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Phosphorylation of ago2 is required for its role in DNA double-strand break repair

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Journal of Genetics and Genomics 2021年第4期48卷 333-340页

作者： Xiaolu Hu Yan Li Tianfang Zhang Lin Li She Chen Xiaohong Wu Haijun Li Binjie Qi Zuobing Chen Department of Rehabilitation Medicine The First Affiliated HospitalCollege of MedicineZhejiang UniversityHangzhou 310000China Center for Plant Biology School of Life SciencesTsinghua UniversityBeijing 100084China Tsinghua-Peking Center for Life Sciences Beijing 100084China National Institute of Biological Sciences Zhongguancun Life Science ParkBeijing 102206China

Repair of DNA double-strand break(DSB)is critical for the maintenance of genome integrity.A class of DSB-induced small RNAs(di RNAs)has been shown to play an important role in DSB *** humans,di RNAs are associated with ago2 and guide the recruitment of Rad51 to DSB sites to facilitate repair by homologous recombination(HR).ago2 activity has been reported to be regulated by phosphorylation under normal and hypoxic ***,the role of ago2 phosphorylation in DNA damage repair is ***,we show that S672,S828,T830,and S831 of human ago2 are phosphorylated in response to ionizing radiation(IR).S672 A mutation of ago2 leads to significant reduction in Rad51 foci formation and HR *** further show that defective association of ago2 S672 A variant with DSB sites,instead of defects in di RNA and Rad51 binding,may account for decreased Rad51 foci formation and HR *** study reveals a novel regulatory mechanism for the function of ago2 in DNA repair.

关键词： ago2 diRNA DNA repair Phosphorylation Small RNA

白纹伊蚊ago2和Dcr-2基因片段克隆及各发育期转录水平分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2012年第3期30卷 214-217页

作者：蔡燕丽郑学礼南方医科大学公共卫生与热带医学学院病原生物学教研室广州510515

目的克隆白纹伊蚊(Aedes albopictus)RNA干扰通路相关ago2和Dcr-2基因片段,并分析该蚊种不同发育阶段这2个基因片段的转录水平。方法根据埃及伊蚊(***)ago2和Dcr-2蛋白的氨基酸序列保守区设计简并引物,经RT-PCR从白纹伊蚊雌蚊总RNA中分... 详细信息

目的克隆白纹伊蚊(Aedes albopictus)RNA干扰通路相关ago2和Dcr-2基因片段,并分析该蚊种不同发育阶段这2个基因片段的转录水平。方法根据埃及伊蚊(***)ago2和Dcr-2蛋白的氨基酸序列保守区设计简并引物,经RT-PCR从白纹伊蚊雌蚊总RNA中分别扩增ago2和Dcr-2 cDNA,并与载体pMD18-T连接,转染大肠埃希菌(***)后,筛选阳性克隆,测序并做Blastx分析。根据获得的白纹伊蚊ago2和Dcr-2基因片段设计特异性引物,采用半定量RT-PCR分析白纹伊蚊卵、Ⅰ/Ⅱ龄幼虫、Ⅲ/Ⅳ龄幼虫、蛹、雄蚊和雌蚊中这2个基因的mRNA水平。结果获得的ago2和Dcr-2 cDNA片段大小分别为326 bp和491 bp,登录号分别为JQ764670和JQ764671。Blastx分析结果显示,该2个序列编码的氨基酸序列与埃及伊蚊的ago2和白纹伊蚊的Dcr-2氨基酸序列的同源性分别为91%和98%。ago2和Dcr-2基因在白纹伊蚊不同发育阶段中均有转录,于雌蚊中的mRNA水平最高,分别为雄蚊中mRNA的3.1倍和15.5倍,显著高于其他各阶段的mRNA水平(Pago2和Dcr-2基因部分cDNA片段,并发现这2个基因在雌蚊中转录水平最高。

关键词：白纹伊蚊 RNA干扰 ago2 Dcr-2

ago2与TNRC6A在急性髓细胞白血病中的表达及意义

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AGO2与TNRC6A在急性髓细胞白血病中的表达及意义

作者：张晓鸣华中科技大学

学位级别：硕士

目的:本实验通过检测除急性早幼粒细胞白血病(APL/M3)外的急性髓细胞白血病(AML)患者骨髓单个核细胞中RNA诱导沉默复合体(RISC)相关蛋白ago2和TNRC6A的mRNA表达水平,在不同层面分组后比较ago2和TNRC6A的mRNA相对表达量差异,分析ago2和TN... 详细信息

