 2的纯度进行分析。2.根据已报道的ara h 2 Ig E表位,用表位疫苗原理构建表位串联体,通过DNAStar软件和SOMPA网络服务器对串联体的结构进行分析确定串联体序列。利用原核表达技术制备重组表位串联体蛋白,通过亲和纯化获得高纯度的串联体蛋白。以纯化的表位串联体蛋白为抗原,制备兔抗血清,并采用间接ELISA分析血清效价,然后利用Protein A亲和柱对效价较高的兔血清进行纯化,制备相应的Ig G抗体。最后采用ELISA表征抗体的特异性、灵敏性、表位识别能力等免疫学性质。3.通过氨基酸序列对比,筛选出ara h 2的高特异性Ig E表位,通过杂交瘤技术制备特异性识别Ig E表位的单克隆抗体。通过ELISA分析Ig E表位单克隆抗体的亲和力、表位识别能力、特异性、亚型等免疫学性质。4.以Ig E表位单克隆抗体为捕获抗体,Ig E表位多克隆抗体为检测抗体,建立精准检测花生样品中ara h 2 Ig E表位含量的夹心ELISA方法,并对检测方法的工作条件进行优化,分析其灵敏性、特异性、准确度、精确性、加标回收率等检测能力。结果:1.通过分离纯化,制备了纯度为94.44%的花生致敏蛋白ara h 2。2.确定串联体的结构为:T-GGGG-B1-GGGG-B2-GGGG-B3-GGGG-B4-GGGG-B5-GGGG-B6-GGGG-B7-GGGG-B8-GGGG-B9-GGGG-B10-GGGG-B11-GGGG-B12,DNAStar软件和SOMPA网络服务器分析结果表明各表位在串联体中具有独立的免疫原性。通过原核表达和亲和纯化,制备出纯度为88.56%的表位串联体重组蛋白。用纯化的重组蛋白免疫兔子后,获得了效价为4万(兔1)和16万(兔2)的兔抗血清,ELISA结果表明,所制备的多克隆的抗体能够识别所有的表位肽及其阻断肽,且具有良好的特异性。3.通过杂交瘤技术,筛选出2K9-1和2K9-2两株单克隆细胞株,两个抗体对ara h 2的亲和力分别为1.69×10 L/mol和1.53×10 L/mol;对表位肽的抑制率分别为41.33%和35.83%;除了与栗子蛋白和核桃蛋白存在轻微交叉反应外,对β-乳球蛋白、小麦蛋白、开心果蛋白等12种蛋白均无交叉反应;抗体类型均为Ig G亚型(以Ig G1为主,含少量Ig G2a),不含Ig M和Ig A,轻链均为Igκ。4.基于ara h 2 Ig E表位抗体所建立夹心ELISA方法的最低检出限和最低定量限分别为0.98 ng/m L和3.9 ng/m L,线性检测范围为125–16,000 ng/m L,准确度为0.90%,板内和板间精密度分别为8.04%和10.71%;对5种样品的加标回收率为81.65%–107.79%。结论:本研究获得了高纯度的ara h 2,制备了特异性识别花生ara h 2多个Ig E表位的多克隆抗体,以及特异性识别Ig E表位的高亲和力单克隆抗体,并基于所制备的Ig E表位抗体建立一种高灵敏检测ara h 2的夹心ELISA方法。本工作将为基于ara h 2 Ig E表位精准检测快速预测花生致敏性提供核心元件和方法。

关键词：花生过敏 ara h 2 IgE表位抗体 ELISA

烘焙加工对花生主要过敏原蛋白ara h 2的结构和致敏性影响

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烘焙加工对花生主要过敏原蛋白Ara h 2的结构和致敏性影响

作者：常雪娇南昌大学

学位级别：硕士

和其他食物过敏相比,花生过敏症状严重,致死率高,是人类安全与健康的巨大威胁,也是主要的研究对象。花生中已被确认的过敏原蛋白有17种,ara h 2因其强烈的致敏性和极高的过敏患者血清IgE识别率而被认为是花生中最主要的过敏原蛋白之一... 详细信息

