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Phosphorylation of ago2 is required for its role in DNA double-strand break repair

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Journal of Genetics and Genomics 2021年第4期48卷 333-340页

作者： Xiaolu Hu Yan Li Tianfang Zhang Lin Li She Chen Xiaohong Wu Haijun Li Binjie Qi Zuobing Chen Department of Rehabilitation Medicine The First Affiliated HospitalCollege of MedicineZhejiang UniversityHangzhou 310000China Center for Plant Biology School of Life SciencesTsinghua UniversityBeijing 100084China Tsinghua-Peking Center for Life Sciences Beijing 100084China National Institute of Biological Sciences Zhongguancun Life Science ParkBeijing 102206China

Repair of DNA double-strand break(DSB)is critical for the maintenance of genome integrity.A class of DSB-induced small RNAs(di RNAs)has been shown to play an important role in DSB repair.In humans,di RNAs are associated with ago2 and guide the recruitment of Rad51 to DSB sites to facilitate repair by homologous recombination(HR).ago2 activity has been reported to be regulated by phosphorylation under normal and hypoxic conditions.However,the role of ago2 phosphorylation in DNA damage repair is unexplored.Here,we show that S672,S828,T830,and S831 of human ago2 are phosphorylated in response to ionizing radiation(IR).S672 A mutation of ago2 leads to significant reduction in Rad51 foci formation and HR efficiency.We further show that defective association of ago2 S672 A variant with DSB sites,instead of defects in di RNA and Rad51 binding,may account for decreased Rad51 foci formation and HR efficiency.Our study reveals a novel regulatory mechanism for the function of ago2 in DNA repair.

关键词： ago2 diRNA DNA repair Phosphorylation Small RNA

全2?-F/OMe-siRNA的设计合成及其新型混合脂材纳米制剂抗肝癌活性评价

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药学学报 2023年第6期58卷 1634-1640页

作者：高宇睛王玺贤潘宇飞汪全鑫朱月洁潘德林关注杨振军成都中医药大学药学院四川成都611137 北京大学药学院/天然药物及仿生药物国家重点实验室北京100191

本文设计合成了多条全2?-F/OMe修饰的抗肝癌siRNA,并在细胞水平进行活性评价,探究2?-F/OMe修饰的位置差异对siRNA活性的影响。使用K&A DNA/RNA H-8合成仪合成全2?-F/OMe修饰siRNA,利用中性胞苷脂材DNCA混合阳离子脂材CLD包载递送siRNA... 详细信息

本文设计合成了多条全2?-F/OMe修饰的抗肝癌siRNA,并在细胞水平进行活性评价,探究2?-F/OMe修饰的位置差异对siRNA活性的影响。使用K&A DNA/RNA H-8合成仪合成全2?-F/OMe修饰siRNA,利用中性胞苷脂材DNCA混合阳离子脂材CLD包载递送siRNA入胞。通过RT-qPCR实验检测Huh-7和HepG2细胞的靶基因沉默活性, CCK-8实验检测Huh-7和HepG2细胞增殖活力, RNA结合蛋白免疫沉淀及RT-qPCR实验检测siRNA载入ago2蛋白的情况,流式细胞术检测药物摄取和细胞凋亡, Western blot实验检测PLK1蛋白的表达。部分全2?-F/OMe修饰siRNA增强了与ago2蛋白的结合,进而增强了基因沉默活性及肝癌细胞增殖抑制活性。此外,多数siRNA修饰物制剂的Huh-7细胞摄取率提高,更大幅度下调PLK1蛋白,诱导更多Huh-7细胞凋亡,其中siPLK1A3最优。以上结果为进一步研究siRNA修饰模式及研发抗肝癌新型制剂提供了工作基础。

关键词：小干扰RNA 全2?-修饰抗肝癌 ago2 DNCA/CLD

ago2 387丝氨酸位点磷酸化对miRNA静默效应的影响

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Ago2 387丝氨酸位点磷酸化对miRNA静默效应的影响

作者：姚春芳江苏大学

学位级别：硕士

背景及目的:机制性的雷帕霉素靶分子(the mechanistic target of rapamycin,m TOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在生物体内以m TORC1与m TORC2复合体形式存在。m TORC1通过整合生长因子、能量、营养、应激等信号,调控细胞内脂质、蛋白... 详细信息