目的:本实验通过检测除急性早幼粒细胞白血病(APL/M3)外的急性髓细胞白血病(AML)患者骨髓单个核细胞中RNA诱导沉默复合体(RISC)相关蛋白ago2和TNRC6A的mRNA表达水平,在不同层面分组后比较ago2和TNRC6A的mRNA相对表达量差异,分析ago2和TNRC6A的表达水平与急性髓细胞白血病各临床指标之间可能存在的联系;同时检测体外培养的白血病细胞系(THP1、KG1a、K562)中ago2的mRNA表达水平,进一步证实ago2 mRNA的表达量在白血病与正常人之间的差异,据此推断ago2以及TNRC6A蛋白在AML的发生发展中可能存在的作用以及RNA诱导的基因调节与AML的发生、发展、治疗等可能存在的关系,为探索AML新的发病机制和新的治疗靶点等多方面提供新的思路。方法:1、收集92例AML(除M3外)患者骨髓标本及20例正常人骨髓标本(AML标本中82例为初治患者骨髓标本,10例为上述患者中的10名患者经一疗程化疗后的骨髓标本),采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测骨髓单个核细胞内ago2、TNRC6A蛋白mRNA的表达水平,使用2-△△ct法计算各个标本ago2、TNRC6A mRNA的相对表达量。同时收集上述患者的临床资料,将患者按性别、年龄、诊断分类、危险度分级、治疗后缓解情况等多种临床特征进行分组,分别比较ago2以及TNRC6AmRNA在各组间相对表达量的差异。2、体外培养THP1、KG1a以及K562三种白血病细胞系,分别在细胞生长状态良好时收集细胞并进行RNA的提取(提取健康成人外周血单个核细胞RNA作为对照),采用RT-PCR技术检测上述三种白血病细胞以及正常人外周血单个核细胞中ago2蛋白mRNA的表达水平,使用2-△△ct法计算各组细胞中ago2 mRNA相对表达量,比较三种白血病细胞和正常人单个核细胞ago2蛋白mRNA的表达差异,进一步探讨ago2蛋白与白血病之间可能存在的关系。结果:1、ago2和TNRC6A mRNA在AML患者中的表达情况:1)AML患者中二者的表达均明显高于正常对照组;2)高危组患者中二者的表达均高于低危患者;3)高白组(白细胞大于100*10^9)患者中二者表达均高于非高白组(白细胞小于100*10^9);4)预后不良染色体核型组中二者表达均高于良好染色体核型组,ago2mrna在预后不良染色体核型组表达还高于预后中等染色体核型组;5)预后基因分组中,单独flt3-itd阳性组二者的表达均高于预后基因阴性组,nmp1阳性或(和)cebpa阳性组tnrc6amrna的表达高于预后基因阴性组;6)患者第一次化疗后二者表达水平均显著下降;7)未缓解组患者中二者的表达均高于完全缓解组及部分缓解组;8)按诊断分组并进行两两间比较,其中m6患者中ago2mrna表达高于m1患者,m1患者中tnrc6a表达高于m2患者;以上各组间比较差异均有统计学意义(p2、ago2和tnrc6amrna表达量之间的相关关系:二者的表达在正常对照组中无相关关系(person相关系数r=0.0275,p=0.936);二者在aml患者组中的表达具有正相关关系(person相关系数r=0.381,p=0.009)。3、ago2mrna在thp1、kg1a以及k562三种白血病细胞系中表达情况:三种细胞系中ago2mrna的表达均高于正常人单个核细胞,其中以k562相对表达量最高,kg1a次之,差异均具有统计学意义(p﹤0.05)。结论:***2mrna及tnrc6amrna在aml患者中较正常对照组高表达,同时ago2mrna在体外培养的三种白血病细胞系中均较正常人高表达,高度提示rna诱导沉默复合体(risc)核心蛋白ago2及rna诱导的基因调节与aml之间可能存在密切关系。ago2mrna及tnrc6amrna分别在第一次化疗前组、高危组、高白细胞组、预后不良染色体核型组、不良分子学预后组等组内高表达,进一步说明ago2及tnrc6a表达升高可能与aml的发生发展过程及不良预后相关,预示rna诱导的基因调节在白血病的发生发展中可能有着重要的作用。ago2及tnrc6amrna在化疗后未缓解组高表达,提示二者可能与aml患者的耐药相关。ago2在m6患者中高表达,暗示其可能在m6的发生发展中有着独特的作用。tnrc6amrna同时在伴有良好预后基因组和伴不良预后基因组高表达,暗示其可能在aml的分子学改变中存在一定作用。***2 mRNA与TNRC6A mRNA的表达量在正常对照组无相关关系,而在AML患者组中具有正相关关系,预示着ago2蛋白与TNRC6A蛋白在白血病的发展中可能存在协同作用,基于二者都是RISC的重要蛋白组分,进一步提示RNA诱导的

