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Versatile plant genome engineering using anti-crispr-Cas12a systems

Science China Life Sciences 2024年第12期67卷 2730-2745页

作者： Yao He Shishi Liu Long Chen Dongkai Pu Zhaohui Zhong Tang Xu Qiurong Ren Chuan Dong Yawei Wang Danning Wang Xuelian Zheng Fengbiao Guo Tao Zhang Yiping Qi Yong Zhang Integrative Science Center of Germplasm Creation in Western China (Chongqing) Science City Chongqing Key Laboratory of Tree Germplasm Innovation and Utilization School of Life Sciences Southwest University Department of Biotechnology School of Life Sciences and Technology Center for Informational Biology University of Electronic Science and Technology of China Sichuan Institute of Edible Fungi Sichuan Academy of Agricultural Sciences Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding/Zhongshan Biological Breeding Laboratory/Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education College of AgricultureYangzhou University Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops/Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology Yangzhou University Department of Respiratory and Critical Care Medicine Zhongnan Hospital of Wuhan University Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery Ministry of Education and School of Pharmaceutical Sciences Wuhan University Department of Plant Science and Landscape Architecture University of MarylandCollege Park Institute for Bioscience and Biotechnology Research University of Maryland

crispr-Cas12a genome engineering systems have been widely used in plant research and crop breeding. To date, the performance and use of anti-crispr-Cas12a systems have not been fully established in plants. Here, we conduct in silico analysis to identify putative anti-crispr systems for Cas12a. These putative anti-crispr proteins, along with known anti-crispr proteins, are assessed for their ability to inhibit Cas12a cleavage activity in vivo and in planta. Among all anti-crispr proteins tested, AcrVA1 shows robust inhibition of Mb2Cas12a and LbCas12a in E. coli. Further tests show that Acr VA1 inhibits LbCas12a mediated genome editing in rice protoplasts and stable transgenic lines. Impressively, co-expression of Acr VA1 mitigates off-target effects by crispr-LbCas12a, as revealed by whole genome sequencing. In addition, transgenic plants expressing AcrVA1 exhibit different levels of inhibition to LbCas12a mediated genome editing, representing a novel way of fine-tuning genome editing efficiency. By controlling temporal and spatial expression of AcrVA1, we show that inducible and tissue specific genome editing can be achieved in plants. Furthermore, we demonstrate that AcrVA1 also inhibits Lb Cas12a-based crispr activation(crispra) and based on this principle we build logic gates to turn on and off target genes in plant cells. Together, we have established an efficient anti-crispr-Cas12a system in plants and demonstrate its versatile applications in mitigating off-target effects, finetuning genome editing efficiency, achieving spatial-temporal control of genome editing, and generating synthetic logic gates for controlling target gene expression in plant cells.

关键词： anti-crispr Cas12a AcrVA1 off-target effects fine-tuning genome editing inducible and tissue specific genome editing crispra synthetic logic circuit

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crispr-Cas系统及anti-crispr蛋白在微生物中的研究进展

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微生物学报 2021年第8期61卷 2172-2191页

作者：徐娜龚云霞邵彦春高书山陈守文陈福生华中农业大学湖北省传统发酵食品国际科技合作基地湖北武汉430070 华中农业大学食品科学与技术学院湖北武汉430070 中国科学院微生物研究所微生物资源国家重点实验室北京100101 湖北大学生命科学学院湖北武汉430062

crispr-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISP)and crispr associated proteins)系统是细菌用来防御病毒、质粒等外源核酸入侵的一种获得性免疫防御系统。随着研究的深入,crispr-Cas系统已发展为一种重要的基因编辑工具,并成功应用于动物、植物和微生物的基因改造中。但该基因编辑方法有时存在基因脱靶效应,从而限制了其推广应用。最近,通过将1种新发现的抗crispr蛋白(anti-crispr protein,ACP)与crispr-Cas系统相结合,已成功开发出可控制基因脱靶效率的crispr-Cas基因编辑工具。本文首先对crispr-Cas系统及ACP进行了简要介绍,然后就crispr-Cas基因编辑工具及ACP在微生物基因改造的应用现状进行了综述,并对ACP介导的crispr-Cas基因编辑方法(ACP-crispr-Cas)在微生物基因编辑中的应用前景进行了讨论。

关键词： crispr-Cas anti-crispr 基因编辑微生物

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anti-crispr AcrIIA5抑制碱基编辑器并降低脱靶效应的研究

