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牦牛anxa5基因的克隆、序列分析及表达研究

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华北农学报 2023年第2期38卷 224-231页

作者：范依琳赵丹马妍岳永起冯欣欣张姬越字向东熊显荣付伟熊燕西南民族大学畜牧兽医学院四川成都610041 西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室四川成都610041 西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室四川成都610041

为了深入地讨论牦牛anxa5基因序列的特点,阐述其组织及细胞表达特性,通过采集牦牛不同组织样品,如心、肝、脾、肺、肾、子宫、卵巢、输卵管等,提取总RNA。采用PCR、生物信息学软件、实时荧光定量PCR、免疫组化等技术对牦牛anxa5基因进... 详细信息

为了深入地讨论牦牛anxa5基因序列的特点,阐述其组织及细胞表达特性,通过采集牦牛不同组织样品,如心、肝、脾、肺、肾、子宫、卵巢、输卵管等,提取总RNA。采用PCR、生物信息学软件、实时荧光定量PCR、免疫组化等技术对牦牛anxa5基因进行克隆、序列分析及表达特性研究。结果显示,牦牛anxa5基因CDS区长为966 bp,共编码321个氨基酸。与黄牛比较,发现共有6个碱基突变存在于牦牛anxa5基因中。黄牛与牦牛的核苷酸和氨基酸同源性大于99%,与其他哺乳动物进行氨基酸同源性比较,结果也均在90%以上,说明anxa5基因在长期进化中保守。在牦牛的肺组织中,anxa5基因表达量最高,与其他组织差异极显著(Panxa5在牦牛不同时期卵巢颗粒细胞中均有表达,且表达量随时间增长而逐渐升高。结果显示,培养72 h颗粒细胞中anxa5表达量极显著高于培养24,36 h颗粒细胞(Panxa5表达量极显著高于培养24 h颗粒细胞(P5),表明anxa5在黄体化的颗粒细胞中表达量更高。然而,免疫组化结果显示,anxa5的亚细胞定位于细胞质,在黄体细胞中表达较高。

关键词：牦牛 anxa5 基因克隆组织表达时序表达及定位

anxa5和KDR启动子多态性与中国汉族妇女复发性流产遗传风险关联性分析

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基因组学与应用生物学 2015年第11期34卷 2314-2318页

作者：王娟代晓璐薛文静张军重庆医科大学基础医学院重庆400016

为探讨anxa5与KDR基因启动子区多态性是否为中国汉族妇女复发性流产的危险因素,我们应用测序的方法检测anxa5-302T>G(rs1050606)和KDR-607T>C(rs55713360)多态性在RSA组(210例,病例组)和健康对照组(300例)中的基因型分布。检测结果:1 AN... 详细信息

为探讨anxa5与KDR基因启动子区多态性是否为中国汉族妇女复发性流产的危险因素,我们应用测序的方法检测anxa5-302T>G(rs1050606)和KDR-607T>C(rs55713360)多态性在RSA组(210例,病例组)和健康对照组(300例)中的基因型分布。检测结果:1 anxa5-302T>G 3种基因型在RSA组和健康对照组中的分布差异具有统计学意义(p5),携带GG、TG、GG+TG基因型,G等位基因,患RSA的相对风险分别增加(OR=3.043,p=0.049;OR=2.293,p=0.019;OR=2.448,p=0.006;OR=2.166,p=0.003);2 KDR-607T>C 3种基因型在RSA组和健康对照组中的分布差异具有统计学意义(p5),携带CC基因型,C等位基因,患RSA的相对风险分别增加(OR=4.353,p=0.001;OR=2.113,p=0.001)。由此可见,分别携带anxa5-302G,KDR-607C易感等位基因明显增加了RSA的患病风险。anxa5-302T>G,KDR-607T>C多态性位点是中国汉族妇女患RSA的危险因素。

关键词： anxa5 KDR 启动子基因多态性复发性流产

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anxa5在胃癌组织中的表达及临床意义

ANXA5在胃癌组织中的表达及临床意义

作者：周标南华大学

学位级别：硕士

目的:探讨anxa5在胃癌组织中的表达情况及其临床意义。方法:本实验随机收集2016年1月至2016年12月在南华大学附属第一医院经手术治疗后40例胃癌患者标本及临床资料,所有胃癌患者术前均未接受过化疗及放疗。标本术后经病理切片证实均诊... 详细信息