和其他食物过敏相比,花生过敏症状严重,致死率高,是人类安全与健康的巨大威胁,也是主要的研究对象。花生中已被确认的过敏原蛋白有17种,ara h 2因其强烈的致敏性和极高的过敏患者血清IgE识别率而被认为是花生中最主要的过敏原蛋白之一。烘焙作为一种常见的加工方式,会改变花生蛋白的高级结构,造成过敏原表位的破坏、暴露或生成,从而对花生蛋白的致敏性产生影响。本文以鲜花生和烘焙花生为研究对象,首先自制ara h 2免疫亲和柱,从中分离纯化ara h 2蛋白,并通过免疫印迹法结合质谱法鉴定亲和纯化获得的分离产物组分,然后对烘焙前后ara h 2单体的结构及性质进行表征,通过圆二色光谱法、紫外吸收光谱法分析烘焙加工对ara h 2高级结构的影响,通过不同的评估方法（竞争ELISA法和细胞模型）,比较烘焙前后ara h 2的潜在致敏性。本文的研究方法、主要结果及结论如下:1.用于免疫日本大耳兔的ara h 2通过离子交换层析法从新鲜花生中分离得到,经过12周的免疫后获得兔抗花生全蛋白血清及兔抗ara h 2血清,并通过ELISA法检测其效价。用Protein G亲和柱分离抗ara h 2的兔Ig G,以此作为配基制备自制免疫亲和柱,分别从鲜花生及烘焙花生中分离纯化ara h 2。结果显示:阴离子柱纯化的ara h 2纯度在90%以上,制备得到的兔抗花生全蛋白血清效价达1:60 000,兔抗ara h 2血清效价达1:100 000,以其中的兔抗ara h 2Ig G制备了免疫亲和柱,能够从鲜花生分离获得ara h 2,纯度达88.9%。亲和柱也能从烘焙花生中分离获得ara h 2及其衍生物,得到的分离产物中包括ara h2、ara h 6及一些大分子量的蛋白,其中ara h 2单体含量仅占整个泳道灰度的13.4%。2.通过兔血清免疫印迹和质谱法对鲜花生及烘焙花生纯化分离产物进行鉴定,结合ara h 2空间结构模型初步分析烘焙加工对ara h 2结构的影响。结果表明,经亲和纯化后,从鲜花生中得到了ara h 2（含少量的ara h 6）,而烘焙花生的亲和分离产物组分较复杂:除ara h 2、ara h 6单体外,在分子量70 k Da附近有多条条带,在分子量43 k Da附近也有一明显条带,其中包含ara h 2、ara h 6与ara h 1、ara h 3的交联产物,这证实了烘焙加工会引起蛋白之间的交联反应。质谱分析显示在鲜花生分离产物中检测到ara h 2的20条肽段,而烘焙后检测到的ara h 2肽段数目减少,只有11条,其中差异肽段主要集中在第二个螺旋末端、第五个螺旋前端及无规卷曲区域,表明烘焙加工会对ara h 2的高级结构产生影响,改变酶切位点的暴露情况,从而造成检测肽段的差异。3.利用圆二色光谱法和紫外光谱法研究烘焙加工对花生蛋白ara h 2单体高级结构的影响,结果表明:通过阴离子柱纯化得到的鲜花生中ara h 2（Ion-Exchange Chromatography Purified Native ara h 2,IPN ara h 2）与通过自制免疫亲和柱纯化得到的鲜花生中ara h 2（Afficity Chromatography Purified Native ara h 2,APN ara h 2）在结构上无明显差异,IPN ara h 2和APN ara h 2二级结构中α-螺旋的含量分别为27.1%和25.7%,无规则卷曲含量分别为27.9%和29.1%,紫外吸收峰相差不大,说明纯化方法对ara h 2的结构并无影响。而烘焙加工会使ara h 2的α-螺旋含量减少,无规卷曲含量增多,亲和纯化分离得到的烘焙花生中ara h 2（Afficity Chromatography Purified Baked ara h 2,APB ara h2）的α-螺旋含量为21.6%,无规卷曲含量为34.3%,紫外吸收峰明显升高,说明高温烘焙下的蛋白趋于无序,整体结构变得更加舒展。4.烘焙加工导致花生蛋白ara h 2的结构发生变化,进而影响其致敏性。利用花生过敏患者血清,采用免疫印迹法表征了鲜花生及烘焙花生亲和分离产物的IgE结合情况,通过竞争ELISA法测定了烘焙前后ara h 2单体的IgE结合能力,以人外周血嗜碱性粒细胞KU812脱颗粒作用释放的细胞因子水平评估烘焙前后ara h 2单体的致敏性变化。结果表明:免疫印迹中鲜花生及烘焙花生的亲和分离产物的主要显色部分在ara h 2、ara h 6条带的位置,烘焙花生中的过敏原交联产物显色较弱,这显示交联后的过敏原蛋白,其IgE结合能力较弱。ELISA结果显示不同纯化方法得到的鲜花生ara h 2的IC50值分别为0.156μg/m L和0.158μg/m L,烘焙后A