关键词：急性髓细胞白血病 ago2 TNRC6A RNAi RISC

系统性红斑狼疮外周血Dicer和ago2的表达

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现代免疫学 2012年第1期32卷 25-30页

作者：陈兰芳王树军唐元家沈南上海交通大学医学院附属仁济医院风湿科上海市风湿病学研究所上海200001 中国科学院上海生命科学研究院/上海交通大学医学院健康科学研究所分子风湿病学研究组上海200025 淄博市中心医院风湿科淄博255000

Dicer和ago2是RNA干扰(RNAi)中重要的酶,本研究检测常见自身免疫病系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)和强直性脊柱炎(AS)患者中Dicer和ago2的表达水平并分析其与SLE临床特征的相关性。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time... 详细信息

Dicer和ago2是RNA干扰(RNAi)中重要的酶,本研究检测常见自身免疫病系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)和强直性脊柱炎(AS)患者中Dicer和ago2的表达水平并分析其与SLE临床特征的相关性。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测41例SLE、24例RA、13例AS患者和21例正常人外周血白细胞中Dicer和ago2的表达水平,并分析其与SLE疾病活动指数(SLEDAI)、SLE肾脏损伤活动指数(renal-SLEDAI)及临床用药之间的相关性。结果显示,Dicer表达水平在SLE、RA和AS患者中较正常对照显著升高(P=0.0051;Pago2表达水平仅在SLE患者中显著升高(P=0.0015)。Dicer表达水平在中度以上活动性SLE患者中较轻度以下活动性患者显著升高(P=0.032),并且与SLEDAI正相关(r=0.4075,P=0.0254),在狼疮肾炎患者中较无狼疮肾炎患者显著升高(P=0.0367),与renal-SLEDAI显著正相关(r=0.4014,P=0.0309),但ago2表达水平与SLEDAI积分无明显相关性,且在狼疮肾炎患者中也无明显变化,不同量激素治疗组之间Dicer与ago2均无显著差异。提示,Dicer和ago2的表达水平在SLE患者中均显著升高且前者与SLEDAI积分、Renal-SLEDAI积分正相关,Dicer升高提示SLE活动及肾脏损害,可能参与SLE的发病。

关键词： Dicer ago2 微小RNA 系统性红斑狼疮

ago2 387丝氨酸位点磷酸化对miRNA静默效应的影响

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Ago2 387丝氨酸位点磷酸化对miRNA静默效应的影响

作者：姚春芳江苏大学

学位级别：硕士

背景及目的:机制性的雷帕霉素靶分子(the mechanistic target of rapamycin,m TOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在生物体内以m TORC1与m TORC2复合体形式存在。m TORC1通过整合生长因子、能量、营养、应激等信号,调控细胞内脂质、蛋白... 详细信息