目的:探讨anxa5在胃癌组织中的表达情况及其临床意义。方法:本实验随机收集2016年1月至2016年12月在南华大学附属第一医院经手术治疗后40例胃癌患者标本及临床资料,所有胃癌患者术前均未接受过化疗及放疗。标本术后经病理切片证实均诊断为胃癌。40例癌旁组织取自相对应距肿块边缘2cm标本。5例正常胃粘膜组织取自距肿块边缘5cm以上标本。采用Western Blot实验技术检测anxa5蛋白在胃癌组织、相应癌旁组织、正常胃粘膜组织中表达水平情况及其与胃癌临床病理特征之间的关系;采用免疫组织化学(IHC)检测anxa5蛋白在胃癌石蜡切片中表达强度且分析anxa5蛋白表达与胃癌临床病理特征之间的关系。结果:Western Blot检测anxa5蛋白在胃癌组织、相应癌旁组织及正常胃粘膜组织中表达情况,结果示:在40例胃癌组织、相应癌旁组织及5例正常胃粘膜组织中,anxa5蛋白均有表达。且anxa5蛋白在三者之中表达强度示:癌组织5差异有统计学意义;相应癌旁组织与正常胃粘膜组织比较,P5差异有统计学意义;通过免疫组化SP法检测40例胃癌石蜡切片中的anxa5蛋白在胃癌组织中的表达强度,发现anxa5蛋白主要定位在胃癌细胞浆内;在40例胃癌标本中anxa5蛋白阳性表达有33例,其中表达强度评分:23例1+;6例2+;4例3+;发现有7例anxa5蛋白呈阴性表达。同时,将40例胃癌患者按性别、年龄、肿瘤直径大小、分化程度、Borrmann分型、浸润深度、临床分期及淋巴结转移进行分组,采用单因素方差比较anxa5/β-actin相对表达量与各分组之间有无相关性。结果示:anxa5蛋白在胃癌组织表达水平与胃癌Bormann分型、分化程度、肿瘤病理分期、浸润深度及淋巴结转移有关(P5),与胃癌患者性别、年龄、肿瘤直径大小等无关(P>0.05)。anxa5蛋白表达在Bormann III-IV分型、未-低分化、III-IV病理分期、浸润深度T3-T4、有淋巴结转移的胃癌组织中较Bormann I-II分型、中-高分化、I-II病理分期、浸润深度T1-T2、无淋巴结转移胃癌组织中明显下调;在免疫组化法中将40例胃癌石蜡切片中anxa5蛋白表达与所对应患者的性别、年龄、肿瘤直径大小、分化程度、Borrmann分型、浸润深度、临床分期及淋巴结转移进行分组比较,结果示:anxa5在胃癌组织表达水平与胃癌Bormann分型、分化程度、肿瘤临床分期、浸润深度及淋巴结转移有关(P5),而与胃癌患者性别、年龄、肿瘤直径等无关(P>0.05)。结论:1、anxa5蛋白在胃癌组织中较相应的癌旁及正常胃粘膜组织表达下调。2、anxa5蛋白表达与胃癌分型、分化程度、浸润深度及淋巴结转移相关。

关键词： anxa5 膜联蛋白胃癌临床病理

anxa5通过ERK1/2通路调控小鼠肝癌Hca-F细胞恶性行为

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Anxa5通过ERK1/2通路调控小鼠肝癌Hca-F细胞恶性行为

作者：魏斌大连医科大学

学位级别：硕士

背景:恶性肿瘤的早期淋巴道转移致患者死亡率高、预后差,其发生机制一直是肿瘤学的研究难题。膜联蛋白A5（Annexin a5,anxa5）是膜联蛋白家族（Annexins）成员,为Ca2+依赖性磷脂结合蛋白。多项研究表明,anxa5异常表达与肿瘤发生发展、... 详细信息