关键词：花生 ara h 2 烘焙加工结构致敏性

结构定向改造对花生过敏原ara h 2潜在致敏性影响研究

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结构定向改造对花生过敏原Ara h 2潜在致敏性影响研究

作者：任林妹南昌大学

学位级别：硕士

花生过敏由于其持久性和威胁生命的特性而被列为最严重的食物过敏反应之一。花生作为食物配料被广泛使用,日常饮食难以完全避免花生的摄入,降低花生过敏原致敏性的研究受到越来越多的关注。ara h 2是花生主要过敏原之一,能被90%以上的... 详细信息

花生过敏由于其持久性和威胁生命的特性而被列为最严重的食物过敏反应之一。花生作为食物配料被广泛使用,日常饮食难以完全避免花生的摄入,降低花生过敏原致敏性的研究受到越来越多的关注。ara h 2是花生主要过敏原之一,能被90%以上的花生过敏患者的血清识别,它的四对二硫键、三个主要过敏原线性表位,以及其中的关键氨基酸已经被定位。过敏原蛋白与Ig E结合能力由其结构决定,研究结构变化对ara h 2潜在致敏性的影响,可以为探索降低ara h 2的致敏性的加工方法指示方向。本研究以花生主要过敏原蛋白ara h 2为研究对象,为探究二硫键和主要线性过敏原表位对蛋白致敏性的影响,设计了五个ara h 2突变体。通过基因工程技术获得重组蛋白,利用分子动力学模拟获得突变前后蛋白高级结构,并与结构表征实验数据进行比较验证,使用体外致敏性评估方法评价突变后蛋白潜在致敏性变化,揭示结构定向改造对花生过敏原ara h 2潜在致敏性的影响。研究的主要方法、结果与结论如下:1.根据ara h 2突变肽多肽阵列结果,选择两组低Ig E结合能力的关键氨基酸突变体破坏线性表位:Q34Y/E38Y破坏线性表位1(ELQGDRRCQSQLER),Y65D/Y72D破坏线性表位2(RDPYSPSQDPYSPS)。根据ara h 2四对二硫键的空间位置,将连接同一个α-螺旋的半胱氨酸对分为一组:C104G/C152G/C45G/C103G破坏与α-螺旋3相连的两对二硫键(分别与α-螺旋2、α-螺旋5相连),C118G/C160G/C33G/C116G破坏与α-螺旋4相连的两对二硫键(分别与α-螺旋1、无规则卷曲相连),其中C位于表位1中。设计五种突变体:突变体1突变所有两组半胱氨酸;突变体2破坏连接α-螺旋3的二硫键、线性表位1和线性表位2;突变体3破坏连接α-螺旋4的二硫键、线性表位1和线性表位2;突变体4破坏连接α-螺旋3的二硫键和线性表位2;突变体5破坏连接α-螺旋4的二硫键和线性表位2。野生型ara h 2及五种ara h 2突变体通过大肠杆菌BL21(DE3)原核表达,利用镍离子亲和柱梯度洗脱纯化,获得的蛋白纯度均在85%之上。2.将SWISS-MODEL同源建模的结果导入分子动力学模拟软件Gromacs进行结构优化,蛋白螺旋的长度、弯曲度发生改变。