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分泌表达结核分枝杆菌ag85b蛋白的重组卡介苗的构建和免疫学特性的初步研究

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分泌表达结核分枝杆菌Ag85B蛋白的重组卡介苗的构建和免疫学特性...

作者：王长永吉林大学

学位级别：硕士

结核病是由结核分枝杆菌引起的以呼吸道传播为主的慢性传染病,结核病被WHO称为唯一的一种全球性紧迫性疾病。据WHO报道,全世界目前约有1?3人口潜伏感染结核杆菌,2005年新增病例约为880万,死亡160万。贫穷、人口增加、流动人口增多、耐... 详细信息

结核病是由结核分枝杆菌引起的以呼吸道传播为主的慢性传染病,结核病被WHO称为唯一的一种全球性紧迫性疾病。据WHO报道,全世界目前约有1?3人口潜伏感染结核杆菌,2005年新增病例约为880万,死亡160万。贫穷、人口增加、流动人口增多、耐药菌株及艾滋病流行等使结核病雪上加霜。我国结核患者数量居世界第二位,我国现有结核感染者4亿人。卡介苗是目前世界上唯一可以应用的预防结核病的疫苗。但卡介苗在不同地区不同人群中存在着差异。卡介苗可以有效预防儿童型结核感染,但不能预防成人型肺结核,其预防作用从0-80%不等。由于bCG预防结核病的不足,以及当前Tb流行的严重性,因此研究新的疫苗用于结核的预防已成为当前国内外研究的热点。本研究主要构建了表达ag85b的重组卡介苗,以弥补传统卡介苗在预防结核病的不足。用分泌表达ag85b蛋白的rbCG和普通bCG分别经皮下免疫bALb/c小鼠,评价各组免疫小鼠的特异性体液免疫和细胞免疫水平。实验结果表明分泌表达ag85b蛋白的rbCG与普通bCG相比可以大量分泌抗原ag85b;长时间免疫后的检测结果表明rbCG比bCG刺激较强的体液免疫应答,但在细胞免疫反应上不是很强。因此,rbCG的免疫保护作用还有待于进一步研究。

关键词：结核杆菌重组卡介苗 ag85b蛋白免疫

牛分枝杆菌与非结核分枝杆菌ag85b蛋白免疫交叉反应的研究

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牛分枝杆菌与非结核分枝杆菌Ag85b蛋白免疫交叉反应的研究

作者：朱婷中国农业科学院

学位级别：硕士

牛结核病（bovine Tuberculosis）是由牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis, ***)引起的一种人畜共患的慢性消耗性传染病，严重阻碍畜牧业的发展和威胁人类的健康。此外，环境中还存在许多非结核分枝杆菌(Nontuberculous Mycobacteriua,... 详细信息

牛结核病（bovine Tuberculosis）是由牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis, ***)引起的一种人畜共患的慢性消耗性传染病，严重阻碍畜牧业的发展和威胁人类的健康。此外，环境中还存在许多非结核分枝杆菌(Nontuberculous Mycobacteriua, NTM)，这些NTM引起的疾病也都呈现结核样症状，对结核分枝杆菌的诊断和治疗造成一定的影响，ag85b蛋白是分枝杆菌培养物中的一种分泌蛋白，是结核分枝杆菌的一种重要的保护性抗原。ag85b蛋白主要存在于牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis，***）、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，***)和NTM（Nontuberculous Mycobacterium,NTM）中，所以研究***与NTM ag85b蛋白免疫交叉反应，对牛结核病的诊断及防治具有重要的意义。本研究分别以***、副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium ***，***）海分枝杆菌(Mycobacterium marinum, ***)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis, ***)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium, ***)2型扩增ag85b基因，分别构建了五种分枝杆菌的原核和真核表达重组质粒。诱导表达五种重组ag85b（rag85b）蛋白，用Ni-His-resin纯化目的蛋白，Western-blot鉴定后免疫小鼠，制备多克隆抗体。构建的五种真核表达重组质粒分别免疫3月龄豚鼠，分离豚鼠的抗血清，以五种rag85b蛋白作为包被抗原，间接ELISA检测五种抗血清之间的交叉反应情况。分离免疫豚鼠的脾淋巴细胞，分别用五种rag85b蛋白进行刺激，测定淋巴细胞增殖情况及IFN-γ的分泌情况。本研究获得了具有较好免疫原性的五种rag85b蛋白，间接ELISA结果表明，五种分枝杆菌ag85b蛋白之间均存在血清学交叉反应，并且每一种分枝杆菌的rag85b蛋白均能够刺激其他各实验组的淋巴细胞增殖和诱导IFN-γ分泌水平的增加，显示***、***、***、***、***的ag85b蛋白之间存在很严重的交叉反应，这将会给ag85b作为牛结核病的候选疫苗的免疫监测造成很大的障碍。因此，如果将ag85b作为牛结核病新型疫苗的组分，应该加上可以鉴别疫苗免疫与自然感染的标记物，这对于疫苗的监测及牛群的净化将具有重要的意义。同时本研究还提示了ag85b对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌还存在交叉保护作用，使得ag85b可以作为一种良好的辅助物，在增强牛结核病疫苗的免疫应答的同时对NTM的感染提供免疫交叉保护效应。