背景:恶性肿瘤的早期淋巴道转移致患者死亡率高、预后差,其发生机制一直是肿瘤学的研究难题。膜联蛋白A5（Annexin a5,anxa5）是膜联蛋白家族（Annexins）成员,为Ca2+依赖性磷脂结合蛋白。多项研究表明,anxa5异常表达与肿瘤发生发展、转移、耐药性等密切相关。本课题组前期采用蛋白质组学和基因芯片发现anxa5在小鼠肝癌高淋巴道转移力Hca-F细胞中高表达,并通过siRNA干扰技术下调anxa5在Hca-F细胞中的表达,获得两株下调率不同的单克隆细胞株,且anxa5下调抑制Hca-F细胞的增殖能力。以上结果提示anxa5可能是潜在的促进肝癌淋巴道转移的分子。目的:1、探究anxa5稳定下调对Hca-F细胞侵袭、迁移、粘附能力的影响;2、探讨anxa5调控Hca-F细胞侵袭、迁移、增殖、粘附的分子机制,为肿瘤转移治疗提供理论基础和作用靶点。方法:1、实时定量PCR（qRT-PCR）和Western blot检测单克隆细胞株Hca-F-shRNA1和Hca-F-shRNA2的anxa5下调效率;2、Transwell小室和淋巴结原位杂交法检测anxa5下调对Hca-F细胞体外迁移、侵袭、粘附能力的影响;3、qRT-PCR和Western blot检测anxa5下调对增殖及侵袭、迁移相关分子c-jun、JNK、ERK、p38MAPK、AKT、MEK、E-cadherin表达变化的影响;4、Western blot检测anxa5下调对Hca-F细胞在ERK1/2抑制剂PD98059作用后p-c-jun（Ser73）及E-cadherin表达的影响。结果:1、与Hca-F-shControl相比,两株单克隆细胞Hca-F-shRNA1和Hca-F-shRNA2的mRNA水平下调率分别为72.3%和97.1%,蛋白水平下调率分别为43.9%和99.7%;2、与Hca-F-shControl相比,Hca-F-shRNA2细胞的迁移和侵袭分别降低了50.71%和49.84%（p＜0.05）,而Hca-F-shRNA1细胞的迁移和侵袭能力无明显变化（p＞0.05）;3、与Hca-F-shControl相比,Hca-F-shRNA2细胞的淋巴结粘附能力显著降低了61.71%（p＜0.01）;4、anxa5下调使p-ERK2的表达降低了92.7%（p＜0.01）,而对p-ERK1、JNK、p38MAPK、AKT、MEK无影响（p＞0.05）。5、anxa5下调使p-c-jun（Ser73）表达降低了68.3%（p＜0.05）;6、anxa5下调使E-cadherin在mRNA和蛋白水平分别升高了253.4%（p＜0.05）和808.0%（p＜0.001）;6、PD98059明显抑制Hca-F-shControl和Hca-F-shRNA2细胞p-ERK和p-c-jun（Ser73）的表达,同时显著促进Hca-F-shControl细胞E-cadherin的表达,但对Hca-F-sh RNA2细胞中E-cadherin表达无明显影响。结论:1、anxa5下调到一定程度才可以抑制Hca-F细胞的体外侵袭和迁移能力;2、anxa5下调抑制Hca-F细胞的体外淋巴结黏附能力,以此提示anxa5下调可能会抑制Hca-F细胞的体内淋巴结转移能力;3、anxa5下调通过抑制ERK而不是JNK,抑制p-c-jun（Ser73）的表达,以此来抑制Hca-F细胞的体外增殖能力;4、anxa5下调通过抑制ERK促进E-cadherin的表达,以此来抑制Hca-F细胞的迁移和侵袭能力;5、anxa5通过ERK通路调控小鼠肝癌Hca-F细胞恶性行为。

关键词： anxa5 Hca-F细胞淋巴道转移 ERK c-Jun E-cadherin

anxa5表达上调增强鼠肝癌Hca-P淋巴道转移潜能

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Anxa5表达上调增强鼠肝癌Hca-P淋巴道转移潜能

作者：彭博雅大连医科大学

学位级别：硕士

背景：淋巴道转移是影响恶性肿瘤患者预后和生存的主要因素，肿瘤淋巴道转移机制的研究可为其临床诊断和治疗提供依据。anxa5（AnnexinA5，膜联蛋白A5）是膜联蛋白家族一员。anxa5表达异常与肿瘤发生发展、侵袭、转移及耐药性等密切相... 详细信息

