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alphalisa法同时测定动物组织中克伦特罗和莱克多巴胺

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重庆医科大学学报 2018年第11期43卷 1469-1474页

作者：向露龚倩王智郗存显聂福平曹淑瑞王国民唐柏彬母昭德重庆大学附属肿瘤医院药学部重庆400030 重庆医科大学药学院药物分析教研室重庆400016 重庆出入境检验检疫局重庆市进出口食品安全工程技术研究中心重庆400020

目的:建立同时测定动物组织中克伦特罗(clenbuterol,CLB)和莱克多巴胺(ractopamine,RAC)的纳米均相时间分辨荧光免疫(amplified luminescent proximity homogeneous assay linked immunosorbent assay,alphalisa)分析方法。方法:样品经β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酯酶和乙酸铵酶解提取,正己烷脱脂,滤膜过滤,滤液与生物素化抗原、抗体、供体微珠和受体微珠进行酶联免疫,alphalisa进行检测。结果:CLB和RAC在0.1~50 ng/mL范围内呈良好的线性关系(R2>0.98),检测限为0.02 ng/mL;在5、10、20μg/kg 3个添加水平下CLB+RAC(1∶1)、CLB和RAC的回收率分别为88.8%~102.8%、86.6%~98.3%和84.2%~103.2%;相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于12%。结论:该方法快速简单、结果准确可靠,适用于检测和筛选动物组织中的RAC和CLB。

关键词： alphalisa 克伦特罗莱克多巴胺动物组织

alphalisa检测金黄色葡萄球菌肠毒素D

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军事医学 2020年第2期44卷 142-146页

作者：曹鹤译郑玉玲刘鹏江华孔德聪姜永强律清宇军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的利用新型均相化学发光免疫分析技术(alphalisa)检测金黄色葡萄球菌肠毒素D(SED),并与传统酶联免疫吸附测定(ELISA)进行比较。方法采用SED单抗偶联发光微球,生物素标记另一SED单抗,以及链霉亲和素偶联感光微球构建SED alphalisa检测... 详细信息

目的利用新型均相化学发光免疫分析技术(alphalisa)检测金黄色葡萄球菌肠毒素D(SED),并与传统酶联免疫吸附测定(ELISA)进行比较。方法采用SED单抗偶联发光微球,生物素标记另一SED单抗,以及链霉亲和素偶联感光微球构建SED alphalisa检测体系;SED单抗包被,另一生物素标记SED单抗检测,链霉亲和素偶联辣根过氧化物酶(HRP)放大,构建SED ELISA检测体系。结果与结论确定alphalisa发光微球和生物素标记抗体的最适稀释比例为1∶50和1∶1000;确定ELISA包被抗体的最适浓度为3μg/ml,生物素标记抗体和链霉亲和素偶联HRP的最适比例分别为1∶1000和1∶2000;alphalisa对缓冲液和牛奶模拟样本SED的检出限为100 pg/ml,变异系数(CV)为0.3%~8.9%;ELISA对缓冲液和牛奶模拟样本SED的检出限为781.29 pg/ml,CV为1.0%~19.8%;两种方法均不与其他型肠毒素抗原产生交叉反应。与ELISA相比,alphalisa检测SED灵敏度、精确性更高。

关键词： alphalisa 金黄色葡萄球菌肠毒素D ELISA

alphalisa检测金黄色葡萄球菌肠毒素A方法的建立

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军事医学 2020年第11期44卷 815-820页

作者：张力文陈萱郑玉玲江华刘鹏孔德聪律清宇姜永强安徽医科大学合肥230032 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的建立一种快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的均相光激化学发光免疫分析法(alphalisa)。方法待测样本中的SEA与偶联有羊抗SEA多克隆抗体的受体微球、生物素化的小鼠抗SEA单克隆抗体发生反应,形成双抗体夹心结构,再与包被链霉亲和... 详细信息