软件模拟结果显示,丢失二硫键的突变体二级结构改变,突变体的α-螺旋部分向β-转角转化,丢失四对二硫键的突变体1的β转角含量上升7.41%,螺旋含量降低5.18%。四对二硫键对蛋白、关键氨基酸和芳香族残基的溶剂可及表面积都有明显影响,突变体1溶剂可及表面积最小,为2451.1(?)。Q34Y/E38Y突变后蛋白中关键氨基酸的暴露面积降低,突变Q34Y/E38Y的突变体2和突变体3的关键氨基酸的溶剂可及表面积低于不突变Q34Y/E38Y的突变体4和突变体5(分别为2559.4(?)、2496.8(?)、2684.5(?)、2860.3(?)),也都低于ara h 2的关键氨基酸溶剂可及表面积(为2929.8(?)),这表明突变后蛋白结构变紧凑,暴露的关键氨基酸被遮蔽。3.使用圆二色谱法分析突变前后蛋白二级结构变化,发现丢失C-C和C-C后蛋白更倾向于向β-转角转化,而不易形成α-螺旋,突变体2和突变体4(突变C-C和C-C)比突变体3和突变体5(C-C和C-C)的α-螺旋的含量都更低,而β-转角含量都更高,与软件模拟结果一致。软件模拟结果与圆二色谱结果相比,不同蛋白二级结构的数量有所不同,但大部分突变体二级结构组成的变化趋势一致。紫外光谱结果显示,二硫键丢失使得蛋白紫外吸强度降低,突变后蛋白的三级结构更加紧凑,与软件模拟芳香族残基溶剂可及表面积结果一致。丢失C-C/C-C后蛋白结构更紧凑,突变体3和突变体5(C118G/C160G/C33G/C116G)的紫外吸收强度低于突变体2和突变体4(C104G/C152G/C45G/C103G)。使用竞争ELISA评估突变前后蛋白潜在致敏性变化。与天然ara h 2相比,所有突变体的Ig E结合能力都降低。野生型ara h 2与天然ara h 2的Ig E结合能力相当,因为重组蛋白与天然蛋白结构相似。关键氨基酸突变对Ig E结合能力的影响低于二硫键丢失对Ig E结合能力的影响,C-C/C-C丢失对蛋白Ig E结合能力影响较大,突变C-C/C-C的突变体5的Ig E结合能力最低,IC50值为5.45μg/m L。本研究通过突变破坏ara h 2的二硫键和主要线性表位,探究结构改变对蛋白致敏性变化的影响。研究结果显示突变使得蛋白更易形成β-转角结构,关键氨基酸溶剂可及表面积降低,蛋白结构变紧凑,潜在致敏性降低。与破坏线性表位相比,二硫键丢失对蛋白潜在致敏性影响更大。

关键词：花生过敏 ara h 2 分子动力学重组表达三维结构

转谷氨酰胺酶催化花生过敏原ara h 2反应体系的研究

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转谷氨酰胺酶催化花生过敏原Ara h 2反应体系的研究

作者：赵瑞芳南昌大学

学位级别：硕士

花生是世界粮农组织认证的八大食物过敏原之一,花生可导致严重的过敏反应,甚至危及生命,且一般不随年龄的增长而消失。随着人们生活水平的提高,食物过敏的问题越来越受到关注,因此也越来越多的研究致力于降低花生过敏原的致敏能力。本... 详细信息