背景：淋巴道转移是影响恶性肿瘤患者预后和生存的主要因素，肿瘤淋巴道转移机制的研究可为其临床诊断和治疗提供依据。anxa5（AnnexinA5，膜联蛋白A5）是膜联蛋白家族一员。anxa5表达异常与肿瘤发生发展、侵袭、转移及耐药性等密切相关。但anxa5与肿瘤淋巴道转移关系的研究鲜有报道。本课题组前期采用基因芯片高通量筛选和蛋白质组学等技术对来源于同一鼠肝癌细胞克隆、遗传背景相同但淋巴道转移潜能显著不同的亚克隆细胞系Hca-F （淋巴结转移率约75%）和Hca-P （淋巴结转移率约25%）的研究表明，anxa5在Hca-F中的表达是其在Hca-P中的3.16倍，提示anxa5可能是潜在促进鼠肝癌淋巴道转移的蛋白。目的：1.检测anxa5在Hca-P和Hca-F中的差异表达;2.构建pcDNA3.1-V5/HisB-anxa5真核表达质粒，并转染至Hca-P，筛选获得anxa5表达稳定上调的Hca-P单克隆细胞株;3.观察上调anxa5后Hca-P细胞形态及亚显微结构的变化;4.探究anxa5表达上调对Hca-P体外增殖、迁移、侵袭及体内成瘤性及淋巴结转移能力的影响，为进一步研究淋巴道转移机制提供新线索。方法：1. Western blot检测anxa5在Hca-P和Hca-F中的表达;2. RT-PCR方法扩增小鼠全长anxa5编码序列，并将构建的pcDNA3.1-V5/HisB-anxa5表达质粒转染至Hca-P，G418筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株，同时建立稳定转染pcDNA3.1-V5/HisB空质粒的Hca-P细胞株作为对照，Western blot检测anxa5表达稳定上调的单克隆细胞株;3.倒置光学显微镜观察anxa5表达上调后Hca-P细胞形态的变化，透射电子显微镜观察上调anxa5后Hca-P细胞亚显微结构的变化;4. CCK-8法检测上调anxa5后Hca-P增殖能力变化，Transwell法检测anxa5表达上调对Hca-P体外迁移和侵袭能力的影响，通过小鼠足垫皮下注射分析anxa5表达量变化致Hca-P体内成瘤及淋巴结转移情况。结果：1. anxa5在Hca-F中的表达量是其在Hca-P中的.55倍;2.酶切及测序结果显示，pMD19-T-anxa5克隆质粒和pcDNA3.1-V5/HisB-anxa5表达质粒构建成功;***5上调导致细胞体积增大，细胞内粗面内质网和线粒体数量增加，线粒体肿胀，线粒体内嵴减少，基质密度降低;4.筛选获得anxa5表达稳定上调的单克隆细胞株anxa5-Hca-P-1、anxa5-Hca-P-2和anxa5-Hca-P-3，与Control-Hca-P相比，anxa5-Hca-P-1、 anxa5-Hca-P-2和anxa5-Hca-P-3中anxa5蛋白水平分别上调了15.0%、20.3%和67.7%;5. anxa5-Hca-P-1、anxa5-Hca-P-2相对于Control-Hca-P增殖明显加快，anxa5-Hca-P-3与Control-Hca-P相比增殖减慢;***5-Hca-P-1、anxa5-Hca-P-2和anxa5-Hca-P-3相比于Control-Hca-P的迁移能力分别提高了68.11%、60.15%和167.39%;7.与Control-Hca-P相比，anxa5-Hca-P-1、anxa5-Hca-P-2和anxa5-Hca-P-3的侵袭能力分别提高了47.18%、57.57%和100.03%;8. anxa5表达上调后各组间肿瘤大小无差异，但能促进肿瘤表观恶性程度;9. anxa5-Hca-P-1组和anxa5-Hca-P-3组淋巴结转移程度明显高于Control-Hca-P组，anxa5-Hca-P-3组淋巴结转移程度明显高于anxa5-Hca-P-1组。结论：***5在鼠肝癌淋巴道转移细胞株Hca-P和Hca-F中均有表达，且在Hca-P中表达低于Hca-F;2. anxa5表达上调导致细胞体积增大，细胞内粗面内质网和线粒体数量增加，线粒体肿胀，线粒体内嵴减少，基质密度降低;3. anxa5表达上调促进Hca-P增殖，但当anxa5上调到一定程度时反而抑制Hca-P增殖;4. Hca-P的迁移能力与anxa5的表达量呈正相关;5. anxa5表达上调促进Hca-P侵袭，且促进程度与anxa5的上调程度正相关;6. anxa5的表达与肿瘤表观恶性程度相关，与肿瘤大小无关;7. anxa5表达量增加促进Hca-P淋巴结转移，anxa5表达量增加越多，转移越明显，anxa5在肝癌细胞淋巴道转移中发挥重要作用，有望成为新的肝癌基因治疗的分子靶点。

