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作者：郭芳芳南京农业大学

学位级别：硕士

脂肪氧合酶(lipoxygenase, LOX)催化具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的双加氧反应,如亚油酸、亚麻酸。反应过程中形成具有共轭双键的氢过氧化物,这些氢过氧化物性质活泼,是重要的化学反应中间体,在食品、医药、化工等领域... 详细信息

脂肪氧合酶(lipoxygenase, LOX)催化具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的双加氧反应,如亚油酸、亚麻酸。反应过程中形成具有共轭双键的氢过氧化物,这些氢过氧化物性质活泼,是重要的化学反应中间体,在食品、医药、化工等领域有着广泛的应用前景,尤其在食品加工中具有重要的应用价值,如面粉及其制品品质改良、制备风味化合物、茶叶加工等。然而脂肪氧合酶存在催化活性低、热稳定性差等缺点,限制了LOX酶制剂在食品加工中的应用。因此对脂肪氧合酶进行分子改造一直是国内外研究者关注的热点。本文对来源于anabaena *** 7120脂肪氧合酶分子进行定向进化和定点突变研究,筛选得到高活力和热稳定性同时提高的突变酶,并对突变酶分离纯化及酶学性质研究。同时,通过对突变酶三维结构进行模拟分析,解析突变酶酶活及热稳定性提高的分子机制。主要研究结果分述如下。1.脂肪氧合酶高通量筛选体系的建立。采用化学渗透法、冻融法和酶解法破碎重组E. coli细胞,并采用单因素试验和L25(5‘)正交试验对细胞破碎条件进行优化,确定细胞破碎最佳条件为：溶菌酶添加量为1.5 mg/mL、溶菌酶处理时间40 min、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)添加量为2.0 mmol/L、吐温-60添加量为2%、冻融温度(-70℃冷冻37℃融解)、冻融次数3次;建立了基于酶标仪、96微孔板和环境温度集成的耐温-性提高突变体筛选方法,同时对96孔板高通量筛选模型进行了评估,计算“Z值”在0.5-1.0之间,说明模型可靠,可用于脂肪氧合酶活力的高通量筛选。2.利用易错PCR技术提高脂肪氧合酶的活力及热稳定性.探索了易错PCR反应的适宜Mg2+浓度、Mn2+浓度、dNTPs浓度和Taq DNA聚合酶浓度。最终选择Mg2+浓度为2mM,Mn2+浓度为0.1 mM, dNTPs浓度0.2mM,TaqDNA聚合酶浓度0.05 U/uL的条件进行脂肪氧合酶基因的易错PCR反应。利用建立的基于96微孔板高通量筛选模型,经过两轮易错PCR,从8000个转化子中筛选到4株突变体,50℃下的半衰期分别从8 min提高到11.9 min.14.6 min、13.3 min和11 min,突变体的测序结果表明,分别发生了T94A,V328A/E330G, N305D/L358I以及E126G/T171A/N305D氨基酸置换,分析脂肪氧合酶热稳定性提高的原因是由于疏水作用力的引入显著的帮助分子折叠,提高其热稳定性,以及氢键的形成使系统获得能量来增加稳定性。3.利用DNA Shuffling技术改造脂肪氧合酶分子.以易错PCR筛选得到的突变体作为亲本进行DNA Shuffling,从6000个克隆子中筛选到一株高酶活突变体D22,经IPTG诱导后其酶活力比野生酶提高了2.17倍,50℃下的半衰期提高到15.2 min,另外两个突变体D111和D2221的半衰期分别提高到16.6 min和18 min。采用SWISS-MODEL数据库模拟生成突变酶的三维结构,根据模拟的三维结构分析其位点的突变效应。结果表明,三个突变体N305D、D66N/L160P和Y184H/N305D,分别通过组氨酸带正电的侧链影响活性中心、稳定α-螺旋：降低去折叠熵、形成水化层;改变电荷性质或者电子云密度影响着脂肪氧合酶的催化活性和稳定性。同时,对突变体酶学性质进行研究发现,当温度达到50℃时,野生酶已丧失80%相对酶活力,突变体酶D22、D111和D2221还保留50%相对活力;最适反应温度从45℃分别提高到50℃、50℃和55℃;最适反应pH分别为10.0,9.0,9.0。此外通过圆二色谱测定蛋白的二级结构,结果表明突变体D22、D111和D2221 p-转角数和折叠数的增加,这有利于维持蛋白的稳定;以及对突变酶进行热变性温度分析,发现突变体D22、D111、D2221氢键和疏水作用力的引入使得热变性温度分别提高了1℃、1.2℃、2℃。4.脂肪氧合酶分子的定点突变研究。通过饱和定点突变验证了305位对脂肪氧合酶的酶活力及热稳定性的影响,发现305位天冬氨酸的替换起着至关重要的作用,保持305位α-螺旋稳定的氨基酸排序为Asp>Gln>Phe>Tyr>Arg>Lys>Cys>Asn。以饱和定点突变筛选的突变体N305W、N305C、N305R和N305D为模板,在160位和184位引入突变,突变体L160Y/N305D,Y184L/N305D,Y184L/N305C,Y184L/N305W, L160Y/N305R的热稳定进一步提高,在50℃下的半衰期达到30 min,并对突变酶的三维结构模拟分析,引入的精氨酸(Arg)、络氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)、色氨酸(Trp)和半光氨酸(C

关键词： anabaena sp.pcc 7120 脂肪氧合酶定向进化定点突变酶学性质

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Growth and Physiological Features of Cyanobacterium anabaena sp. Strain pcc 7120 in a Glucose-Mixotrophic Culture

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Chinese Journal of Chemical Engineering 2011年第1期19卷 108-115页