花生是世界粮农组织认证的八大食物过敏原之一,花生可导致严重的过敏反应,甚至危及生命,且一般不随年龄的增长而消失。随着人们生活水平的提高,食物过敏的问题越来越受到关注,因此也越来越多的研究致力于降低花生过敏原的致敏能力。本文以花生中主要过敏原ara h 2为研究对象,由于ara h 2是花生蛋白中重要的过敏原,因此降低ara h 2的致敏性有重要的实际意义。本研究对微生物转谷氨酰胺酶(microbal transglutaminase,MTGase)与ara h 2蛋白的反应体系中,不同条件对反应体系的影响进行了探究,分析了酶催化产物结构的变化,评估了加工后ara h 2消化性及其潜在致敏性的变化。研究还将还原蛋白的交联产物进行分离,得到低聚物及高聚物,分析了它们的结构及性质的区别。研究的主要方法、结果及结论如下:***催化还原ara h 2产物在SDS-PAGE电泳上有大分子聚合物产生,说明蛋白发生了外交联反应,另外与天然ara h 2相比,酶催化反应后ara h 2单体条带发生下移,显示蛋白的结构变得更加紧凑,平均粒径减小,质谱鉴定证实ara h 2发生了内交联反应。体系中还有脱酰胺反应发生,研究测定了MTGase催化的还前后蛋白溶液ph值的变化,发现溶液ph都升高,这是由于氨基脱落造成的。不论还原前后,每分子ara h 2脱落游离氨的个数均大于2,证明体系中都有脱酰胺反应发生。因此,酶催化还原蛋白发生了三种反应,即:外交联反应,内交联反应,脱酰胺反应,而酶直接催化ara h 2则仅发生了内交联和脱酰胺反应,未发现外交联。2.研究了蛋白浓度、反应温度及还原程度对MTGase催化ara h 2反应体系的影响。对于MTGase催化还原ara h 2的体系,蛋白浓度较高时有利于发生外交联反应,低浓度有利于发生内交联反应;还原则更有利于暴露谷氨酰胺残基,有利于蛋白发生脱酰胺作用。对于MTGase催化天然ara h 2的体系,反应不受蛋白浓度的影响,而脱酰胺作用随着温度的增加而增强。3.利用质谱结合软件的方法,确定了内交联的交联位点,并利用圆二色谱,紫外光谱及荧光光谱检测了酶催化反应后ara h 2二三级结构及表面疏水性的变化。酶催化天然蛋白只找到1对交联片段,而还原蛋白有18对交联片段,5个交联位点,其中13个片段都包含了过敏原表位,4个交联位点都在过敏原表位中,且涉及到的过敏原表位包含了ara h 2 10个线性表位中的5个。酶催化的天然蛋白结构变化不明显,而还原可以打开蛋白结构,破坏α-螺旋结构,α-螺旋结构减少,同时β-折叠和无规则卷曲结构增多。还原蛋白交联产物中低聚物α-螺旋含量高于聚物,且紫外吸收低于高聚物,表面疏水性高于高聚物,表明低聚物蛋白有更紧密的结构。4.采用体外模拟胃肠消化的方法分析了MTGase催化对ara h 2消化性的影响。天然ara h 2耐胃消化,但经过胃消化后再经肠消化,ara h 2可以被消化,在消化80min时仍有部分13kDa的片段存在。酶直接处理不改变ara h 2的胃肠消化特性,而还原和交联处理则可以加快ara h 2的消化速率,还原及交联产物在经过胃肠消化后,都可以全部被消化为小于3.5kDa的片段。且交联产物中高聚物的消化速率高于低聚物的消化速率,这主要是由于低聚物中内交联蛋白的紧密结构可以降低交联产物的消化速率。5.采用竞争抑制ELISA法检测MTGase催化对ara h 2抗原性及潜在致敏性的影响。酶直接处理基本不改变ara h 2的IgG结合能力,还原处理可以降低IgG结合能力,但是不显著,而还原后再交联则可以降低ara h 2的IgG结合能力,且高聚物的IgG结合能力比低聚物降低的更多。IgE结合能力结果与IgG结合能力相似,同样是高聚物的结合能力最低。经过模拟胃肠消化后,仍然是高聚物的IgG结合能力最低。由于蛋白浓度较高时反应更倾向于产生高聚物,因此可以通过适当的增加蛋白浓度,促进外交联减少内交联,以期获得潜在致敏性较低的加工产物。