关键词： anxa5 肝癌 Hca-P细胞增殖迁移侵袭

anxa5，KDR，MTHFR，MTRR基因单核苷酸多态性与中国汉族妇女复发性流产遗传风险关联性分析

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ANXA5，KDR，MTHFR，MTRR基因单核苷酸多态性与中国汉族妇女复发...

作者：王娟重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨anxa5,KDR,MTHFR,MTRR基因单核苷酸多态性与中国汉族妇女复发性流产人群遗传风险的关联性,以期在复发性流产病因上有所突破,为临床早期预防和个体化治疗,提供理论基础。材料和方法:首先运用Ospery软件构建蛋白分子网络筛选风... 详细信息

目的:探讨anxa5,KDR,MTHFR,MTRR基因单核苷酸多态性与中国汉族妇女复发性流产人群遗传风险的关联性,以期在复发性流产病因上有所突破,为临床早期预防和个体化治疗,提供理论基础。材料和方法:首先运用Ospery软件构建蛋白分子网络筛选风险基因,其次通过Novosnp3.0.1软件确定研究位点,最后采用PCR-Sanger直接测序法检测anxa5-302T>G(rs1050606)和KDR-607T>C(rs55713360),MTHFRC677T(rs1801133),A1298C(rs1801131),MTRRA66G(rs1801394)多态性位点在复发性流产组(RSA组)与健康对照组中的基因型分布情况。结果:1.经Hardy-Weinberg平衡定律检验,研究对象anxa5-302T>G(rs1050606)和KDR-607T>C(rs55713360),MTHFRC677T(rs1801133),A1298C(rs1801131),MTRRA66G(rs1801394)各基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg分布(P>0.05),说明以上基因型频率分布在中国汉族人群中已达到Hardy-Weinberg平衡,具有群体代表性。2.健康对照人群(272例),anxa5-302T>G基因型TT、TG、G G频率分别为62.5%、31.6%、5.9%;KDR-607T>C基因型TT、T C、CC频率分别为37.5%、46.3%、16.2%;MTHFRC677T基因型Cc、tc、tt频率分别为44.1%、53%、5.9%;复发性流产(rsa)组(194例)anxa5-302t>g基因型tt、tg、gg频率分别为54.6%、32%、13.4%。kdr-607t>c,tt、tc、cc频率分别为26.8%、32%,41.2%。复发性流产组(190例)mthfrc677t基因型cc、tc、tt频率分别为37.9%、42.2%、18.9%。以上基因型频率分布在健康对照组与rsa组分布中均具有统计学意义(p5)。mthfra1298c:aa/ac/cc,mtrra66g:aa/ag/gg基因型在rsa组和对照组中总体分布具有显著性差异(p5)。***回归分析显示:携带anxa5-302t>g位点gg,tg+gg基因型个体发生rsa的危险性比携带tt基因型个体高,or值分别为(p=0.027,or=2.889;p=0.020,or=1.911);kdr-607t>c.位点cc基因型与tt基因型相比,增加了rsa的患病风险(p=0.000,or=5.231);mthfrc677t位点携带tt基因型的个体发生rsa的危险性比携带cc基因型个体高(p=***=3.137)。mthfra1298c,mtrra66g位点基因型及等位基因rsa组与健康对照组比较,无显著性差异(p>0.05)。4.基因-基因交互作用分析:1个高危风险因子发生突变时,经分析,(or=3.722,95%ci(0.707-19.604),2个高危风险因子同时发生突变时,经分析,(or=32.469,95%ci(0.071-5.344),均具有统计学意义(p5)结论:mthfra1298c,mtrra66g位点各基因型频率在rsa组与健康对照组相比,无显著性差异(p>0.05),提示mthfra1298c,mtrra66g位点突变基因型的个体可能与中国汉族人群rsa的易感性无关。anxa5-302位点GG基因型,以及含有G等位基因的TG+GG基因型,KDR-607CC基因型,MTHFR 677 TT基因型显著性的增加了RSA的患病风险。说明anxa5-302T>G,KDR-607T>C,MTHF RC677T多态性位点是中国汉族妇女患RSA的危险因素。基因-基因相互作用分析:三者之间任一发生突变,使复发性流产的危险性增加(O R=5.220 P=0.000 95%CI=2.925-9.324);任两个发生突变,使复发性流产的危险性增加(OR=28.707 P=0.002 95%CI=3.592-229.449),有力的证明了构建的分子网络和遗传学血栓风险导致RSA的假说。