背景及目的:机制性的雷帕霉素靶分子(the mechanistic target of rapamycin,m TOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在生物体内以m TORC1与m TORC2复合体形式存在。m TORC1通过整合生长因子、能量、营养、应激等信号,调控细胞内脂质、蛋白质、核酸等生物大分子的合成代谢。m TORC1通过磷酸化底物4E-BP和p70S6K调节e IFs复合物形成,启动m RNA翻译,因此,m TORC1是调控m RNA翻译的关键分子。在体内,mRNA翻译受RISC(RNA-induced silencing complex)/mi RNA负性调控。Argonaute(ago)是RISC复合物的关键分子,在哺乳动物细胞中存在四种亚型,只有ago2具有核酸酶活性,当mi RNA与m RNA序列高度匹配时,ago2切割m RNA,从而负性调控m RNA翻译。ago2与mi RNA、GW182等分子共同组成RISC发挥基因静默作用。研究发现ago2磷酸化修饰对基因静默具有重要作用。ago2 C端S824-S834中5个高度保守的丝氨酸基序受酪蛋白激酶CSNK1A1和蛋白磷酸酶ANKRD52-PPP6C的平衡调控。这5个丝氨酸被CSNK1A1磷酸化后通过抑制RISC形成而抑制RISC/mi RNA的静默功能。多个研究发现ago2 S387也受到磷酸化修饰,S387磷酸化后通过抑制ago2核酸酶活性、影响与GW182结合、影响其细胞内定位等多种方式调控ago2的生物学功能。但究竟是哪一种蛋白激酶介导了ago2 S387的磷酸化仍存在争议。本课题组前期研究发现m TORC1在体内外均可与ago2结合,初步发现m TORC1介导ago2 S387磷酸化。本研究旨在进一步夯实m TORC1磷酸化ago2 S387这一发现,探究S387磷酸化与C端磷酸化之间是否存在依存,探究S387磷酸化对mi RNA静默功能的影响。方法:1.利用慢病毒介导的shRNA静默HEK-293T中Raptor或Rictor以分别调节m TORC1和m TORC2/Akt活性,用S387磷酸化抗体探究m TORC1、m TORC2/Akt对ago2 S387磷酸化的影响;2.利用非同位素体外蛋白激酶实验,进一步探究m TORC1对ago2 S387磷酸化的影响;3.利用CRISPR-Cas9构建ago2敲除细胞株,用重组慢病毒将ago2-WT/S387A/S387E回输入上述ago2细胞中。用ago2-RIP(RNA immunoprecipitation)探究S387突变体的RNA结合能力(mi RNA静默功能);4.利用GFP-miR19 miRNA静默报道基因及流式细胞术分析m TORC1不同活性下及ago2-WT/S387A/S387E回输细胞中GFP强度变化(mi RNA静默功能);5.利用前期构建的ANKRD52敲除细胞株(因缺乏PPP6C磷酸酶,ago2 C端5个丝氨酸处于高度磷酸化状态)及Phos-tag/ago2 Western blot探究S387与C端磷酸化的关系。结果:1.HEK-293T中Raptor敲低后mTORC1活性降低,ago2 S387磷酸化水平降低;Rictor敲低后m TORC2/Akt活性降低,但ago2 S387磷酸化水平无变化,进一步夯实mTORC1磷酸化ago2 S387,排除了Akt磷酸化ago2 S387的可能性。2.非同位素体外蛋白激酶结果表明mTORC1在体外可磷酸化ago2 S387。3.ago2-RIP结果表明ago2-WT或ago2-S387A回输细胞中其结合RNA的能力高于ago2-S387E。4.GFP荧光强度随mTORC1活性的变化而变化—高mTORC1活性状态下,GFP荧光强度增强,而低m TORC1活性状态下,GFP荧光强度减弱;ago2-S387E回输细胞中GFP增强,ago2-S387A回输细胞中GFP变弱。5.Phos-tag结果表明ago2 S387位点突变后S824-S834仍能被磷酸化,即S824-S834的磷酸化与S387磷酸化无依存关系。结论:mTORC1通过磷酸化ago2 S387,抑制了ago2结合RNA的能力,影响了mi RNA介导的静默效应。ago2 S387的磷酸化与C端S824-S834的磷酸化不存在依存关系。

关键词： mTORC1 ago2 RISC miRNA

Is circulating exosome carry Staphylococcal nuclease domain-containing protein 1, a component of RNA-induced silencing complex?

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Genes & Diseases 2021年第2期8卷 115-116页

作者： Varsha D.Shiragannavar Nirmala G.Sannappa Gowda Prasanna K.Santhekadur Department of Biochemistry Center of Excellence in Molecular Biology&Regenerative MedicineJSS Medical CollegeJSS Academy of Higher Education and ResearchMysoreKarnatakaIndia

The RNA induced silencing complex(RISC)is a major eukaryotic cellular machinery which plays pivotal role in gene regulation.Argonaute-2(ago2)and Staphylococcal nuclease domain-containing protein 1(SND1)are key func-tional components of this complex and have RNA binding ability and ribonuclease activity.Circulating Extracellular Vesicles(EVs)have high importance in cancer research and studies have shown that presence of ago2 in EVs regulates gene expression in recipient cells.