Anti-CRISPR AcrIIA5抑制碱基编辑器并降低脱靶效应的研究

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作者：梁明明吉林大学

学位级别：硕士

crispr系统的发现给生物技术和分子生物学领域带来了重大变革,包括在多种活细胞和生物体内的基因组编辑和基因表达的调控。虽然这项技术为生物学、医学、农业带来了潜在的好处,但随之而来的由于基因组编辑后产生的不可逆的副产物,包括... 详细信息

crispr系统的发现给生物技术和分子生物学领域带来了重大变革,包括在多种活细胞和生物体内的基因组编辑和基因表达的调控。虽然这项技术为生物学、医学、农业带来了潜在的好处,但随之而来的由于基因组编辑后产生的不可逆的副产物,包括基因组范围内广泛的突变以及激活P53导致细胞死亡等问题依然严峻。与Cas9核酸酶相比,碱基编辑器在没有造成DNA双链断裂的前提下,能够精确替换基因组中靶向位点的碱基。胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）能够将C·G碱基对替换为T·A碱基对,腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）能够将靶向位点的A·T碱基对替换为G·C碱基对。然而,最近大量的研究证据显示在基因编辑过程中一些不想要的副产物广泛存在,如在细胞、动物、植物和其它生物体基因组中出现的小片段的插入和缺失（indels）。此外,在使用CBE和ABE基因编辑系统编辑的细胞中,科学家证实存在大量的脱靶效应。因此,严重的脱靶效应极大的限制了将碱基编辑器应用于未来精准的基因治疗。最近研究发现,存在于细菌和噬菌体相互进化过程中产生的噬菌体编码的anti-crispr蛋白质,能够使自然界中某些crispr系统失活。由于crispr-Cas系统的多样性,crispr系统的拮抗剂也广泛的分布在噬菌体中。此外,科学家已经设计将anti-crispr蛋白应用于真核生物的基因编辑方面,包括用于crispr-Cas系统的光控调节、基因表达的调控以及crispr-Cas系统复合物含量的检测。在本研究中,由于BE3和ABE7.10系统都是基于crispr-Cas系统开发的定向碱基编辑器系统,因此,我们通过将碱基编辑器质粒与anti-crispr表达质粒共转染到HEK293T细胞中,通过基因组测序的方法筛选并鉴定碱基编辑器的抑制剂,实验结果表明在诸多抑制剂中AcrIIA2、Acr IIA4和Acr IIA5能够在哺乳动物细胞中有效抑制碱基编辑器BE3和ABE7.10系统,特别是一种新发现的抑制剂Acr IIA5具有较大的抑制作用。随后,我们通过将1:1、1:3、1:5等不同浓度梯度的抑制剂质粒与碱基编辑器系统共转染细胞,实验结果表明Acr IIA5在不同浓度下均能高效抑制碱基编辑器系统。此外通过将碱基编辑器变体质粒与anti-crispr表达质粒共转染到HEK293T细胞中,结果显示Acr IIA5能够抑制NGG PAM靶向的效率最强的C变T碱基编辑器Anc BE4max和A变G碱基编辑器ABEmax,还有NG PAM靶向的多种碱基编辑器NG-Anc BE4amx、NG-ABEamx、xCas9-AncBE4max和xCas9-ABEmax等变异体系统。我们进一步证明,在转染碱基编辑器质粒3或者6小时后,添加AcrIIA5可以显著降低碱基编辑器BE3和ABE7.10产生的脱靶效应。本研究表明,AcrIIA5能够作为一种广泛使用的精确控制碱基编辑器编辑的工具,而且为将来的基因治疗提供了新的技术基础。

关键词：碱基编辑器 anti-crispr 脱靶效应哺乳动物细胞基因治疗

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Ⅴ型anti-crispr蛋白结构与功能机制研究

Ⅴ型anti-CRISPR蛋白结构与功能机制研究

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作者：王宇航哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