关键词： anxa5 KDR MTHFR MTRR 单核苷酸多态性复发性流产

anxa5、KDR基因启动子单核苷酸多态性与原因不明复发性自然流产关联性的分子机制研究

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ANXA5、KDR基因启动子单核苷酸多态性与原因不明复发性自然流产关...

作者：刘桂岑重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨anxa5、KDR基因启动子单核苷酸多态性在重庆地区原因不明复发性自然流产的作用机制,期望阐明候选基因高危突变诱发脐带内皮损伤、引起血栓形成而导致复发性流产的分子过程。建立并完善遗传性血栓风险致原因不明复发性自然流产... 详细信息

目的:探讨anxa5、KDR基因启动子单核苷酸多态性在重庆地区原因不明复发性自然流产的作用机制,期望阐明候选基因高危突变诱发脐带内皮损伤、引起血栓形成而导致复发性流产的分子过程。建立并完善遗传性血栓风险致原因不明复发性自然流产发生的临床模型,为患者制定完善的诊疗指南和安全可靠的临床干预方案。方法:在本研究中纳入非孕期原因不明复发性自然流产患者142例、健康体检女性107例,检测基因启动子单核苷酸多态性与原因不明复发性自然流产遗传风险关联性。构建不同基因型的重组质粒进行双荧光素酶检测验证基因启动子单核苷酸多态性对基因转录活性的影响。运用生物信息学方法预测分子二维结构是否发生改变及结合的具体的转录因子。结果:病例组anxa5(rs1050606)、KDR(rs55713360)突变纯合型等位基因频率均明显增高,rs1050606位点中G等位基因是原因不明复发性自然流产发病的危险因素,T等位基因降低了患病风险。rs55713360位点中C等位基因是原因不明复发性自然流产发病的危险因素,T等位基因降低了患病风险。anxa5、KDR野生型之间存在相互作用。不同基因型(6个位点全野生纯合、全突变纯合、单个位点突变纯合其余位点野生纯合)共6个重组质粒构建成功。anxa5、KDR基因双荧光素酶报告系统显示突变基因型相比野生型启动子上游调控序列转录活性明显降低。预测出ZBTB33、RELA、INSM1、REL这4个转录因子可能与anxa5(rs1050606)结合,TEAD4、NOTO、VSX1可能与KDR(rs55713360)结合,分子二维结构发生了改变。结论:anxa5(rs1050606)、KDR(rs55713360)突变基因型显著增加原因不明复发性自然流产遗传风险,为其危险因素。anxa5、KDR基因启动子单核苷酸多态性对基因转录活性有抑制作用,可能是由于基因高级结构的改变。

关键词：原因不明复发性自然流产 anxa5 KDR 启动子单核苷酸多态性转录活性

anxa5表达调控人肝癌HepG2细胞侵袭、转移及顺铂耐药性的作用及机制研究

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ANXA5表达调控人肝癌HepG2细胞侵袭、转移及顺铂耐药性的作用及机...

