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中国生物化学与分子生物学报 2014年第4期30卷 383-389页

作者：肖亚飞吴更微生物代谢国家重点实验室上海交通大学生命科学技术学院上海200240

amer1(APC membrane recruitment protein 1)又称为WTX(Wilms’tumor X),是首个发现位于X染色体上的抑癌基因.由于其定位的特殊性,amer1近年来成为研究的热点之一.研究表明,amer1作为骨架蛋白在细胞内与多种蛋白(APC,β-catenin,Axin等... 详细信息

amer1(APC membrane recruitment protein 1)又称为WTX(Wilms’tumor X),是首个发现位于X染色体上的抑癌基因.由于其定位的特殊性,amer1近年来成为研究的热点之一.研究表明,amer1作为骨架蛋白在细胞内与多种蛋白(APC,β-catenin,Axin等)直接结合,在Wnt信号通路中发挥着重要功能.据报道amer1/WTX含有3个肿瘤抑制蛋白质APC(adenomatous polyposis coli,APC)的结合位点,对于APC在细胞膜上的定位过程中发挥着重要的作用.但是,通过序列比对发现,amer1可能存在第4个被忽略的APC的结合位点,定位于A1和A2之间.为了验证该片段能否与APC结合,分别构建了GST-amer1(365-375)和His-APC(407-775)两种重组蛋白.通过GSTpull down,证明了这两个片段存在相互作用,并进一步通过ITC(isothermal titration calorimetry)实验测定了两者结合的亲和力.本研究结果不仅在体外证实了amer1第4个APC结合位点的存在,也为APC和amer1/WTX复合物的结构和功能的研究打下了良好的基础.

关键词： amer1 WTX APC蛋白 ARM结构域 GST-pull down ITC

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肿瘤抑制蛋白APC与amer1的结合机理研究

肿瘤抑制蛋白APC与Amer1的结合机理研究

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作者：肖亚飞上海交通大学

学位级别：硕士

APC (adenomatous polyposis coli,APC)是一个全长2843个氨基酸的多结构域蛋白，是Wnt信号通路的负调节剂，能够和很多蛋白相互结合以发挥作用。其N端含有一个最保守的ARM（Armadillo repeats）结构域。我们试验中用到的407-775片段就... 详细信息

APC (adenomatous polyposis coli,APC)是一个全长2843个氨基酸的多结构域蛋白，是Wnt信号通路的负调节剂，能够和很多蛋白相互结合以发挥作用。其N端含有一个最保守的ARM（Armadillo repeats）结构域。我们试验中用到的407-775片段就包含了此结构域，它能与许多蛋白结合并发挥功能。amer1蛋白包含1135个氨基酸，根据生物信息学分析结果显示其不含有显著的功能性结构域，据报道amer1含有三个与APC结合的位点：A1，280-368;A2，380-531;A3，716-834。本论文中，我们首先通过BLAST与Alignment的方法得到了amer1365-375这一保守片段，其中325-335是其中第一个能与APC结合的保守序列（数据待发表），由于Tanneberger, K.等人在划分amer1的区间片段时A1截止在了第368个氨基酸上，所以使得365-375这一保守序列被直接的忽略了，而我们有幸找到了这段序列，做了GST-Pulldown与ITC实验验证了他们的结合。并且拿到了APC-ARM与amer1365-375片段的晶体，解析了两者的空间结构。接下来我们试图得到APC-ARM与A3复合物的晶体时，对A3的片段不能准确的定位，于是再次通过BLAST与Alignment找出amer1中此片段的保守区域。根据结果我们构建、表达纯化了带GST标签的amer1片段716-834、766-823、766-777、786-823、766-823△778-794。通过GST-Pulldown与ITC实验证实了以上最短的片段amer1766-823△778-794能够与APC-ARM结构域结合，而且片段766-777与786-823均不能与此结合。由此可知，amer1与APC-ARM相结合的四个位点中A3片段的结合方式是独特的，它不仅仅是依靠像A1、A2、A4那样的几个关键氨基酸与APC-ARM相结合，而是采用两端的氨基酸形成一定的高级结构，再通过此结构与APC-ARM结合，缺失的序列778-794在A3与APC-ARM的结合中不起作用。然后通过各种蛋白纯化的方法得到了APC-ARM/amer1766-823△778-794的复合物，其中包括酶切GST标签后再纯化，TEV及Trypsin依次酶切之后再纯化。但当我们得到蛋白复合物之后筛选晶体时总是拿不到晶体，看来A3片段amer1766-823△778-794还是不利于晶体的生长，需要我们进一步的准确定位A3。