crispr(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是细菌和古细菌在百万年的时间中在和噬菌体的对抗中获得的一种适应性免疫防御机制,该结构与一些功能相关的蛋白质(crispr-associated,Cas)合称crispr-Cas系统。由于其致突变效率高、操作简单及成本较低的特点,近年来对crispr/Cas系统的研究获得越来越广泛的关注。该系统迅速在各领域中得到广泛应用,被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。crispr蛋白是一类存在于细菌体内的免疫蛋白,在抵抗噬菌体侵染的过程中起到了至关重要的作用,在噬菌体侵染过后获得噬菌体的基因片段,进而编译到自身的DNA序列当中,在基因组上显示为一段重复序列即crispr,再利用其独有的通过RNA介导的特异性识别DNA序列能力,将再次侵染的噬菌体的DNA序列识别出来,利用crispr蛋白的结构域将噬菌体的DNA进行切割,达到免疫噬菌体的作用,而在亿万年的噬菌体和细菌的共进化过程中,噬菌体也进化出了可以抵抗crispr系统的机制,在这些机制中,作用最为明显的就是anti-crispr蛋白,anti-crispr蛋白普遍是编译在噬菌体的基因组中,在crispr蛋白起作用的各个关键节点中,其中anti蛋白与crispr的活性位点相结合阻碍crispr与底物结合这一个抑制机理是比较常见的机制。首先进行crispr及anti-crispr蛋白的纯化,然后进行复合物的组装,然后获得结构,获得结构主要有一下两种途径:1.复合物共结晶,得到晶体后在上海同步辐射光源进行数据收集后进行结构的解析,最终获得2.7A的蛋白质晶体结构;2.冷冻电镜,冷冻电镜收集数据后进行结构解析,最终获得蛋白质和anti蛋白的复合物结构。

关键词： crispr anti-crispr 蛋白纯化结构解析

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研究揭示新型anti-crispr蛋白作用机理

研究揭示新型anti-CRISPR蛋白作用机理

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中国科学报

作者：孟凌霄

本报讯（记者孟凌霄）中国科学院生物物理研究所研究员王艳丽团队与加拿大多伦多大学教授Alan Davidson团队合作，揭示了新型anti-crispr蛋白——AcrIF25的独特作用机制。相关研究近日发表于《自然》。crispr-Cas系统广泛分布于细菌和... 详细信息

本报讯（记者孟凌霄）中国科学院生物物理研究所研究员王艳丽团队与加拿大多伦多大学教授Alan Davidson团队合作，揭示了新型anti-crispr蛋白——AcrIF25的独特作用机制。相关研究近日发表于《自然》。crispr-Cas系统广泛分布于细菌和古生菌中，可有效抵御外源DNA的入侵；也......

关键词：作用机理 anti-crispr

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crispr-Cas adaptive immune systems in Sulfolobales:genetic studies and molecular mechanisms

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Science China(Life Sciences) 2021年第5期64卷 678-696页

作者： Zhenxiao Yu Suping Jiang Yuan Wang Xuhui Tian Pengpeng Zhao Jianan Xu Mingxia Feng Qunxin She crispr and Archaea Biology Research Center State Key Laboratory of Microbial TechnologyShandong UniversityQingdao 266237China State Key Laboratory of Agricultural Microbiology College of Life Science and TechnologyHuazhong Agricultural UniversityWuhan 430070China

crispr-Cas systems provide the small RNA-based adaptive immunity to defend against invasive genetic elements in archaea and *** of Sulfolobales,an order of thermophilic acidophiles belonging to the Crenarchaeotal Phylum,usually contain both type I and typeⅢcrispr-Cas *** species,Saccharolobus solfataricus and Sulfolobus islandicus,have been important models for crispr study in archaea,and knowledge obtained from these studies has greatly expanded our understanding of molecular mechanisms of antiviral defense in all three steps:adaptation,expression and crRNA processing,and *** subtypes of crispr-Cas systems are common in these organisms,including I-A,I-D,Ⅲ-B,andⅢ-*** cas genes form functional modules,e.g.,all genes required for adaptation and for interference in the I-A immune system are clustered together to form aCas and i Cas *** assays have been developed to study mechanisms of adaptation and interference by different crispr-Cas systems in these model archaea,and these methodologies are useful in demonstration of the protospacer-adjacent motif(PAM)-dependent DNA interference by I-A interference modules and multiple interference activities byⅢ-B Cmr *** effector complexes have been isolated for SulfolobalesⅢ-B andⅢ-D systems,and their biochemical characterization has greatly enriched the knowledge of molecular mechanisms of these novel antiviral immune responses.

关键词： crispr-Cas adaptation crRNA processing PAM-dependent DNA interference RNA-activated Cas10 activities spatiotemporal regulation cOA signaling anti-crispr Sulfolobales

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Inhibition mechanisms of crispr-Cas9 by AcrⅡA25.1 and AcrⅡA32

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Science China(Life Sciences) 2024年第9期67卷 1781-1791页

作者： Jianlin Zheng Yuwei Zhu Tengjin Huang Wenbo Gao Jiale He Zhiwei Huang HIT Center for Life Sciences School of Life Science and TechnologyHarbin Institute of TechnologyHarbin 150080China Westlake Center for Genome Editing Westlake Laboratory of Life Sciences and BiomedicineSchool of Life SciencesWestlake UniversityHangzhou 310024China