关键词：牛结核分枝杆菌非结核分枝杆菌 ag85b蛋白交叉反应

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结核分枝杆菌ag85b蛋白的重组及表达

中国预防医学杂志 2009年第2期10卷 87-89页

作者：吴刚吕冰孙敏赵秀芹田绿波刘志广王吉顺万康林四川国际旅行卫生保健中心成都610041 辽宁国际旅行卫生保健中心传染病预防控制国家重点实验室中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

目的对结核分枝杆菌ag85b蛋白进行重组表达,初步评价其免疫反应性。方法用PCR方法得到ag85b蛋白的编码基因,构建重组质粒,转化到大肠杆菌bL21中。经IPTG诱导表达,得到高效稳定的表达株,并用蛋白免疫印迹方法检测免疫反应性。结果获得了... 详细信息

目的对结核分枝杆菌ag85b蛋白进行重组表达,初步评价其免疫反应性。方法用PCR方法得到ag85b蛋白的编码基因,构建重组质粒,转化到大肠杆菌bL21中。经IPTG诱导表达,得到高效稳定的表达株,并用蛋白免疫印迹方法检测免疫反应性。结果获得了高效稳定的重组ag85b的表达株,并且重组ag85b有较好的免疫反应性。结论重组ag85b有较好的免疫反应性,为结核病快速诊断研究及新疫苗研究提供了基础。

关键词：结核分枝杆菌 ag85b蛋白克隆表达

结核分支杆菌ag85b蛋白在大肠杆菌中的高效表达

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广东医学 2003年第5期24卷 487-488页

作者：吴雪琼张俊仙郑越张灵霞中国人民解放军第三九医院结核病研究室北京100091

目的　通过结核分支杆菌ag85b基因在大肠杆菌中的表达 ,获得大量纯化的重组ag85b(rag85b)蛋白。方法　应用PCR技术扩增结核分支杆菌H3 7Rvag85bDNA序列 ;以质粒pET2 4b为表达载体 ,构建ag85b重组质粒 ,然后转化大肠杆菌bL2 1(DE3 ) ;以I... 详细信息

目的　通过结核分支杆菌ag85b基因在大肠杆菌中的表达 ,获得大量纯化的重组ag85b(rag85b)蛋白。方法　应用PCR技术扩增结核分支杆菌H3 7Rvag85bDNA序列 ;以质粒pET2 4b为表达载体 ,构建ag85b重组质粒 ,然后转化大肠杆菌bL2 1(DE3 ) ;以IPTG诱导转化子 ,通过SDS -PagE电泳鉴定rag85b的表达水平 ,采用Novagen公司生产的His .bind蛋白纯化试剂盒纯化rag85b蛋白。结果　重组质粒pET2 4b -ag85b测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌bL2 1(DE3 )细胞内以包涵体形式存在 ,表达量占菌体总蛋白的 3 0 %左右。纯化后的rag85b样品经SDS -PagE和光密度扫描分析表明其纯度约为 95 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 10mg左右纯化的重组蛋白。结论　pET2 4b -ag85b大肠杆菌工程菌株能高效表达rag85b蛋白。

关键词：结核分支杆菌 ag85b蛋白大肠杆菌表达

分支杆菌ag85b蛋白对小鼠膀胱癌抑癌效应的研究

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临床泌尿外科杂志 2005年第5期20卷 298-300页