目的建立一种快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的均相光激化学发光免疫分析法(alphalisa)。方法待测样本中的SEA与偶联有羊抗SEA多克隆抗体的受体微球、生物素化的小鼠抗SEA单克隆抗体发生反应,形成双抗体夹心结构,再与包被链霉亲和素的供体微球形成复合体。680 nm波长荧光激发供体微球上的光敏剂产生单线态氧,触发受体微球发出615 nm波长荧光,多功能酶标仪检测信号值,信号值高低与待测样本中SEA的浓度呈正比。结果缓冲液中SEA的最低检出限(LOD)为0.1 ng/ml,线性范围0.2~50 ng/ml,相关系数R2为0.9941。检测体系不易受高糖、高盐和高蛋白等样本基质的影响,牛乳等液态模拟样本和10%(w/v)稀释的奶粉、豆干、火腿肠等固态食品模拟样本的LOD均为0.1 ng/ml。检测体系与其他4种肠毒素(SEB、SEC、SED、SEE)、A型肉毒毒素、蓖麻毒素、相思子毒素均无交叉反应,特异性较好。无论是缓冲液还是模拟样本检测,变异系数均小于10%,具有较好的重复性。结论该法操作流程简便,检测灵敏度高、特异性强,检测时间为25 min,在金黄色葡萄球菌性食物中毒的鉴别诊断中具有较好的应用前景。

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素A alphalisa 金黄色葡萄球菌性食物中毒

Determination of Interaction between NFκB p50 and <i>β</i>-IFN-<i>κ</i>B Binding Oligo Using alphalisa in HTP Fashion

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Journal of Analytical Sciences, Methods and Instrumentation 2013年第3期3卷 173-178页

作者： Muniasamy Neerathilingam Sai Gandham Falguni Patel Mohammad Nasiruddin Centre for Cellular Molecular Platforms (C-CAMP) NCBS-TIFR GKVK Campus Bangalore India Centre for Cellular Molecular Platforms (C-CAMP) NCBS-TIFR GKVK Campus Bangalore India&Institute of Molecular Medicine (IMM) University of Texas Health Science Center Houston USA. Institute of Molecular Medicine (IMM) University of Texas Health Science Center Houston USA.

NF-κB plays a crucial role in regulating various biological processes including innate and adaptive immunity, inflammation, stress responses, B-cell development, and lymphoid organogenesis. Currently, several assays like electrophoretic mobility shift assay (EMSA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence resonance energy transfer (FRET) and time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET) are widely used for studying the NFκB intraction with β-IFN-κB binding oligo. Each of these techniques has varying utility with distinct strengths and weaknesses. We describe a method alphalisa to identify NFκB p50 protein and β-IFN-κB binding oligo sequence and interaction is efficient at a given concentration (10 nM) in the EMSA and Biacore’s SPR assays. The method has many advantages such as use of small volume, high throughput (HTP), convenience of sample preparation and data analysis.

关键词： DNA-Protein Interaction Binding Constant Equilibrium Constant alphalisa High Throughput (HTP)

alphalisa检测葡萄球菌肠毒素B方法的建立及荧光功能化微球的制备

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AlphaLISA检测葡萄球菌肠毒素B方法的建立及荧光功能化微球的制备

作者：赵俊清军事科学院

学位级别：硕士

葡萄球菌肠毒素B(SEB)是金黄色葡萄球菌(金葡菌)产生的一种超抗原,具有极大的毒性,可以在很低的浓度下激活大量的CD4T细胞。而细胞因子的大量产生会引发“细胞因子风暴”,进而导致急性毒性效应。作为一种重要的肠毒素,SEB不仅是食物中... 详细信息