In the ongoing arms race between bacteria and bacteriophages,bacteriophages have evolved anti-crispr proteins to counteract bacterial crispr-Cas ***,AcrⅡA25.1 and AcrⅡA32 have been found to effectively inhibit the activity of Spy Cas9 both in bacterial and human ***,their molecular mechanisms remain ***,we report the cryo-electron microscopy structures of ternary complexes formed by AcrⅡA25.1 and AcrⅡA32 bound to Spy Cas9-sg *** structural analysis and biochemical experiments,we revealed that AcrⅡA25.1 and AcrⅡA32 recognize a novel,previously-unidentified anti-crispr binding site on Spy *** found that both AcrⅡA25.1 and AcrⅡA32 directly interact with the WED domain,where they spatially obstruct conformational changes of the WED and PI domains,thereby inhibiting Spy Cas9 from recognizing protospacer adjacent motif(PAM)and unwinding double-stranded *** addition,they may inhibit nuclease activity by blocking the dynamic conformational changes of the Spy Cas9 surveillance *** summary,our data elucidate the inhibition mechanisms of two new anti-crispr proteins,provide new strategies for the modulation of Spy Cas9 activity,and expand our understanding of the diversity of anti-crispr protein inhibition mechanisms.

关键词： anti-crispr cryo-EM Spy Cas9 AcrⅡA25.1 AcrⅡA32 inhibiton

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针对第2大类crispr-Cas系统的acr基因的发现及Acr蛋白多样化的抑制机制

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中国科学：生命科学 2024年第3期54卷 409-427页

作者：邓谢淑婷王久宇王艳丽中国科学院生物物理研究所中国科学院核酸生物学重点实验室北京100101 中国科学院大学北京100049

crispr-Cas系统是细菌和古细菌来源的RNA介导的适应性免疫系统,利用RNA介导的核酸酶活性抵抗以噬菌体为代表的外源核酸的入侵.为逃避这种来源于宿主的免疫反应,噬菌体进化出了较小的anti-crispr蛋白(Acr).Acrs采用不同的抑制策略,将Cas... 详细信息

crispr-Cas系统是细菌和古细菌来源的RNA介导的适应性免疫系统,利用RNA介导的核酸酶活性抵抗以噬菌体为代表的外源核酸的入侵.为逃避这种来源于宿主的免疫反应,噬菌体进化出了较小的anti-crispr蛋白(Acr).Acrs采用不同的抑制策略,将Cas效应蛋白限制在不同的阶段,从而使其失活.随着Cas蛋白在生物技术领域和临床上的广泛应用,Acr已被开发为有用的调控工具.对Acr的研究不仅可以加深人们对Cas蛋白别构调控的理解,而且可以为开发新型的基于Acr的调控工具打下基础.利用实验和生物信息学的手段,越来越多的Acr被发现,其中第2大类crispr-Cas系统目前有大约50种.本综述聚焦于第2大类crispr-Cas系统的Acr,从基因发现、抑制机制和技术应用三个方面对其进行总结,并对未来的研究方向做出展望.

关键词： crispr-Cas系统 Cas9 Cas12a anti-crispr

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crispr/cas系统及其在家禽上的应用研究进展

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中国畜牧杂志 2018年第3期54卷 9-14页

作者：黄玲玲黄小红陈黎卢立志福建农林大学动物科学学院福建福州350002 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310023

crispr/cas是一种获得性免疫防御系统,广泛存在于细菌和古细菌中。Strep tococcus pyogenes cas9(Spcas9)作为目前研究最多、最清楚的效应蛋白,因其酶活性高和靶点广而被应用于生命科学各个领域,但Spcas9分子量大、脱靶率高等缺点在一... 详细信息

crispr/cas是一种获得性免疫防御系统,广泛存在于细菌和古细菌中。Strep tococcus pyogenes cas9(Spcas9)作为目前研究最多、最清楚的效应蛋白,因其酶活性高和靶点广而被应用于生命科学各个领域,但Spcas9分子量大、脱靶率高等缺点在一定程度上限制了其应用。随着crispr系统技术被深入开发,一些新效应蛋白被发现,本文就crispr/cas系统分类、原理、新效应蛋白发现及cas9(***)多种变构体技术开发在及家禽上的应用进行综述,为相关领域的研究提供参考。

关键词： crispr/cas 新效应蛋白 Spcas9变构体家禽 anti-crispr

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SpyCas9抑制剂活性筛选系统的建立及低活性抑制剂的定向进化