关键词： exosome carry ago2

Argonaute 2和微小RNA-145-5p对肝癌细胞增殖和转移的影响

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中华实验外科杂志 2023年第12期40卷 2491-2494页

作者：李威威赵杰商丘市第一人民医院/徐州医科大学商丘临床学院胃肠肝胆外科商丘476000

目的探讨ago2和微小RNA(miRNA,miR)-145-5p对肝癌细胞增殖和转移的影响。方法选取2018年6月至2022年12月商丘市第一人民医院收治的98例肝癌患者肿瘤组织和癌旁组织作为研究对象,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白质免疫印迹分析miR-1... 详细信息

目的探讨ago2和微小RNA(miRNA,miR)-145-5p对肝癌细胞增殖和转移的影响。方法选取2018年6月至2022年12月商丘市第一人民医院收治的98例肝癌患者肿瘤组织和癌旁组织作为研究对象,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白质免疫印迹分析miR-145-5p和ago2表达水平。采用慢病毒在人肝癌细胞系HepG2建立miR-145-5p过表达细胞系,分别为miRNA对照组和miR-145-5p组,采用蛋白质印迹法(Western blot)分析ago2表达水平;采用慢病毒构建ago2敲降细胞系,为对照组和ago2组,采用荧光定量PCR分析miR-145-5p表达水平。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)分析不同细胞的增殖能力;采用划痕实验和Transwell实验分析不同细胞的迁移和侵袭能力;分析ago2和miR-145-5p表达的关系。组间比较采用t检验。结果肝癌组织中ago2蛋白表达水平(1.99±0.18)高于癌旁组织(1.20±0.12),差异有统计学意义(t=25.260,P2.01±0.12)高于miR-145-5p组(1.45±0.13),差异有统计学意义(t=7.616,Pago2组(2.44±0.13),差异有统计学意义(t=6.603,P2.74±3.06)%]高于miR-145-5p组[(51.50±5.85)%],差异有统计学意义(t=7.879,Pago2组[(88.69±2.63)%],差异有统计学意义(t=6.387,P2)个]高于miR-145-5p组[(77.50±6.98)个],差异有统计学意义(t=4.224,Pago2组[(132.83±5.34)个],差异有统计学意义(t=9.941,Pago2是miR-145-5的靶基因。miRNA对照组ago2蛋白表达水平(1.46±0.14)高于miR-145-5p组(0.74±0.12),差异有统计学意义(t=9.625,Pago2蛋白表达水平,进而调节肝癌细胞的增殖和转移等恶性细胞生物学行为。

关键词：微小RNA-145-5p ago2 肝癌增殖转移

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单分子检测FTO和ago2的研究

单分子检测FTO和Ago2的研究

作者：李冬玲山东师范大学

学位级别：硕士

单分子检测技术是一个崭新发展的技术,具有单分子检测灵敏度。单分子检测技术具有灵敏度高、特异性好和样品消耗少的优点,已被广泛应用于生化分析、药物研发和疾病早期诊断领域。本论文中,我们基于单分子检测技术构建了两种生物传感器... 详细信息