关键词： ara h 2 微生物转谷氨酰胺酶内交联低聚物高聚物交联位点消化性致敏性

利用自制免疫亲和层析柱纯化抗ara h 2抗体

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利用自制免疫亲和层析柱纯化抗Ara h 2抗体

双抗体夹心ELISA检测花生致敏蛋白ara h 2的方法建立

第十一届全国免疫学学术大会

作者：李坤詹少德吴志华陈红兵南昌大学食品科学与技术国家重点实验室

目的 :近年来,抗体已经被广泛应用于体内/外的科学研究中,不仅应用于细胞内/外蛋白的识别与定位,在以抗原抗体特异性反应作为理论基础的免疫亲和分离或检测分析中,高效价的抗体更是一种不可或缺的重要工具。本研究利用自制免疫亲和层析... 详细信息

目的 :近年来,抗体已经被广泛应用于体内/外的科学研究中,不仅应用于细胞内/外蛋白的识别与定位,在以抗原抗体特异性反应作为理论基础的免疫亲和分离或检测分析中,高效价的抗体更是一种不可或缺的重要工具。本研究利用自制免疫亲和层析柱(Immunoaffinity Chromatography Columns,IAC)纯化抗ara h 2的多克隆抗体。方法 :首先利用离子交换层析柱从花生中纯化得到ara h 2蛋白,以此作为抗原,采用多点皮下注射的方式免疫日本大耳兔,获得高效价血清备用。然后利用纯化的ara h 2制备免疫亲和层析柱,并对多克隆抗体进行纯化,并与商业购买的已被成功用于纯化多克隆抗体的抗体亲和免疫球蛋白G琼脂糖高速流动树脂(Mab Affinity Protein G Agarose high Flow Resin,MPG)进行比较。结果 :尽管自制免疫亲和层析柱的柱容量只有商购MPG柱的40%左右,但在纯化效率上,自制柱的纯化因子为126.6,高于MPG的77.3。结论 :实验数据表明,与商购MPG柱相比,自制免疫亲和层析柱纯化出来的目标抗体效价较高。此外,与商购MPG柱相比,自制柱的制备成本低廉,可广泛适用于实验室抗体纯化工作。

关键词：花生过敏原 ara h 2 多克隆抗体免疫亲和层析分离纯化

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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食品工业 2021年第3期42卷 290-293页

作者：王耀刘胜男邢荣花张淑霞王玲玲郭保宝河南科技大学食品与生物工程学院洛阳471023 三门峡海关三门峡472000 安阳海关安阳455002 郑州海关技术中心郑州450002 三门峡市检验检疫中心三门峡472000

根据双抗体夹心检测原理,以ara h 2鼠源单抗(mAb)为捕获抗体, ara h 2兔源多抗(pAb)为检测抗体,建立ELISA方法,通过棋盘法优化抗体工作浓度,并对方法的灵敏度、准确度、特异性、稳定性等检测特性进行鉴定。结果表明, mAb和pAb最佳工作... 详细信息

根据双抗体夹心检测原理,以ara h 2鼠源单抗(mAb)为捕获抗体, ara h 2兔源多抗(pAb)为检测抗体,建立ELISA方法,通过棋盘法优化抗体工作浓度,并对方法的灵敏度、准确度、特异性、稳定性等检测特性进行鉴定。结果表明, mAb和pAb最佳工作浓度分别为1︰15 000稀释和1︰10 000稀释,在此基础上建立的标准曲线线性范围为2~128 ng/mL,检测限为2.32 ng/mL,添加回收试验平均回收率为87.6%~93.3%,且方法与其他常见致敏蛋白无交叉反应,并可在4℃避光密封条件下保持90 d内检测结果稳定。所建立的双抗体夹心ELISA方法检测特性良好,可用于花生致敏蛋白ara h 2快速筛查,为食品标签中花生致敏物质标识信息的高效监管提供技术支撑。

关键词：花生致敏蛋白 ara h 2 ELISA 检测特性

Polylysine-modified DNA vaccine showed elevated prophylactic and therapeutic effects in peanut allergy in mice

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Polylysine-modified DNA vaccine showed elevated prophylactic...