SpyCas9抑制剂活性筛选系统的建立及低活性抑制剂的定向进化

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作者：王潘沈阳农业大学

学位级别：硕士

crispr-Cas是存在于细菌和古细菌中用来防御外源DNA入侵的获得性免疫系统。根据这一特点,科学家基于化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9(即SpyCas9)开发出了基因编辑系统。由于SpyCas9具有设计简单、操作简便、周期短、成本低等... 详细信息

crispr-Cas是存在于细菌和古细菌中用来防御外源DNA入侵的获得性免疫系统。根据这一特点,科学家基于化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9(即SpyCas9)开发出了基因编辑系统。由于SpyCas9具有设计简单、操作简便、周期短、成本低等优势,短时间内迅速风靡全球生物、医学及其它相关实验室。目前,SpyCas9作为一种强有力的基因编辑工具已应用于医疗、农业、畜牧等多个领域。但该工具存在脱靶编辑、具有一定细胞毒性、进入细胞后活性无法控制等问题。所以,亟需一个方法控制SpyCas9的活性,在基因编辑完成后能够关闭其活性,使细胞免受SpyCas9的伤害。而anti-crispr蛋白的发现无疑为这一方法提供了有效思路,anti-crispr蛋白是噬菌体为了抵抗crispr-Cas系统而进化的产物,不同anti-crispr蛋白可以不同程度的抑制对应类型的crispr-Cas系统。因此,本文选用了作用机制已被报道的AcrⅡA2、AcrⅡA4和AcrⅡA5这三个SpyCas9抑制剂,对其功能和活性进行了深入研究。第一,为了验证现有抑制剂的活性,本研究构建了基于抗生素筛选的高效双质粒功能验证系统。该系统由一个具有编辑功能的质粒和另一个含有抑制剂基因的质粒构成,通过抗生素抗性修复与否来确定SpyCas9对DNA的切割效果和抑制剂的抑制效果。结果表明,在确定SpyCas9高效切割靶点的基础上,AcrⅡA4高效地抑制了SpyCas9的编辑功能,而AcrⅡA2对SpyCas9抑制效果不明显。第二,建立起高效的基于LacZ基因的SpyCas9对大肠杆菌基因组DNA编辑和抑制剂抑制效果检验系统。由于上述双质粒功能验证系统靶点设计在质粒上,质粒在细菌内有一定的拷贝数,为了排除拷贝数可能产生的影响,更为了检验上述试验结果是否具有广谱性,将切割靶点设计到BL21(DE3)基因组的LacZ基因上,并根据靶点设计相应的同源修复模板。经修复后的LacZ基因会发生移码突变,通过转化细菌的颜色和数量就可判断编辑修复情况。再将能有效编辑LacZ基因的编辑系统转入含抑制剂的细菌中,通过菌落数量和颜色来判断抑制剂活性的强弱。试验再次表明,AcrⅡA4具有出色的抑制效果,AcrⅡA2无明显抑制效果。第三,通过定向进化策略提高了AcrⅡA2对SpyCas9的抑制效果。对抑制效果不明显的AcrⅡA2通过易错PCR的方法进行分子改造,构建AcrⅡA2突变体库,并进行高通量的功能筛选。经初筛和复筛后,从850个样本里筛选出一个活性提高的AcrⅡA2突变体。第四,探究了抑制剂AcrⅡA5与APOBEC碱基编辑酶的融合蛋白的作用效果。现有单碱基编辑器编辑效率较低,一个主要原因是脱氨酶与d Cas9(或nCas9)结合率低。为了解决这一问题,本研究设计了AcrⅡA5与APOBEC碱基编辑酶的融合蛋白。AcrⅡA5能与nCas9有效结合但不影响nCas9和DNA形成复合物,本研究期望在AcrⅡA5的帮助下,APOBEC与nCas9的结合效果有所提高,进一步提高其编辑效率。APOBEC的靶点位于BL21(DE3)基因组LacZ的高度保守区域,可通过菌落的颜色判断是否被编辑。试验结果表明,在融合抑制剂AcrⅡA5的情况下,碱基编辑器没有编辑效果,但该融合蛋白的构建为碱基编辑器的改进提出了新思路。总之,本论文构建了两种有效的SpyCas9抑制剂活性筛选系统,并对抑制效果不明显的AcrⅡA2进行了分子改造,使其活性得到提高。而且构建了抑制剂与脱氨酶的融合蛋白,对融合蛋白协同nCas9的单碱基编辑效果进行了初步探究。本论文不仅对SpyCas9抑制剂活性研究提供了重要参考价值,也为SpyCas9活性的控制提供了一种思路。

关键词： SpyCas9 anti-crispr 活性筛选基因编辑定向进化

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