作者：杨登科靳风烁江军张勇第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科重庆400042

目的:探讨分支杆菌ag85b蛋白对小鼠膀胱癌的抑癌效应。方法:采用T739 可移植性膀胱癌模型,于移植瘤处局部注射分支杆菌ag85b蛋白,并用卡介苗(bCG)和生理盐水(NS)作对照,观察治疗后各组的肿瘤重量和存活期。结果:分支杆菌ag85b蛋白治疗... 详细信息

目的:探讨分支杆菌ag85b蛋白对小鼠膀胱癌的抑癌效应。方法:采用T739 可移植性膀胱癌模型,于移植瘤处局部注射分支杆菌ag85b蛋白,并用卡介苗(bCG)和生理盐水(NS)作对照,观察治疗后各组的肿瘤重量和存活期。结果:分支杆菌ag85b蛋白治疗组小鼠肿瘤瘤重(4.12±0.85) g,显著低于NS组(7.01±1.18) g(PbCG组(3.85±1.18) g比较差异无统计学意义(P>0.05),抑瘤率为41.23%;分支杆菌ag85b蛋白治疗组小鼠存活天数为(28.75±2.71) d,显著长于NS组(23.50±2.45) d(PbCG组的(29.63±3.25) d比较差异无统计学意义(P>0.05),存活延长率为22.34%。结论:分支杆菌ag85b蛋白对小鼠膀胱癌具有抑制作用,并能延长膀胱癌荷瘤鼠的生存期。

关键词：分支杆菌 ag85b蛋白膀胱肿瘤抑癌效应

结核分枝杆菌分泌蛋白ag85b的免疫学特性

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第四军医大学学报 2002年第13期23卷 1203-1205页

作者：薛莹李元史皆然师长宏李别虎范雄林柏银兰马文煜第四军医大学基础部微生物学教研室陕西西安710033 第四军医大学西京医院呼吸内科陕西西安710033 第四军医大学实验动物中心陕西西安710033

目的　研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白ag85 b的免疫学特性 .方法　用原核表达的 ag85 b蛋白免疫 bAL b/c小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测 IFN- γ产生水... 详细信息

目的　研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白ag85 b的免疫学特性 .方法　用原核表达的 ag85 b蛋白免疫 bAL b/c小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测 IFN- γ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 ag85 b免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答 ,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞的增殖较显著 . MTT方法检测 ag85 b免疫小鼠的 IFN-γ量为 96 0pg· L- 1 ,而生理盐水对照组的量低于 80 pg· L- 1 .结论　ag85

关键词：结核分枝杆菌结核病结核疫苗 MTT法 ag85b蛋白免疫学

结核分枝杆菌ag85b DNA疫苗免疫效果的初步评价

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中国生物制品学杂志 2022年第12期35卷 1427-1431页

作者：王娜刘琼杨雨欣李慧张炜马国荣陈耀庚万巧凤宁夏医科大学基础医学院病原生物学与免疫学系宁夏银川750004 宁夏医科大学临床医学院宁夏银川750004 宁夏医科大学理学院数学系宁夏银川750004

目的初步评价结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,***)ag85b DNA疫苗的免疫效果。方法对含HSV2-gD信号肽基因和Rv1886c基因(共963 bp核苷酸序列)的重组质粒pcD-sRv1886c进行双酶切和测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒pcD-s Rv1886c... 详细信息

目的初步评价结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,***)ag85b DNA疫苗的免疫效果。方法对含HSV2-gD信号肽基因和Rv1886c基因(共963 bp核苷酸序列)的重组质粒pcD-sRv1886c进行双酶切和测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒pcD-s Rv1886c转染CHO细胞,Western blot法检测CHO细胞培养液中ag85b蛋白的表达情况。将重组质粒pcD-sRv1886c经肌肉注射免疫C57bL/6J小鼠,共免疫2次,间隔14 d,首次免疫后14、28及42 d经小鼠眼眶后静脉丛采血,分离血清,间接ELISA法检测小鼠血清中IgG及IgG1抗体效价;首次免疫后42 d无菌取小鼠脾脏,制成单细胞悬液,流式细胞术检测分泌IFNγ^(+)的CD4^(+)T及CD8+T细胞比例,CCK8法检测脾淋巴细胞增殖情况。结果双酶切和测序鉴定证明重组质粒pcD-sRv1886c构建正确,转染CHO细胞后表达的蛋白可与鼠抗ag85b单克隆抗体发生特异性结合。首次免疫后14 d,重组质粒免疫组小鼠血清中IgG及IgG1特异性抗体效价分别为1∶1720和1∶460,28 d后为1∶5760和1∶2560,42 d后为1∶6080和1∶2720。首次免疫后42 d,重组质粒免疫组和PbS阴性对照组小鼠脾细胞中CD3^(+)CD4^(+)IFNγ^(+)细胞比例分别为(2.03±0.23)%和(0.14±0.02)%,CD3^(+)CD8+IFNγ^(+)细胞比例分别为(1.05±0.08)%和(0.13±0.01)%,差异均有统计学意义(t分别为18.38和11.58,P均bS对照组(1.06),且差异有统计学意义(t=15.66,Pag85b DNA疫苗可有效诱导机体产生体液免疫及细胞免疫效应。