作者：喻国策施定基蔡昭铃丛威欧阳藩 Institute of Nuclear and New Energy Technology Tsinghua University Beijing 100084 China State Key Laboratory of Biochemical Engineering Institute of Process Engineering Chinese Academy of Sciences Beijing 100080 China Research Center of Photosynthesis Institute of Botany Chinese Academy of Sciences Beijing 100093 China

Mixotrophic growth is one potential mode for mass culture of microalgae and cyanobacteria particularly suitable for the production of high value bioactive compounds and fine *** typical heterocystous cyanobacterium anabaena *** 7120 was grown in the presence of exogenous glucose in *** improved the cell growth evidently,the maximal specific growth rate under mixotrophic condition（0.38 d 1）being 1.6-fold of that of photoautotrophic *** caused a variation in cellular pigment composition,increasing the content of chlorophyll a and decreasing the contents of carotenoid and phycobiliprotein relative to chlorophyll *** emission from photosystem II（PSII）relative to photosystem I was enhanced in mixotrophic cells,implying an increased energy distribution in ***（EC 2.***.1.2）activity was further induced in the presence of *** mixotrophic culture was scaled up in a 15 L airlift photobioreactor equipped with an inner and an outer light source.A modified Monod model incorporating the specific growth rate and the average light intensity in the reactor was developed to describe cell growth *** understanding of mixotrophic growth and relevant physiological features of anabaena *** 7120 would be meaningful for cultivation and exploitation of this important cyanobacterial strain.

关键词： cyanobacteria anabaena sp.pcc 7120 growth features mixotrophic culture photobioreactor

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蓝细菌anabaena *** 7120 PⅡ蛋白的修饰与功能研究

蓝细菌Anabaena *** 7120 PⅡ蛋白的修饰与功能研究

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2007中国植物生理学会全国学术会议

作者：张颖赵进东北京大学生命科学学院

P是一类在生物界广泛存在的信号转导蛋白,在微生物的氮代谢调控中起重要作用。因为利用的常规依赖 SacB 的方法一直没有在丝状蓝细菌中获得 P缺失突变体,所以人们对丝状蓝细菌中 P是否参与异型胞分化调控以及其他作用了解甚少。首先采... 详细信息

P是一类在生物界广泛存在的信号转导蛋白,在微生物的氮代谢调控中起重要作用。因为利用的常规依赖 SacB 的方法一直没有在丝状蓝细菌中获得 P缺失突变体,所以人们对丝状蓝细菌中 P是否参与异型胞分化调控以及其他作用了解甚少。首先采用双向电泳结合质谱的实验方法研究了丝状蓝细菌 anabaena *** 7120中 P

关键词： anabaena sp.pcc 7120 PⅡ 质谱修饰氮代谢

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蓝细菌anabaena *** 7120藻胆体吸收光能的状态调节研究

蓝细菌Anabaena *** 7120藻胆体吸收光能的状态调节研究

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2007中国植物生理学会全国学术会议

作者：董春霞赵进东北京大学生命科学学院北京大学生命科学学院

＜正＞高等植物和蓝细菌都具有两个光系统,并可进行放氧光合作用。它们通过调节光能在光系统Ⅰ和光系统Ⅱ之间的分配,达到最大的光合作用效率。虽然高等植物和蓝细菌具有不同的天线系统,但它们都可以通过状态转变来实现光能的合理分配... 详细信息

＜正＞高等植物和蓝细菌都具有两个光系统,并可进行放氧光合作用。它们通过调节光能在光系统Ⅰ和光系统Ⅱ之间的分配,达到最大的光合作用效率。虽然高等植物和蓝细菌具有不同的天线系统,但它们都可以通过状态转变来实现光能的合理分配。藻胆体（PBS）是蓝细菌中主要的光能吸收复合体。我们通过构建 apcD 和 apcF 缺失突变体以及 apcDapcF 双缺失突

关键词： anabaena sp.pcc 7120 光能传递状态调节光系统 FRAP

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ALD和TPI基因穿梭表达载体的构建和在鱼腥藻7120中的表达

ALD和TPI基因穿梭表达载体的构建和在鱼腥藻7120中的表达

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中国植物生理学会全国学术年会暨成立40周年庆祝大会

作者：马为民施定基杨明丽王全喜陈海宝中国科学院植物研究所上海帅范大学生物系中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室

光合作用是地球上最重要的生物化学反应。200多年来,植物生理学家,植物生物化学家,物理学家,化学家,数学家,农学家,园艺学家,生物工程学家,遗传学家和分子生物学家等参与了光合作用机理和调控的研究,提高光合作用效率一直是他们努力的... 详细信息

光合作用是地球上最重要的生物化学反应。200多年来,植物生理学家,植物生物化学家,物理学家,化学家,数学家,农学家,园艺学家,生物工程学家,遗传学家和分子生物学家等参与了光合作用机理和调控的研究,提高光合作用效率一直是他们努力的方向。尽管他们已在整体、器官、组织、细胞、叶绿体和光合膜水平上取得了卓越的成果,但如何在基因水平调控上取得成效,近年来才有所突破。2001年,Miyagawa等在《Nature Biotechnology》上报道,把蓝藻细胞中的果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)基因转入烟草叶绿体中,在大气中CO浓度为360p.p.m.条件下,明显提高了转基因烟草光合固定CO的效率和糖类的累积,同时也加速了其生长。该研究是从基因水平上来调控FBPase活性。过去人们认为,要提高碳同化效率,必须调控碳同化途径中的

关键词：果糖-1 6-二磷酸醛缩酶丙糖磷酸异构酶 anabaena sp.pcc 7120 穿梭表达载体转基因蓝藻三亲接合转移蛋白表达酶活检测 CO2同化速率的检测生长曲线光合放氧曲线

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