葡萄球菌肠毒素B(SEB)是金黄色葡萄球菌(金葡菌)产生的一种超抗原,具有极大的毒性,可以在很低的浓度下激活大量的CD4T细胞。而细胞因子的大量产生会引发“细胞因子风暴”,进而导致急性毒性效应。作为一种重要的肠毒素,SEB不仅是食物中毒的主要原因,也是潜在的生物威胁,可以被发展成一种气溶胶化的生物武器。同时,因为SEB具有较大的毒性、稳定性和易获得性,美国国家疾病控制中心将其列为生化武器清单上的重要致病毒素。因此,对SEB进行快速准确的检测是非常重要和迫切的。alphalisa是一种基于两个微球的技术。当这两种微球彼此接近时,用波长为680 nm的光激发供体微球产生能量,将周围反应体系中的氧分子转变为激发态,并将能量传递给受体微球,最终产生52020 nm的荧光。该技术操作便捷,反应用时少,均相免洗,并具有较高的灵敏度。本实验建立了alphalisa检测SEB的方法。对结果进行分析,采用非线性回归法进行alphalisa标准曲线的建立,缓冲液中SEB检测的线性范围为25 pg/mL至25 ng/mL,LOD为25 pg/mL,具有较高的灵敏度。在模拟样品中,LOD可达50pg/mL,同时具有较好的耐受性,受到样品基质影响较小,稳定性高。在缓冲液和模拟样品中的批间CV和批内CV均小于10%,具有较好的重复性。该方法检测特异性高,不与其他经典的肠毒素、肉毒毒素、蓖麻毒素、相思子毒素等发生交叉反应。这对于确认SEB污染引起的食物中毒是非常重要的。在将alphalisa用于菌液上清中SEB的检测时,发现该方法几乎不受葡萄球菌蛋白A(SPA)的干扰。SPA是金葡菌免疫检测的主要干扰因素,能够与鼠,兔等哺乳动物抗体FC段产生高亲和力结合。而在本实验中,使用100μg/mL的SPA对SEB进行稀释并检测后发现,SPA对alphalisa的信号值几乎没有影响。因此alphalisa检测方法的建立不仅适用于食品样品中SEB的检测,同时,在金葡菌污染的食物样品中SEB含量较低时,也可以通过分离培养金葡菌,对菌液上清中的SEB进行检测。在alphalisa技术中,功能化的聚合物微球是其重要的材料。聚合物微球是指具有圆球形状,且粒径在数十纳米至数百微米尺度范围内的聚合物粒子。制备材料主要分为天然高分子和合成聚合物,如聚苯乙烯(PS)。而对微球的功能化的研究,一直是相关领域的重点。微球的功能化,现在已经有包括量子点化,荧光化,中空化,磁化等多种方法。商业化的alphalisa技术微球为国外公司制备,无法获得具体的合成方法和所含材料。但是随着荧光材料的发展和新型光敏剂的出现,该微球也出现了越来越多的改进空间。为了对微球性能的提升做准备,如何稳定的负载功能化材料就显着的尤为重要。本实验初步构建了通过溶胀法使PS微球负载荧光染料组合物的方法,并对合成的整体步骤进行了优化,在优化后的步骤下合成的微球,具有良好的重复性,CV值均小于10%。同时对溶胀的温度和时间进行了摸索,发现在80°C下溶胀15 min的微球信号值强度最佳。通过透射电镜观察了溶胀前的微球和不同温度下溶胀的微球的外部形貌,发现了80°C下溶胀的微球同溶胀前相比,分散性几乎没有变化。而90°C下的微球,发生了一定的程度的聚集重叠。透射电镜的结果,也揭示了80°C下溶胀效果更佳的一种可能原因。在对微球偶联抗体的步骤进行优化的过程中,探索了EDC的用量和偶联抗体的时间。根据结果显示,为了得到最优的活化效果和偶联效率,每5 mg微球需使用0.1 mg的EDC对其表面的羧基官能团进行活化,并且最佳的抗体偶联时间为2 h。通过溶胀法构建微球负载荧光染料的方法,已有了初步结果,能够较为稳定的实现微球的荧光化。为下一步对荧光染料的改进和应用,打下了良好的基础。

关键词：葡萄球菌肠毒素B alphalisa 聚合物微球荧光化

副流感病毒IgM抗体alphalisa快速检测方法建立

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病毒学报 2021年第3期37卷 548-553页

作者：陈萱荆红波郑玉玲张力文律清宇姜永强军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 北京市顺义区疾病预防控制中心北京101300 安徽医科大学合肥230032

副流感病毒(Parainfluenza virus,PIV)是较为常见且广泛的社区性获得性抗原,其感染率仅次于呼吸道合胞病毒。由于PIV感染的临床表现与其他呼吸道病毒感染无特异性差别,所以早期、快速、准确诊断尤为重要。本文建立PIV IgM抗体的AlphaLIS... 详细信息

副流感病毒(Parainfluenza virus,PIV)是较为常见且广泛的社区性获得性抗原,其感染率仅次于呼吸道合胞病毒。由于PIV感染的临床表现与其他呼吸道病毒感染无特异性差别,所以早期、快速、准确诊断尤为重要。本文建立PIV IgM抗体的alphalisa快速检测方法,PIV特异性抗原与待测样品中PIV IgM抗体结合使供体微珠和受体微珠相互接近时,激光激发级联反应,从而产生放大的信号。通过对PIV特异性抗原生物素标记量和稀释比例的摸索,确定最佳反应体系。该方法批内和批间变异系数均小于10%,与间接免疫荧光方法比对,总符合率高于95%,且不与其他7种常见呼吸道病原体的IgM抗体发生交叉反应。alphalisa方法操作简便,整个反应过程只需要25 min,可快速检测PIV的IgM抗体,为早期确诊PIV感染提供有效办法。