三种2S白蛋白过敏原的交叉识别及其共同结构研究

第十一届全国免疫学学术大会

作者： Zhu Zhenlai Sun Shuhong Niu Yuan Li Wei Department of Dermatology Xijing HospitalFourth Military Medical University

Objective:The prevalence of food allergy has been increasing,but the treatment is very *** vaccination hasbeen recognized as a promising method for the treatment of allergic diseases;however,poor immunogenicity has hindered its *** the present study,we assessed the prophylactic and therapeutic effects of poly-L-lysine(PLL)-pretreated DNA vaccine encoding the major peanut allergen ara h 2 in ***:BALB/c mice were intradermally injected with plasmid DNA encoding the peanut protein ara h 2(p ara h 2) or p ara h 2 pre-treated with PLL before or after sensitization with ara h 2 *** h 2-specific antibodies were measured by *** cells(LCs) and Treg cells in draining lymph nodes were analyzed by flow cytometry after DNA immunization,and IL-10 production in splenocytes was also ***:In the prophylactic study,pre-treatment with p ara h 2 or PLL-p ara h 2 resulted in lower level of ara h 2-specific Ig G1,Ig G2 a and Ig E after sensitization with ara h 2 protein,and mice in PLL-p ara h 2 group showed significantly lower level of antibodies than that of p ara h *** the treatment study,intradermal injection with p ara h 2 or PLL-p ara h 2 after ara h 2 protein sensitization significantly decreased the level of ara h 2-specific antibodies,and PLL-p ara h 2 had stronger effects than p ara h *** were increased numbers of LCs and Treg cells in the mice receiving intradermal injection with PLL-p ara h 2,and splenocytes from PLL-p ara h 2-treated mice secreted increased level of ***:Modification of pA ra h 2 with PLL improved its prophylactic and therapeutic effects in peanut allergy in mice.

关键词： ara h 2 Allergy vaccines Peanut allergy Polylysine Regulatory T cells

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三种2S白蛋白过敏原的交叉识别及其共同结构研究

作者：唐宇南昌大学

学位级别：硕士

花生和坚果都是会引起严重过敏反应的食物过敏原,且花生和坚果的交叉过敏反应很常见,有研究发现坚果和花生中的2S白蛋白与IgE介导的对花生或特定坚果的过敏反应高度相关。2S白蛋白的氨基酸序列相似度较低,但高级结构比较保守,不同2S白... 详细信息