背景及目的:机制性的雷帕霉素靶分子(the mechanistic target of rapamycin,m TOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在生物体内以m TORC1与m TORC2复合体形式存在。m TORC1通过整合生长因子、能量、营养、应激等信号,调控细胞内脂质、蛋白质、核酸等生物大分子的合成代谢。m TORC1通过磷酸化底物4E-BP和p70S6K调节e IFs复合物形成,启动m RNA翻译,因此,m TORC1是调控m RNA翻译的关键分子。在体内,mRNA翻译受RISC(RNA-induced silencing complex)/mi RNA负性调控。Argonaute(ago)是RISC复合物的关键分子,在哺乳动物细胞中存在四种亚型,只有ago2具有核酸酶活性,当mi RNA与m RNA序列高度匹配时,ago2切割m RNA,从而负性调控m RNA翻译。ago2与mi RNA、GW182等分子共同组成RISC发挥基因静默作用。研究发现ago2磷酸化修饰对基因静默具有重要作用。ago2 C端S824-S834中5个高度保守的丝氨酸基序受酪蛋白激酶CSNK1A1和蛋白磷酸酶ANKRD52-PPP6C的平衡调控。这5个丝氨酸被CSNK1A1磷酸化后通过抑制RISC形成而抑制RISC/mi RNA的静默功能。多个研究发现ago2 S387也受到磷酸化修饰,S387磷酸化后通过抑制ago2核酸酶活性、影响与GW182结合、影响其细胞内定位等多种方式调控ago2的生物学功能。但究竟是哪一种蛋白激酶介导了ago2 S387的磷酸化仍存在争议。本课题组前期研究发现m TORC1在体内外均可与ago2结合,初步发现m TORC1介导ago2 S387磷酸化。本研究旨在进一步夯实m TORC1磷酸化ago2 S387这一发现,探究S387磷酸化与C端磷酸化之间是否存在依存,探究S387磷酸化对mi RNA静默功能的影响。方法:1.利用慢病毒介导的shRNA静默HEK-293T中Raptor或Rictor以分别调节m TORC1和m TORC2/Akt活性,用S387磷酸化抗体探究m TORC1、m TORC2/Akt对ago2 S387磷酸化的影响;2.利用非同位素体外蛋白激酶实验,进一步探究m TORC1对ago2 S387磷酸化的影响;3.利用CRISPR-Cas9构建ago2敲除细胞株,用重组慢病毒将ago2-WT/S387A/S387E回输入上述ago2细胞中。用ago2-RIP(RNA immunoprecipitation)探究S387突变体的RNA结合能力(mi RNA静默功能);4.利用GFP-miR19 miRNA静默报道基因及流式细胞术分析m TORC1不同活性下及ago2-WT/S387A/S387E回输细胞中GFP强度变化(mi RNA静默功能);5.利用前期构建的ANKRD52敲除细胞株(因缺乏PPP6C磷酸酶,ago2 C端5个丝氨酸处于高度磷酸化状态)及Phos-tag/ago2 Western blot探究S387与C端磷酸化的关系。结果:***-293T中Raptor敲低后mTORC1活性降低,ago2 S387磷酸化水平降低;Rictor敲低后m TORC2/Akt活性降低,但ago2 S387磷酸化水平无变化,进一步夯实mTORC1磷酸化ago2 S387,排除了Akt磷酸化ago2 S387的可能性。2.非同位素体外蛋白激酶结果表明mTORC1在体外可磷酸化ago2 S387。***2-RIP结果表明ago2-WT或ago2-S387A回输细胞中其结合RNA的能力高于ago2-S387E。***荧光强度随mTORC1活性的变化而变化—高mTORC1活性状态下,GFP荧光强度增强,而低m TORC1活性状态下,GFP荧光强度减弱;ago2-S387E回输细胞中GFP增强,ago2-S387A回输细胞中GFP变弱。***-tag结果表明ago2 S387位点突变后S824-S834仍能被磷酸化,即S824-S834的磷酸化与S387磷酸化无依存关系。结论:mTORC1通过磷酸化ago2 S387,抑制了ago2结合RNA的能力,影响了mi RNA介导的静默效应。ago2 S387的磷酸化与C端S824-S834的磷酸化不存在依存关系。

关键词： mTORC1 ago2 RISC miRNA

ago2-RAD51相互作用促进DNA双链断裂修复的机制研究

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AGO2-RAD51相互作用促进DNA双链断裂修复的机制研究

作者：金康宣中国科学院北京基因组研究所

学位级别：硕士

DNA双链断裂损伤(DSB)是一种细胞毒性非常高的损伤形式。如不能进行正确有效的修复,DSB将造成遗传信息的改变、缺失,严重影响基因组的稳定性,最终导致细胞凋亡或细胞癌变。因此,真核细胞中具备了两种修复DSB的机制,一种是非同源末端连接... 详细信息