关键词： alphalisa 副流感病毒(PIV) IgM抗体

猪肉中β-受体激动剂alphalisa检测方法的建立

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分析测试学报 2017年第1期36卷 117-121页

作者：龚倩郗存显聂福平曹淑瑞唐柏彬王国民陈冬东母昭德重庆医科大学药学院重庆400016 重庆市生物化学与分子药理学重点实验室重庆400016 重庆出入境检验检疫局重庆市进出口食品安全工程技术研究中心重庆400020 中国检验检疫科学研究院北京100123

建立了快速检测猪肉中克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗和特布他林4种β-受体激动剂的光激化学发光纳米均相时间分辨荧光免疫(Alpha LISA)分析方法。样品经乙酸铵和β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶酶解提取过柱,浓缩至干后,用缓冲溶液定容。样品... 详细信息

建立了快速检测猪肉中克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗和特布他林4种β-受体激动剂的光激化学发光纳米均相时间分辨荧光免疫(Alpha LISA)分析方法。样品经乙酸铵和β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶酶解提取过柱,浓缩至干后,用缓冲溶液定容。样品与生物素化抗原、抗体、供体微珠和受体微珠进行酶联免疫,Alpha LISA进行检测,基质标准曲线定量。结果表明:沙丁胺醇、克伦特罗、溴布特罗和特布他林在0.1~500ng/m L范围内呈良好线性,相关系数均大于0.98,沙丁胺醇与克伦特罗、溴布特罗和特布他林的交叉反应率分别为143.3%,179.2%和95.6%,检出限为0.03~0.08 ng/m L。在0.5,10,20μg/kg 3个添加水平下,4种化合物的平均回收率为82.5%~115.9%,相对标准偏差(RSD)均小于12.0%。该方法操作简单,快速准确,适用于猪肉中β-受体激动剂的筛选与检测。

关键词： alphalisa β-受体激动剂猪肉

水产品中孔雀石绿alphalisa检测方法的建立

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食品与发酵工业 2017年第2期43卷 206-210页

作者：龚倩郗存显聂福平曹淑瑞王国民陈冬东母昭德重庆医科大学药学院重庆400016 重庆市生物化学与分子药理学重点实验室重庆400016 重庆出入境检验检疫局重庆市进出口食品安全工程技术研究中心重庆400020 中国检验检疫科学研究院北京100123

建立孔雀石绿(malachite green,MG)的光激化学发光纳米均相时间分辨荧光免疫法(alphalisa)分析方法。将待测物,生物素化-MG-BSA,抗体加入到孔板中,再加入供体微珠和受体微珠。生物素化-MG-BSA和游离的待测物对抗体的竞争使得信号值减小... 详细信息

建立孔雀石绿(malachite green,MG)的光激化学发光纳米均相时间分辨荧光免疫法(alphalisa)分析方法。将待测物,生物素化-MG-BSA,抗体加入到孔板中,再加入供体微珠和受体微珠。生物素化-MG-BSA和游离的待测物对抗体的竞争使得信号值减小,从而优化检测条件并进行方法学验证。结果表明:该方法特异性良好,与无色孔雀石绿,无色结晶紫无交叉反应,灵敏度为0.42 ng/m L,MG在2种鱼样品中的回收率在81.0%~105.0%和84.0%~90.8%之间,批内精密度RSDalphalisa方法可以简单、快速的对鱼类进行MG测定,具有特异性强、灵敏性高、稳定等特点。

关键词： alphalisa 孔雀石绿水产品检测方法

11种毒素alphalisa检测体系的建立

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11种毒素AlphaLISA检测体系的建立

作者：张力文安徽医科大学

学位级别：硕士

生物毒素由其来源大致可分为真菌毒素、细菌毒素、植物毒素、动物毒素及海洋生物毒素等。本研究选取11种生物毒素进行研究,其中包括细菌毒素金黄色葡萄球菌5种主要肠毒素(SEA、SEB、SEC、SED、SEE),A型肉毒毒素(Bo NT-A),产气荚膜梭菌... 详细信息

