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华北农学报 2022年第4期37卷 62-70页

作者：王亚男梁岩岩严文培张银萍李强吴秀菊东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030

为进一步挖掘甲基丁香酚合成相关酶基因,解析北细辛次生代谢途径,根据北细辛转录组数据库信息,筛选和克隆了ahomt1基因,并进行了相应的生物信息学分析及原核表达分析。结果表明,ahomt1基因包含的开放阅读框为1089 bp,编码362个氨基酸,... 详细信息

为进一步挖掘甲基丁香酚合成相关酶基因,解析北细辛次生代谢途径,根据北细辛转录组数据库信息,筛选和克隆了ahomt1基因,并进行了相应的生物信息学分析及原核表达分析。结果表明,ahomt1基因包含的开放阅读框为1089 bp,编码362个氨基酸,理论分子质量为40.23 ku,等电点为5.34,ahomt1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽序列;ahomt1基因具有二聚化结构域与甲基转移酶结构域,ahomt1与催化类黄酮、丁香酚类化合物的O-甲基转移酶的同源性较高;构建pET-32b-ahomt1原核表达载体,成功诱导表达约60 ku的重组蛋白;确定了最佳诱导条件是0.2 mmol/L IPTG,16℃诱导16 h,该诱导条件下的重组蛋白多以可溶性蛋白形式存在;使用Ni^(2+)树脂分离纯化ahomt1蛋白,以200 mmol/L咪唑洗脱可得到最大量的蛋白。该研究首次克隆了北细辛ahomt1基因,构建原核表达载体,筛选出ahomt1蛋白最佳诱导条件。

关键词：北细辛 ahomt1 基因克隆生物信息学分析原核表达

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花生果皮丰富表达基因及其启动子的克隆与分析

花生果皮丰富表达基因及其启动子的克隆与分析

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作者：曾小红福建农林大学

学位级别：硕士

黄曲霉毒素污染严重危害人畜健康,影响着花生产业的发展,培育抗黄曲霉花生品种,是解决黄曲霉毒素污染最有效的途径。通过基因工程手段培育抗黄曲霉花生品种具有广阔的前景,但目前转基因安全性担忧一直影响着转基因育种的发展。为此,我... 详细信息

黄曲霉毒素污染严重危害人畜健康,影响着花生产业的发展,培育抗黄曲霉花生品种,是解决黄曲霉毒素污染最有效的途径。通过基因工程手段培育抗黄曲霉花生品种具有广阔的前景,但目前转基因安全性担忧一直影响着转基因育种的发展。为此,我们实验室提出了克隆花生果皮特异启动子和诱异启动子,使转入花生的抗病基因只在其果皮表达或诱导表达,以安全解决花生黄曲霉污染问题。鉴此,我们建立了大规模的花生基因芯片,用芯片筛选了花生果皮特异表达和受黄曲霉侵染诱导的花生特异基因。本文从获得的组织特异型、诱导型基因片段出发,通过RACE和文库筛选技术克隆特异基因全长,通过Flanking-PCR克隆特异基因上游的启动子,通过生物信学预测和分析了特异基因和上游启动子的构结和功能,利用RT-PCR研究基因的表达特征,得到了花生果皮特异表达的新基因及其启动子。主要结果如下：1、筛选了一系列花生果皮丰富表达基因,并进一步通过半定量RT-PCR分析这些基因的组织表达模式,获得7个果皮丰富表达基因和1个黄曲霉诱导大量表达基因。2、以花生果皮cDNA文库为模板,克隆了7个果皮丰富表达基因的cDNA全长序列。其中,基因AhLACl在果皮中特异表达,且不受各种激素诱导表达,经生物信息学分析,该基因编码一个漆酶蛋白。从花生基因组DNA中分离获得该基因的上游调控序列2,,231bp,经数据库分析,该启动子序列存在着典型的TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件,同时发现了与种子特异性基因表达关系密切的启动子上游调控元件：RY基序、GCN4基序、Skn1基序等,以及三个厌氧特异反应元件：ARE元件、GC-基序,预测该启动子为果皮/种子-特异启动子,与果皮发育有关。3、基因AhPLECl在果皮中丰富表达,在花生种仁中不表达,经生物信息学分析,该基因编码的蛋白为豆科凝集素家族中的一员。分离获得该基因的上游调控序列1,674bp,分析发现该启动子序列除了具有启动子基本元件外,还存在着多个与防御和应激反应有关的元件：GTI-基序、ARE1-基序、P1BS元件等,预测该启动子调控的基因表达可能与花生果皮的防御功能有关。4、以花生果皮受黄曲霉诱导表达cDNA为模板,克隆获得黄曲霉诱导大量表达基因ahomt1的cDNA全长序列。该基因受黄曲霉诱导后大量表达,而且在花生各器官中几乎不表达。对其编码氨基酸进行功能结构域分析,显示该基因属于甲基转移酶。从花生基因组DNA中分离获得该基因的上游调控序列849bp,结合数据库进行分析,发现该启动子含有一个病原反应、茉莉酸反应元件GCC-box,一个防御反应元件TC-基序等,预测该启动子为黄曲霉诱导/真菌诱导-特异启动子。上述结果为进一步研究花生果皮特异基因与果皮发育的关系、黄曲霉诱导表达基因与黄曲霉侵染的关系以及果皮特异启动子、黄曲霉诱导启动子在花生抗黄曲霉育种上的应用奠定了基础。

关键词：花生果皮特异黄曲霉诱导启动子 AhLAC1 AhPLEC1 ahomt1

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