DNA双链断裂损伤(DSB)是一种细胞毒性非常高的损伤形式。如不能进行正确有效的修复,DSB将造成遗传信息的改变、缺失,严重影响基因组的稳定性,最终导致细胞凋亡或细胞癌变。因此,真核细胞中具备了两种修复DSB的机制,一种是非同源末端连接(NHEJ)、另一种是同源重组(HR)。由于机制的区别,这两种修复方式分别在特定细胞周期内发挥主要的修复作用：NHEJ主要在分裂问期发挥作用,但修复结果容易产生局部遗传信息的改变;HR途径主要在G2/S期发挥作用,依赖于同源序列为修复模板,因此能够保证高精度的修复。过去人们认为只有蛋白参与了DSB的修复,但最新的结果表明一种名为diRNA的非编码小RNA也参与其中。diRNA是产生于损伤位点附近的长度约为21nt的小RNA, diRNA的产生依赖于核酸酶Dicer,效应依赖于小RNA干扰核心分子ago2。然而,diRNA参与DSB修复的具体机制还不明确,ago2与diRNA的效应能否影响修复蛋白在DSB位点的募集及染色质结构也是未知。本课题通过筛选鉴定diRNA效应分子ago2的新的互作蛋白发现ago2与DSB修复蛋白RAD51存在相互作用,并且ago2能够结合在损伤位点附近同时促进同源重组关键分子RAD51在DSB位点的募集。通过在293T细胞中过表达外源ago2后进行的免疫沉淀证明了ago2与包括RAD51在内的多个DSB修复蛋白间的存在相互作用,此外,免疫荧光检测IR照射细胞后形成的foci发现只有RAD51foci受到ago2的影响,表明diRNA和ago2能够影响RAD51在损伤位点的募集。过表达外源RAD51和内源RAD51的免疫沉淀从不同方向均证实了ago2与RAD51间的相互作用稳定存在。对ago2-RAD51相互作用的深入研究发现,细胞受到IR损伤处理后,ago2-RAD51相互作用显著增强。但ago2片段免疫沉淀未能确定介导ago2-RAD51相互作用的区域。不能结合小RNA的ago2突变体以及Dicer敲低引起的diRNA生成缺失都不影响ago2-RAD51相互作用,表明ago2-RAD51相互作用不依赖于diRNA。染色质共沉淀结果则显示ago2能够结合到损伤位点附近的DNA上。这些结果表明ago2能够通过自身结合到在DSB附近和与RAD51的相互作用直接促进RAD51在DSB位点的聚集。因此,本课题为阐明diRNA促进DSB修复的分子机制提供了重要依据,建立了小RNA通路与DNA损伤修复通路间的联系,拓展了对DNA损伤修复机制和非编码小RNA功能的认识。但是diRNA和ago2参与DNA损伤修复的机制还有诸多不明确的地方,有待进一步的深入研究。

关键词： diRNA ago2 RAD51 DNA双联断裂修复

ago2与L1-ORF1p在LINE-1负反馈调控中的作用机制研究

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AGO2与L1-ORF1p在LINE-1负反馈调控中的作用机制研究

作者：娄亮亮北京交通大学

学位级别：硕士

在真核生物基因组中存在许多重复序列,其中大多是非编码序列。非编码序列对编码基因的转录、翻译和翻译后等过程具有重要的调控作用,移动元件作为其重要组成部分和生物的进化程度呈正相关。此外,这些移动元件的活化可影响相邻基因的表达... 详细信息