生物毒素由其来源大致可分为真菌毒素、细菌毒素、植物毒素、动物毒素及海洋生物毒素等。本研究选取11种生物毒素进行研究,其中包括细菌毒素金黄色葡萄球菌5种主要肠毒素(SEA、SEB、SEC、SED、SEE),A型肉毒毒素(Bo NT-A),产气荚膜梭菌α毒素(CPA)和产气荚膜梭菌ε毒素(ETX);两种植物毒素相思子毒素(AT)和蓖麻毒素(RT),一种小分子真菌毒素T-2毒素。这11种毒素均可以引起人类中毒事件的发生。中毒事件一旦发生,最重要的就是快速检测出中毒毒素的种类和大致剂量。为提高这11种毒素的检测效率,本研究建立了这11种毒素的Alpha LISA检测体系。研究分为两个部分,第一部分建立了针对10种毒素(SEA、SEB、SEC、SED、SEE、Bo NT-A、CPA、ETX、AT、RT)的双抗体夹心Alpha LISA检测体系。研究的第二部分针对小分子T-2毒素建立了竞争法Alpha LISA检测体系。Alpha LISA技术是一种快速检测方法,这种方法所需样本量小,操作简便,用时较少,准确度高。在建立这11种毒素的Alpha LISA检测体系中,我们首先利用ELISA技术筛选出每种毒素的最适配对抗体,用筛选出的最适抗体进行Alpha LISA预实验,优化反应条件,确定每种毒素的最适检测方案。然后,使用11种纯化毒素进行Alpha LISA检测,绘制毒素的标准曲线,评价每种毒素的检出限、特异性、重复性等指标。随后,设计制备SEA模拟样本,Bo NT-A模拟样本,T-2毒素模拟样本评价Alpha LISA检测体系的灵敏度。我们还搜集了肉毒毒素临床样本对肉毒毒素Alpha LISA检测体系进行评价,比较试验结果与临床症状的相关性。研究结果显示,在我们所建立的11种毒素Alpha LISA检测体系的灵敏度均在1ng/m L以下,其中SEB的灵敏度达到25pg/m L。特异性良好,建立完成的11种毒素Alpha LISA检测体系均未与其它毒素发生交叉反应。重复性较好,批间和批内变异系数均在10%以下。本研究第一部分中在以SEA模拟样本评价Alpha LISA检测体系时,该方法表现出对食品基质的良好的抗干扰能力:在SEA全脂牛乳模拟样本中,Alpha LISA检测方法的最低检出限(LOD)为0.1ng/m L。在10%(w/v)浓度的SEA乳制品模拟样本中,Alpha LISA检测方法的LOD为0.1ng/m L;在20%(w/v)浓度的SEA乳制品模拟样本中,LOD只能达到1ng/m L。在10%(w/v)和20%(w/v)两种浓度的SEA豆制品和腌制肉类模拟样本中,Alpha LISA检测方法的LOD均可以达到0.1ng/m L。除20%(w/v)浓度的SEA花生酱模拟样本的LOD为0.2ng/m L以外,花生酱、豆瓣酱和火腿肠这三种食品模拟样本在不同稀释质量分数下的LOD均为0.1ng/m L。采用A型肉毒毒素血浆模拟样本评价Alpha LISA检测体系时,由于血浆中部分成份的影响,血浆原液中Bo NT-A的LOD只能到0.4ng/m L,但缓冲液等比稀释的血浆中,Alpha LISA检测Bo NT-A的LOD为0.1ng/m L。A型肉毒毒素蒸馏水模拟样本中,Alpha LISA检测Bo NT-A的LOD可以达到0.1ng/m L。本研究第二部分中以T-2毒素模拟样本评价Alpha LISA检测体系时,在2%(w/v)、5%(w/v)和10%(w/v)浓度的T-2毒素玉米粉模拟样本中,Alpha LISA检测方法的LOD均可以达到0.05ng/m L,与缓冲液中LOD一致。以T-2毒素商业化模拟样本评价Alpha LISA检测体系时,2%(w/v)浓度T-2毒素模拟样本的回收率为89.49%～96.29%,商业化ELISA试剂盒的回收率为80.25%～121.29%,Alpha LISA检测方法的回收率明显优于ELISA。当T-2毒素模拟样本的浓度稀释至1%(w/v)时,Alpha LISA检测方法的回收率为87.16%～92.50%,商业化ELISA试剂盒的回收率为37.52%～95.16%,可见在低浓度的模拟样本中,Alpha LISA方法依然可以获得较好的回收率。本研究建立了可以引起人类中毒的11种毒素的Alpha LISA检测体系,与常用的ELISA方法相比,该方法可以提供快速、高特异性和高灵敏度的检测,可为此11种毒素中毒的检测提供参考。

关键词： alphalisa 中毒金黄色葡萄球菌A～E型肠毒素相思子毒素蓖麻毒素产气荚膜梭菌α毒素产气荚膜梭菌ε毒素肉毒毒素 T-2毒素