关键词： APC-ARM amer1 GST-Pulldown ITC 晶体筛选

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结直肠癌关键基因突变对肿瘤进展的影响

结直肠癌关键基因突变对肿瘤进展的影响

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作者：黄东东浙江大学

学位级别：硕士

结直肠癌仍然是世界范围内高发的恶性肿瘤之一。尽管结直肠癌的早期筛查和治疗技术不断发展进步,但晚期结直肠癌的总体生存率仍不尽如人意。而肿瘤转移(包括淋巴转移和远处转移)仍旧是绝大多数结直肠癌患者死亡的主要原因。目前已发现... 详细信息

结直肠癌仍然是世界范围内高发的恶性肿瘤之一。尽管结直肠癌的早期筛查和治疗技术不断发展进步,但晚期结直肠癌的总体生存率仍不尽如人意。而肿瘤转移(包括淋巴转移和远处转移)仍旧是绝大多数结直肠癌患者死亡的主要原因。目前已发现结直肠癌的发生发展过程中存在许多关键基因突变,然而仍未鉴定出结直肠癌进展尤其是转移的驱动突变。因此,本研究以此为切入点研究结直肠癌相关基因突变与其发生发展过程中的关系。1、结直肠癌关键基因变对肿瘤进展的影响从结直肠正常结肠上皮,腺瘤,恶性转化为癌,最后发展为肿瘤转移是结直肠癌发生发展的经典线性模型。在这个过程中一些关键基因会发生一系列突变。到目前为止,许多研究已经报道这些关键基因突变与结直肠癌转移的关系。但是由于单个研究的样本量小、人群差异等因素,不同研究得出的结论存在矛盾。我们通过生物信息学分析确定了 APC、KRAS、BRAF、PIK3CA、SAMD4、p53等6个关键基因。然后在PubMed、Embase、Cochrane Library和TCGA数据库中进行系统检索后(截至2017年11月30日),纳入发表的120篇文章,利用Meta分析的方法明确了这些关键基因突变在结直肠癌转移中的作用。结果显示,KRAS突变(OR:1.18,95%CI:1.05-1.33)和 p53 突变(OR:1.49,95%CI:1.23-1.80)与结直肠癌总转移(包括淋巴和远处转移)相关。此外,伴有KRAS突变(OR:1.29,95%CI:1.13-1.47)、p53 突变(OR:1.35,95%CI:1.06-1.72)和 SMAD4 突变(OR:2.04,95%CI:1.41-2.95)的结直肠癌患者存有更高的远端转移的风险。分层分析表明BRAF突变与亚洲人群的结直肠癌总转移(OR:1.42,95%CI:1.18-1.71)和远端转移(OR:1.51,95%CI:1.20-1.91)有关。APC或PIK3CA突变与结直肠癌转移均无明显相关性。2、amer1突变对结直肠癌进展的影响通过对MSKCC数据集、实验室中的87例结直肠癌患者的测序样本进行分析(参见2019届浙江大学病理学与病理生理学系孙文杰博士论文),我们发现amer1基因在结直肠癌中存在高频突变,而这些突变均为截断突变。同时,我们发现amer1的突变与结直肠癌的同期肝转移密切相关。为了确定amer1突变在结直肠癌转移中的作用,我们采用siRNA和Crispr/cas9技术确定了 amer1的生物学功能,结果显示在SW480和RKO两种结直肠癌细胞株中对amer1的基因敲降和敲除后,肿瘤细胞的迁移、侵袭能力明显较对照组增强。另外,我们发现amer1敲除的稳定细胞株中E-cadherin、Zo-1表达增加,Vimentin、MMP9表达减少,说明amer1具有抑制结直肠癌细胞EMT的功能。同时我们发现amer1敲除导致p-catenin细胞核定位增加。通过过表达1-358、1-565、1-830、566-1135、831-1135以及全长的amer1载体,细胞迁移和侵袭功能分析表明amer1第831至1135位氨基酸片段是发挥抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭的关键结构域。综上所述:①KRAS、p53、SMAD4和BRAF基因突变在结直肠癌转移中发挥重要作用;②amer1作为抑癌基因在结直肠癌中存在高频突变,且其突变与结直肠癌的同期肝转移密切相关;③amer1通过调控上皮-间质转化(EMT)抑制结直肠癌转移,其831至1135位氨基酸序列是发挥抑制结直肠癌细胞迁移侵袭的作用的关键结构域。

关键词：结直肠癌关键驱动基因 amer1 突变 EMT 转移 meta-分析

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