单分子检测技术是一个崭新发展的技术,具有单分子检测灵敏度。单分子检测技术具有灵敏度高、特异性好和样品消耗少的优点,已被广泛应用于生化分析、药物研发和疾病早期诊断领域。本论文中,我们基于单分子检测技术构建了两种生物传感器用于灵敏检测去甲基化酶FTO和蛋白ago2。具体研究内容如下:1、我们开发了一种基于滚环转录(Rolling Circle Transcription,RCT)和CRISPR/Cas12a系统的方法结合单分子检测技术灵敏检测FTO。N6-甲基腺苷(N6-methyladenine,m6A)修饰是哺乳动物细胞中最常见的m RNA修饰,受到RNA去甲基化酶的动态可逆调节,例如脂肪质量和肥胖相关蛋白(FTO)和烷基化修复同源蛋白5(ALKBH5)。RNA去甲基化酶的异常表达与许多人类疾病密切相关,包括人类肥胖和癌症。在本工作中,我们设计了含有特异性序列(5’-G-A-T-C-3’)的单链DNA(single-stranded DNA,ss DNA)作为底物,并在3’端修饰了生物素。当靶标FTO存在时,可识别底物ss DNA中的m6A并去除。磁性分离后,裂解的双链DNA(double-stranded DNA,ds DNA)底物可作为引物启动基于T7RNA聚合酶的RCT扩增,生成大量CRISPR RNA(cr RNA)。产物cr RNA又可引发由CRISPR/Cas12a系统催化的FAM荧光标记探针的裂解,释放大量FAM分子。释放的FAM分子可以通过基于全内反射荧光(total internal reflection fluorescence,TIRF)的单分子检测简单计数,通过检测FAM分子可以实现对FTO活性的准确定量。cr RNA引发FAM标记探针的裂解有效抑制了非特异性背景信号,磁性分离和单分子检测的引入进一步提高了该方法的灵敏度。该方法具有较高的特异性和灵敏度,检出限为1.20×10 M,甚至可以在单细胞水平检测FTO。该方法可以准确区分FTO在健康人和乳腺癌患者组织中的表达。它可用于潜在抑制剂的筛选,在临床诊断、生物医学研究和药物研发方面具有很大的潜力。2、我们开发了一种基于金纳米颗粒(Au NP)的单分子生物传感器,用于简单、灵敏地检测ago2活性。ago2是RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)的重要组成部分,参与多种生理过程,ago2活性失调与包括癌症在内的多种人类疾病密切相关。已报道的ago2测定方法通常存在操作繁琐、反应体系复杂和灵敏度低等缺点。在本工作中,我们通过在Au NP上自组装多个Cy5标记的信号探针构建了对ago2特异响应的Au NP探针。在该探针中,Cy5荧光能够被Au NP有效猝灭。当存在靶标ago2时,它与引导RNA(guide RNA,g RNA)结合形成活性RISC,RISC能够循环裂解信号探针,导致Cy5分子从Au NP探针释放。释放的Cy5分子可以通过单分子计数准确定量。该生物传感器无需任何抗体和蛋白酶的参与,仅利用单个Au NP探针就可以均相检测ago2活性。该单分子生物传感器具有高特异性和灵敏度,检出限为9.10×10 M,可用于ago2抑制剂的筛选、ago2动力学分析和人体细胞内源性ago2活性的测定,在ago2相关的生物医学研究和临床诊断中具有广阔应用前景。

关键词：去甲基化酶 ago2 单分子计数纳米传感器

白纹伊蚊ago2和Dcr-2基因片段克隆及各发育期转录水平分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2012年第3期30卷 214-217页

作者：蔡燕丽郑学礼南方医科大学公共卫生与热带医学学院病原生物学教研室广州510515

目的克隆白纹伊蚊(Aedes albopictus)RNA干扰通路相关ago2和Dcr-2基因片段,并分析该蚊种不同发育阶段这2个基因片段的转录水平。方法根据埃及伊蚊(Ae.aegypti)ago2和Dcr-2蛋白的氨基酸序列保守区设计简并引物,经RT-PCR从白纹伊蚊雌蚊总... 详细信息

目的克隆白纹伊蚊(Aedes albopictus)RNA干扰通路相关ago2和Dcr-2基因片段,并分析该蚊种不同发育阶段这2个基因片段的转录水平。方法根据埃及伊蚊(Ae.aegypti)ago2和Dcr-2蛋白的氨基酸序列保守区设计简并引物,经RT-PCR从白纹伊蚊雌蚊总RNA中分别扩增ago2和Dcr-2 cDNA,并与载体pMD18-T连接,转染大肠埃希菌(E.coli)后,筛选阳性克隆,测序并做Blastx分析。根据获得的白纹伊蚊ago2和Dcr-2基因片段设计特异性引物,采用半定量RT-PCR分析白纹伊蚊卵、Ⅰ/Ⅱ龄幼虫、Ⅲ/Ⅳ龄幼虫、蛹、雄蚊和雌蚊中这2个基因的mRNA水平。结果获得的ago2和Dcr-2 cDNA片段大小分别为326 bp和491 bp,登录号分别为JQ764670和JQ764671。Blastx分析结果显示,该2个序列编码的氨基酸序列与埃及伊蚊的ago2和白纹伊蚊的Dcr-2氨基酸序列的同源性分别为91%和98%。ago2和Dcr-2基因在白纹伊蚊不同发育阶段中均有转录,于雌蚊中的mRNA水平最高,分别为雄蚊中mRNA的3.1倍和15.5倍,显著高于其他各阶段的mRNA水平(Pago2和Dcr-2基因部分cDNA片段,并发现这2个基因在雌蚊中转录水平最高。

关键词：白纹伊蚊 RNA干扰 ago2 Dcr-2

m^(7)G相关基因是影响肝细胞性肝癌预后的潜在生物标志物

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山西医科大学学报 2022年第10期53卷 1212-1218页