作者：陈晨大连医科大学

学位级别：硕士

背景:膜联蛋白A5(Annexin A5,anxa5),在多种组织中普遍表达。anxa5异常表达与多种恶性肿瘤相关;与原位肝癌组织相比,anxa5在肝门静脉瘤栓中高表达;在顺铂耐受的鼻咽癌细胞中也呈高表达。本课题组前期研究表明,anxa5表达水平影响小鼠肝... 详细信息

背景:膜联蛋白A5(Annexin A5,anxa5),在多种组织中普遍表达。anxa5异常表达与多种恶性肿瘤相关;与原位肝癌组织相比,anxa5在肝门静脉瘤栓中高表达;在顺铂耐受的鼻咽癌细胞中也呈高表达。本课题组前期研究表明,anxa5表达水平影响小鼠肝癌细胞(Hca-F/Hca-P)的增殖、迁移、侵袭等生物学功能,具有促进作用。本论文研究anxa5影响人Hep G2生物学行为及机制研究。目的:1、构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-anxa5表达载体,利用脂质体稳定转染至Hep G2中,筛选anxa5表达稳定下调单克隆细胞株及对照细胞株;2、研究anxa5对Hep G2体外增殖、迁移、侵袭、粘附、细胞骨架形成的影响及作用的分子机制;3、探究anxa5对Hep G2细胞cisplatin耐受性的影响。方法:1、根据人源anxa5的mRNA序列,设计特异性siRNA及无关序列,构建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-anxa5/NC表达载体;2、利用Lipofectamine TM 2000转染试剂转染重组质粒至Hep G2中,G418筛选及Western Blot验证获得anxa5表达稳定下调单克隆细胞株及对照细胞株;3、MTT法联合平板克隆形成实验探究anxa5对Hep G2体外增殖能力影响;4、Transwell小室法结合划痕实验探究anxa5对Hep G2体外迁移、侵袭能力影响;5、与细胞外基质、内皮细胞以及小鼠淋巴结粘附实验探究anxa5对Hep G2粘附能力影响;6、对微丝进行染色,探究anxa5对Hep G2细胞骨架影响;7、MTT法结合Hoechst 33342染色法检测anxa5对Hep G2顺铂(cisplatin)耐受性影响;8、Weatern Blot检测ERK信号通路关键分子、c-Myc表达变化;9、q RT-PCR检测E-Cadherin表达水平变化。结果:1、构建了p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-anxa5/NC表达载体,获得anxa5表达稳定下调单克隆Hep G2-sh anxa5及阴性对照Hep G2-sh NC细胞株。与Hep G2-sh NC相比,Hep G2-sh anxa5中anxa5下调近100%;2、Hep G2-sh anxa5较Hep G2-sh NC的增殖能力降低,平板克隆形成率降低24.7%;3、与Hep G2-sh NC相比,Hep G2-sh anxa5迁移能力降低70.0%;4、Hep G2-sh anxa5较Hep G2-sh NC侵袭能力降低85.0%;5、Hep G2-sh anxa5较Hep G2-sh NC对细胞外基质、内皮细胞、小鼠淋巴结的粘附能力分别降低10.2%、30.2%、48.0%;6、anxa5下调后,Hep G2细胞actin骨架染色变浅,F-actin结构性降低排列紊乱;7、Hep G2-sh anxa5较Hep G2-sh NC对cisplatin敏感性明显降低;8、与Hep G2-sh NC相比,Hep G2-sh anxa5中Raf、MEK1/2、ERK2的磷酸化水平降低,c-Myc蛋白水平降低,E-Cadherin m RNA水平升高。结论:1、筛选获得anxa5表达稳定下调及对照单克隆细胞株;2、anxa5下调抑制了Hep G2体外增殖能力;3、anxa5下调抑制了Hep G2体外迁移、侵袭、黏附、细胞骨架形成能力;4、anxa5下调可能通过ERK信号通路调控Hep G2的增殖、转移能力;5、anxa5下调增强Hep G2对cisplatin的耐受性。

关键词： anxa5 肝癌转移 ERK信号通路耐药性

anxa5真核表达质粒构建及其对小鼠肝癌Hca-P生物学行为的影响

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