在真核生物基因组中存在许多重复序列,其中大多是非编码序列。非编码序列对编码基因的转录、翻译和翻译后等过程具有重要的调控作用,移动元件作为其重要组成部分和生物的进化程度呈正相关。此外,这些移动元件的活化可影响相邻基因的表达,例如在编码区内或临近位置的插入能引起基因突变,从而导致基因表达的变化和基因组的重塑。Long interspersed element1(LINE-1, L1)作为移动元件中唯一一种自主活性的逆转座子,研究发现其在肿瘤细胞普遍激活,在正常分化的细胞中则处于沉默状态,它的非正常激活对细胞的增殖分化和肿瘤的发生发展具有重要的作用,提示其涉及到肿瘤发生发展的分子机制。全长的L1基因有两个开放阅读框ORF1和ORF2,能编码两种蛋白L1-ORFlp和L1-ORF2p;其中L1-ORFlp能与自身核酸结合形成核酸蛋白复合物(ribonucleoprotein, RNP),而L1-ORF2p具有内切核酸酶及外切酶活性,可与L1-ORFlp一起执行逆转座功能。课题组前期研究显示,L1-ORFlp在细胞增殖调控以及肿瘤形成过程中具有重要作用。另外L1的5’UTR包含正义与反义的双向启动子,它们的转录产物能生成双链RNA(dsRNA),继而生成siRNA,报道显示第一个endo-siRNA就来源于L1的转录产物。在dsRNA参与的调控中,RISC(RNA Inducing Silence Complex)的形成是一个重要的步骤,而RISC组分之一的Argonaute被认为是关键的蛋白分子。Argonaute(ago)蛋白是一种比较保守的碱性蛋白,分子量大小在100kd左右。在人类的ago蛋白家族中,有四种蛋白,分别是ago1、AG02、AG03和AG04。AG02是唯一一种具有RNA酶活性的家族成员,它能与siRNA结合形成RISC复合物,实现对靶基因的调控。鉴于L1-5'UTR的转录产物能生成dsRNA,我们认为ago2可能参与对L1-5'UTR启动子活性的调控。此外,报道显示L1-ORF1p与RISC且有共定位现象,我们推测Ll-ORF1p有可能与ago2一起参与了L1的负反馈调控。所以我们将ago2和L1-ORF1p作为目标蛋白研究其调控机制。首先我们研究了Ll-ORF1p蛋白与ago家族蛋白的相互作用,结果显示L1-ORF1p与ago1/ago2/ago4具有相互作用,而与ago3没有作用。为探索L1-5’UTR的启动子活性以及dsRNA对其反馈调控的作用,我们利用荧光素酶表达系统,构建了含有全长L1-5'UTR(含有双向启动子,其转录产物能形成dsRNA)以及3’端序列截短的突变体(保留680bp的L1-5'UTR,基本删除反义链启动子序列;保留400bp的L1-5'UTR,完全删除反义链启动子序列)的重组表达载体,通过RNAi干涉下调ago2的表达,观察L1-5'UTR启动子活性的变化。结果显示,ago2的下调能增强全长L1-5'UTR的启动子活性,而对分别含有680bp和400bp的L1-5'UTR启动子活性没有明显的影响,鉴于全长L1-5'UTR可生成dsRNA(进一步加工生成siRNA),提示LINE-1的负反馈机制是由双向启动子转录产物所生成的siRNA介导的,AG02在此过程中起着重要的作用。为探索L1-ORF1p是否参与L1的负反馈调控,我们通过过表达实验,观察其对含有L1-5'UTR全长以及3’端截短的不同突变体活性的影响。结果显示,L1-5'UTR无论是全长还是不同截短的突变体,L1-ORF1p对其启动子活性均具有抑制作用。进一步实验显示,ago2的下调并不能减弱L1-ORF1p对L1-5'UTR启动子活性的抑制作用,提示L1-ORF1p尽管能与ago2发生相互作用,但L1-ORF1p参与对自身表达的负反馈调控不是通过siRNA介导的,其作用机制需要进一步的探索。鉴于L1在肿瘤细胞中被激活,在正常细胞中则沉默,其自身存在的反馈抑制对维持细胞正常活性具有重要意义。本文初步探索了肿瘤发生过程中L1的作用机制及其遗传学基础,期望为新型肿瘤靶向药物的开发提供新的靶点。