作者：王瑶徐璞李卓西安医学院第一附属医院检验科西安710077

目的探讨m^(7)G相关基因能否作为肝细胞性肝癌预后的生物标志物。方法采用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库筛选肝细胞性肝癌组织和癌旁组织中有表达差异的m^(7)G相关基因组,m^(7)G相关基因和临床数据中的生存时间... 详细信息

目的探讨m^(7)G相关基因能否作为肝细胞性肝癌预后的生物标志物。方法采用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库筛选肝细胞性肝癌组织和癌旁组织中有表达差异的m^(7)G相关基因组,m^(7)G相关基因和临床数据中的生存时间及生存状态按照样本ID号匹配合并后筛选预后基因组,将两组的交集基因纳入lasso回归,对筛选出来的基因进行风险评分,基于风险评分的中位数值将所有肝细胞性肝癌患者分为高、低两个风险组,并对高分险组和低风险组进行单因素和多因素的Cox回归分析,评价风险评分在预后中的差异。结果经lasso回归筛选出4个模型基因(ago2、NCBP1、NCBP2、WDR4),高风险组的生存率显著低于低风险组(P=0.027),ROC曲线显示风险模型对患者1,2,3年生存预测的曲线下面积(AUC)分别为0.683,0.604,0.602。肿瘤分期、T分期、M分期和风险评分是肝细胞性肝癌预后的相关因素(Pago2、NCBP1、NCBP2和WDR4构建的风险模型对肝细胞性肝癌具有重要的预后价值。

关键词： m^(7)G 肝细胞性肝癌疾病预后 ago2 NCBP1 NCBP2 WDR4

龙眼miR403及其候选靶标对外源激素的响应模式以及在龙眼体胚中的表达模式

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应用与环境生物学报 2019年第4期25卷 977-984页

作者：苏立遥黄倏祺蒋梦琦厉雪徐小萍陈旭赖钟雄林玉玲福建农林大学园艺植物生物工程研究所

MicroRNA403(miR403)为双子叶植物特有的miRNA家族,其在双子叶植物抗病、逆境胁迫和生长发育中具有重要作用.为了解miR403及其候选靶标对外源激素的响应模式以及在龙眼体胚发生过程中的表达模式,利用psRNAtarget对miR403潜在靶标进行预... 详细信息

MicroRNA403(miR403)为双子叶植物特有的miRNA家族,其在双子叶植物抗病、逆境胁迫和生长发育中具有重要作用.为了解miR403及其候选靶标对外源激素的响应模式以及在龙眼体胚发生过程中的表达模式,利用psRNAtarget对miR403潜在靶标进行预测,采用改良RLM-RACE技术验证其裂解位点,通过qPCR技术检测miR403及其候选靶标对外源激素的应答及在龙眼体胚中的表达模式.结果显示,共获得41个龙眼miR403的潜在靶标,包含4个PPR(Pentatricopeptide repeat protein)和3个PCNT115(Auxin-induced protein PCNT115),却未发现ago2(Argonaute2).4个PPR中Dlo014588.1和Dlo014589.1序列一致,而3个PCNT115基因序列在所预测的miR403结合位点上下游序列基本一致.裂解位点显示,miR403不具备裂解ago2 mRNA的能力,但介导PPR(Dlo014588.1)和PCNT115 mRNA的裂解,裂解位点位于miR403 5′端的第2和第3个碱基之间. qPCR显示,miR403响应脱落酸(ABA)信号并显著上调,PPR和PCNT115对不同浓度的ABA呈现不同的表达模式,PPR和PCNT115在5μg/L ABA时显著上调,随后,PPR先显著下调(50μg/L ABA),而后显著上调(5 000μg/L ABA),而PCNT115呈显著下调趋势;miR403不响应赤霉素(GA3)信号,而PPR和PCNT115随着GA3浓度升高而上调;miR403可以响应不同浓度的水杨酸(SA)和2,4-D信号显著下调,而其靶基因显著上调.不同胚性培养物中qPCR显示,miR403仅在龙眼胚性愈伤组织(EC)高度表达且在龙眼体胚发生过程中显著下调,PPR在EC和子叶胚(CE)高度表达,PCNT115在CE和成熟胚(ME)高水平表达,三者之间并未呈现明显的负调控趋势.本研究表明在龙眼体胚中miR403并不靶向调控ago2,而是调控PPR和PCNT115;另外,miR403可能响应ABA、SA和2,4-D调控PPR和PCNT15参与到龙眼体胚发生过程中.

关键词：龙眼 miR403 靶基因 PPR PCNT115 ago2 激素响应体胚发生