花生和坚果都是会引起严重过敏反应的食物过敏原,且花生和坚果的交叉过敏反应很常见,有研究发现坚果和花生中的2S白蛋白与IgE介导的对花生或特定坚果的过敏反应高度相关。2S白蛋白的氨基酸序列相似度较低,但高级结构比较保守,不同2S白蛋白之间的相似高级结构可能是交叉过敏反应中与IgE结合的关键部位。这为寻找2S白蛋白识别的关键结构,尤其是构象表位提供了新的视角。本文以花生、腰果和巴西坚果为研究对象,首先通过阴离子交换层析分离得到它们的2S白蛋白过敏原ara h 2、Ana o 3和Ber e 1,并通过LC-MS/MS和免疫印迹法对纯化的Bere 1进行鉴定。用不同过敏患者的血清IgE测定三种2S白蛋白过敏原之间的交叉识别效率和竞争抑制强度。通过圆二色光谱和紫外吸收光谱表征三种2S白蛋白的高级结构,同时采用分子动力学软件模拟它们的高级结构。最后综合血清学、结构表征和模拟的数据分析这三种2S白蛋白过敏原之间的共同结构,寻找可能的IgE识别表位。本文的研究方法、主要结果及结论如下:1.巴西坚果仁经过粉碎和脱脂后得到巴西坚果脱脂粉,使用PBS(0.01 mol/L,ph 7.2-7.4)浸提脱脂粉两次获得粗蛋白,采用阴离子交换层析法分离,获得纯化蛋白。经LC-MS/MS鉴定,纯化的蛋白为巴西坚果过敏原蛋白Bere 1,一轮纯化过程可得到蛋白超过20mg,目的蛋白得率为47.8%,纯度大于95%,纯化的蛋白能够被巴西坚果过敏患者的血清IgE准确识别。2.利用不同过敏患者的血清IgE对花生、腰果和巴西坚果全蛋白以及arah 2、Ana o 3和Bere 1三种2S白蛋白过敏原进行免疫识别和竞争抑制。在免疫印迹中花生过敏患者血清池中的IgE主要识别花生中的蛋白,坚果过敏患者血清池中的IgE则对花生、腰果和巴西坚果中的多种蛋白均有识别。单个坚果过敏患者血清中两个血清中的IgE只识别Ana o 3,其余五个血清均识别2种或3种2S白蛋白。通过竞争ELISA检测了三种全蛋白及2S白蛋白过敏原之间的抑制。结果显示腰果和巴西坚果全蛋白对花生全蛋白有一定的竞争抑制,Anao 3和Ber e 1对ara h 2也有一定的抑制,但均不超过50%,而ara h 2和Ber e 1对Ana o 3有超过50%的竞争抑制率。这些结果表明,花生、腰果和巴西坚果全蛋白之间存在一定的交叉识别,arah 2、Ana o 3和Bere 1之间也存在交叉识别。过敏原arah 2、Ana o 3和Ber e 1之间不仅存在相似的线性表位,可能还存在相似的高级结构可被同一 IgE识别。3.利用圆二色谱法和紫外光谱法表征ara h 2、Ana o 3和Ber e 1的二、三级结构,通过分子动力学模拟三种过敏原蛋白的结构,使用可视化软件对比模拟后蛋白质的结构。结果表明:三种2S白蛋白的二级结构组分含量差别不大,Ana o 3和Ber e 1的高级结构整体差别较小。ara h 2、Ana o 3和Ber e 1中的三组线性表位的序列、表面形貌及电荷分布相似,分别是ara h 2的线性表位31RRCQSQLER39 和 Ana o 3 的线性表位 33SGREQSCQRQFE44,ara h 2 的线性表位 104CNELNEFENNQR115 和 Ana o 3 的线性表位 72SLRECCQELQEV83,ara h 2的线性表位 142KRELRNLPQQ151 和 Ber e 1 的线性表位 120MRLAENIPSRCNLS133,上述可能都是它们被IgE交叉识别的线性表位。同样ara h 2、Ana o 3和Ber e 1中的三组带相同电荷氨基酸集中区域的空间结构相似,分别是ara h 2中的119EALQQIME129SD132L160CDL 和 Ana o 3 中的 22QF25EQ55E58QE61QEVD,Ana o 3中的 22Q25EQQ29F60L62EVD67C 和 Ber e 1 中的 89DESCRCE137CP,ara h 2 中的121L146R155RAPQRC162L 和 Ber e 1 中的 51Sh54RMYMR76Ph,上述可能都是它们被IgE交叉识别的共同结构,即它们的构象表位。本研究引入分子动力学模拟技术,以2S白蛋白过敏原为对象,比较交叉过敏蛋白的结构,寻找IgE交叉识别中,过敏原蛋白的共同结构。有望建立过敏原表位定位的新方法,实现多种过敏原蛋白表位的同步定位,让过敏原表位定位更准确高效,加深人们对食物过敏物质基础的认知。

关键词： ara h 2 Ana o 3 Ber e 1 交叉识别共同结构