关键词：逆转座子LINE-1 ago2 L1-ORF1p 肿瘤

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ago2与DDX21之间相互作用的研究

AGO2与DDX21之间相互作用的研究

作者：张玺湖南师范大学

学位级别：硕士

ago2也被称为EIF2C2,是Argonaute蛋白质家族中的一员。ago2是RISC的核心组成部分,可以通过si RNA或者mi RNA介导的基因沉默降解靶m RNA。ago2还可以在翻译水平上抑制基因的表达。ago2在mi RNA的生物发生中扮演着重要的角色。在细胞核中... 详细信息

ago2也被称为EIF2C2,是Argonaute蛋白质家族中的一员。ago2是RISC的核心组成部分,可以通过si RNA或者mi RNA介导的基因沉默降解靶m RNA。ago2还可以在翻译水平上抑制基因的表达。ago2在mi RNA的生物发生中扮演着重要的角色。在细胞核中发现了ago2的存在,并且在染色质的异染色质化,基因的可变剪接以及DNA双链损伤的同源重组修复中发挥作用。我们通过使用ago2的抗体做免疫共沉淀实验然后质谱检测,结果发现DDX21是与ago2有潜在的相互作用的蛋白。DDX21是DEAD box解旋酶家族的一员,DDX21这个蛋白同时具有RNA解旋酶和折叠酶活性。DDX21在核糖体生物发生的许多过程起重要的作用。此外,DDX21还具有协助转录因子激活转录的作用。本论文采用免疫荧光,免疫共沉淀以及GST-pulldown的实验方法研究了ago2与DDX21的相互作用。免疫荧光和免疫共沉淀的实验结果显示,ago2与DDX21在细胞核内有共定位而且存在相互作用。接着用ago2的GST融合蛋白与DDX21的His融合蛋白做GST-pulldown实验,结果显示DDX21在体外不能直接结合ago2。为了确定ago2与DDX21之间相互作用的媒介,在免疫共沉淀的体系里加入RNase A,结果显示加入RNase A减弱了ago2与DDX21的相互作用。因此ago2与DDX21之间的相互作用与RNA有关。接着在HeLa细胞中过表达ago2或者DDX21,用Western Blot检测DDX21或者ago2蛋白水平的变化。结果显示过表达DDX21可以上调ago2的蛋白水平,但是过表达ago2对DDX21的蛋白水平没有影响。另外发现DDX21上调的是细胞核内ago2的蛋白水平。有文献报道ago2可以影响SMN2的可变剪接。接着在HeLa细胞中过表达DDX21,然后用半定量PCR检测SMN2的可变剪接变化。结果显示过表达DDX21影响了SMN2的可变剪接。综上所述,本论文确定了ago2与DDX21之间存在相互作用,并且这种相互作用与RNA有关。进一步发现了DDX21可以上调细胞核内的ago2的蛋白水平,并且影响了ago2影响的可变剪接。

关键词： ago2 DDX21 相互作用

白纹伊蚊COI基因多态性分析及ago2和Dcr-2基因克隆、转录水平的初步研究

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白纹伊蚊COI基因多态性分析及AGO2和Dcr-2基因克隆、转录水平的初...