关键词：结核分枝杆菌 DNA疫苗 ag85b蛋白

卡介苗ag85b对小鼠膀胱癌治疗作用及机制的研究

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实用临床医药杂志 2007年第2期11卷 36-38页

作者：张爱莉倪晓辰张伟吴敬河北医科大学第四医院泌尿外科河北石家庄050011

目的探讨卡介苗(bCG)ag85b蛋白对小鼠膀胱癌的抑癌效应及免疫机制。方法采用T739小鼠皮下膀胱癌模型,肿瘤局部皮下注射bCG ag85b蛋白,并用bCG和生理盐水作对照,观察各组的肿瘤重量和存活期,利用ELISA方法检测各组的3种主要细胞因子的水... 详细信息

目的探讨卡介苗(bCG)ag85b蛋白对小鼠膀胱癌的抑癌效应及免疫机制。方法采用T739小鼠皮下膀胱癌模型,肿瘤局部皮下注射bCG ag85b蛋白,并用bCG和生理盐水作对照,观察各组的肿瘤重量和存活期,利用ELISA方法检测各组的3种主要细胞因子的水平,电镜和光镜观察各组肿瘤细胞的坏死和凋亡情况,利用流式细胞技术检测各组肿瘤细胞凋亡和细胞增殖周期。结果bCG ag85b组小鼠肿瘤瘤重显著低于其它两组,其差异有统计学意义(Pag85b组坏死明显增加。细胞增殖指数下降,其差异有统计学意义(PbCG ag85b蛋白对T739小鼠膀胱癌具有抑制作用,并能延长荷瘤鼠的生存期,不论从细胞因子水平和光镜与电镜观察坏死和凋亡情况,还是从细胞凋亡和增殖情况来看ag85b蛋白均优于卡介苗。

关键词：膀胱肿瘤 ag85b蛋白自细胞介素之肿瘤坏死因子-α 干扰素-γ 细胞凋亡细胞增殖指数细胞坏死

结核杆菌H37Ra免疫小鼠后脾淋巴细胞的杀伤活性及免疫机制的研究

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第2期23卷 164-167页

作者：王利娴卢贤瑜李惠阳强重庆医科大学临床免疫学教研室临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室重庆市重点实验室重庆400016

目的探讨结核杆菌H37Ra免疫小鼠后,产生特异性的脾淋巴细胞杀伤活性及其免疫机制。方法(1)分别以结核杆菌H37Ra、bCG和PbS免疫小鼠后第30天及第60天,分离各组小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞,以表达ag85b分泌蛋白的Sp2/0细胞为靶细胞,用MTT... 详细信息

目的探讨结核杆菌H37Ra免疫小鼠后,产生特异性的脾淋巴细胞杀伤活性及其免疫机制。方法(1)分别以结核杆菌H37Ra、bCG和PbS免疫小鼠后第30天及第60天,分离各组小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞,以表达ag85b分泌蛋白的Sp2/0细胞为靶细胞,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的杀伤率;(2)在免疫后第60天,小鼠脾淋巴细胞经PPD刺激后,以RT-PCR法检测穿孔素mRNA及颗粒酶bmRNA的表达。结果(1)结核杆菌H37Ra组脾淋巴细胞的杀伤率明显高于PbS对照组(PbCG组;(2)H37Ra组和bCG组穿孔素、颗粒酶mRNA的表达量均显著高于PbS组(PbCG组(PbmRNA的表达量两组无差异。结论结核杆菌H37Ra免疫小鼠后,能增强脾淋巴细胞的杀伤活性,其机制可能与增加穿孔素、颗粒酶b的表达有关。

关键词：结核杆菌H37Ra ag85b蛋白小鼠淋巴细胞穿孔素颗粒酶b