作者：蔡燕丽南方医科大学

学位级别：硕士

蚊虫(Mosquito)是自然界中一类最常见的昆虫,在分类上隶属于昆虫纲(Class Insecta Linnaeus),双翅目(Diptera),蚊科(Culicidae),是多种重要疾病的传播媒介。蚊分为三个亚科(subfamilies):巨蚊亚科(Toxorhyncitinae)、按蚊亚科(Anophelinae)和库蚊亚科(Culicinae),其中按蚊亚科和库蚊亚科的许多蚊虫能传播病原体,是医学上重要媒介昆虫或称为病媒昆虫。蚊虫不仅吸血滋扰人类,影响人们的正常工作与休息,还传播多种蚊媒病,直接威胁人类的健康与生命,在世界上大部分地区已成为严重的公共卫生问题。以蚊虫作为传播媒介的病原体要顺利从一个动物宿主传播至另一动物宿主,必须在蚊体内建立有效的繁殖传播模式并同时避免杀死传播媒介。蚊虫传播病原体的能力受到其遗传因素的控制。在长期的进化过程中蚊虫不断受到环境的选择压力,导致种群间基因交流、种群遗传结构出现变化,产生遗传多样性,出现一个种群内也可存在两种以上不同遗传类型的个体。了解它们的差异与传播疾病的能力之间的关系,对蚊媒病的防控具有重要的意义。利用多种分子生物学技术对蚊虫的种群进行遗传分析,调查不同地区蚊虫种群遗传结构和基因流程度,对于控制虫媒传染病具有重要的价值。Kamgang等对非洲喀麦隆南部12个采样地的白纹伊蚊6个微卫星位点和2个线粒体基因ND5和COI遗传多样性进行分析,发现喀麦隆白纹伊蚊种群低水平的遗传变异与近年该物种多次入侵及扩散到该国的现象相关联,其自然种群的遗传结构指向白纹伊蚊由热带地区引入。线粒体DNA在昆虫等生物体内广泛存在,可作为遗传差异分析和特定病毒传播媒介识别的有效标记。蚊虫对病原体的感染能力固然受到自身遗传因素的影响,蚊虫感染病原生物的过程中,实际上也是病原生物侵袭与蚊自身防御的相互斗争过程。RNA干扰作为蚊虫自然抗病毒免疫效应,在生物抗病毒感染、生物发育时序的控制、细胞生长和凋亡等过程中发挥着重要的作用。由siRNA介导的RNA干扰抗病毒效应已在多种媒介昆虫中发现,其中AG02和Dcr-2基因起着关键作用,通过控制或改造媒介RNAi抗病毒效应成为分析媒介和病毒间相互作用的常用手段。如Vargas等通过RNAi沉默AG02、Dcr-2和R2D2基因的表达后,能增加登革2型病毒(Dengue virus type2, DENV2)在埃及伊蚊体内的复制同时缩短病毒传播的外潜伏期。本文尝试对广州市白纹伊蚊COI基因遗传多态性进行分析,从分子水平上探索其与登革热流行的关系;并尝试对白纹伊蚊RNAi通路中重要的两个关键基因AG02和Dcr-2用简并引物进行体外克隆,初步分析它们在白纹伊蚊不同发育阶段和感染登革前后的转录水平,以了解RNAi在白纹伊蚊抗病毒效应中的作用机制,对评估白纹伊蚊的媒介易感效应有着重要的参考价值。目的： 1.分析广州市内不同群体白纹伊蚊细胞色素C氧化酶亚基I基因遗传多态性。 2.克隆白纹伊蚊AG02和Dcr-2基因片段并进行生物信息学分析。 3.分析各发育阶段白纹伊蚊AG02和Dcr-2基因的转录水平。 4.白纹伊蚊雌蚊经胸腔注射感染登革2型病毒,分析感染前后AG02和Dcr-2基因的转录水平差异。方法： 1.2010年9月采集并鉴定广州市12个点的白纹伊蚊成蚊和幼虫。 2.单蚊提取白纹伊蚊雌蚊基因组,扩增细胞色素C氧化酶亚基I基因并纯化PCR产物。 3.所有样本COI基因PCR产物经TaqI酶切成小片段,用单链构象多态性方法筛选电泳条带有差异的样本。 4.筛选的样品连接pMD18-T载体、克隆测序,获得序列样本进行变异位点分析,并构建COI基因系统进化树。 5.利用CODEHOP方法设计AG02和Dcr-2基因的简并引物,以白纹伊蚊雌蚊cDNA为模板克隆目的基因片段,并对测序结果进行生物信息学分析。 6.设计扩增AG02和Dcr-2基因特异性引物,分析不同发育阶段白纹伊蚊AG02和Dcr-2基因的转录水平。 7.乳鼠脑内接种登革2型病毒传代,研磨收集感染病毒乳鼠脑组织上清。 8.用乳鼠病毒上清液感染C6/36细胞繁殖登革2型病毒,并测定病毒滴度。 9.建立经胸腔注射病毒到白纹伊蚊体内的人工感染方法,制备一批感染登革2型病毒的雌性白纹伊蚊。 10.分别在白纹伊蚊羽化后2天(设为对照组)和感染登革2型病毒后第1、3、5、7、9、11、14天提取总RNA,用半定量RT-PCR的方法检测AG02和Dcr-2基因的相对转录水平,用ImageJ图像分析软件计算条带灰度值,收集数据并进行统计学分析。结果： 1.成功克隆不同白纹伊蚊个体COI基因并被TaqI酶切成3个小片段。 2.利用单链构象多态性对采集的白纹伊蚊样本进行筛选,选出13个电泳条带有差异的个体。 3.13条序列克

关键词：白纹伊蚊细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因遗传多态性 RNA干扰 ago2 Dcr-2