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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2004年第6期36卷 425-429页

作者： Ji-Hong WANG, Yu WU, Feng REN, Li Lü, and Bao-Chang ZHAO*Department of Biochemistry and Molecular Biology, Dalian Medical University, Dalian 116027, China Department of Biochemistry and Molecular Biology Dalian Medical UniversityDalian 116027 China

adinbitor was cloned from Agkistrodon halys brevicaudus stejneger and characterized as a novel disintegrin. In this study, total RNA was extracted from venom gland and used in RT-PCR to generate a cDNA which is 219 bp long. The sequence encoded a polypeptide composed of 73 amino acids, including 12 cysteines, an RGD motif, and the signature motif of disintergrin. Recombinant adinbitor (radinbitor) was expressed in E. coli and purified by using the His?Bind affinity chromatography. The IC50 for inhibiting human platelet aggregation and bFGF-induced proliferation of ECV304 cells was 6 μΜ and 0.89 μΜ respectively. Furthermore, adinbitor significantly inhibited angiogenesis both in vivo and in vitro. Taken together, these results suggested that adinbitor had typical functions of disintegrins.

关键词： cloning adinbitor disintegrin platelet aggregation angiogenesis

白眉蝮蛇去整合素adinbitor定点突变体的构建及其功能检测

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中国生物制品学杂志 2009年第11期22卷 1057-1062页

作者：胡燕荣刘淑清赵霆田余祥洪艳于丽华崔秀云赵宝昌大连医科大学生物化学与分子生物学教研室辽宁大连116044

目的构建白眉蝮蛇去整合素adinbitor的RIARGD→RPTRGD突变体,研究其主要功能及其作用的分子机制。方法重叠延伸PCR法获得Adinbior定点突变cDNA序列,表达并纯化突变体蛋白。血小板聚集试验检测其对血小板聚集的影响;鸡绒毛尿囊膜模型体... 详细信息

目的构建白眉蝮蛇去整合素adinbitor的RIARGD→RPTRGD突变体,研究其主要功能及其作用的分子机制。方法重叠延伸PCR法获得Adinbior定点突变cDNA序列,表达并纯化突变体蛋白。血小板聚集试验检测其对血小板聚集的影响;鸡绒毛尿囊膜模型体内血管新生试验检测其对血管新生的抑制功能;流式细胞仪检测其对血小板膜受体去整合素αⅡbβ3与CD41结合的影响。结果双酶切、PCR及测序证实突变体构建正确,纯化的突变体蛋白纯度在90%以上。野生型adinbitor可识别αⅡbβ3,竞争性抑制纤维蛋白原与血小板结合,从而发挥抑制血小板聚集的功能;在相同剂量下,突变型adinbitor几乎不具备此功能,而保留了抑制血管新生的功能。结论已成功构建了白眉蝮蛇去整合素adinbitor定点突变体,与野生型adinbitor比较,突变体抑制血小板聚集的功能得到了有效抑制,抑制血管新生功能保持不变,为其今后的功能开发奠定了理论基础。

关键词：去整合素 adinbitor 突变血小板聚集血管新生 αⅡbβ3

adinbitor对小鼠免疫能力、肿瘤生长及转移的影响

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Adinbitor对小鼠免疫能力、肿瘤生长及转移的影响

作者：崔艳花大连医科大学

学位级别：硕士

背景:去整合素(disintegrins)是一类来源于蛇毒蛋白的含有Arg-Gly-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)模体并富含半胱氨酸的小分子量蛋白质。RGD序列可竞争性结合整合素αⅡ b β3、αvβ3、α5β1等受体，从而阻止肿瘤细胞与细胞外基质的粘附... 详细信息

背景:去整合素(disintegrins)是一类来源于蛇毒蛋白的含有Arg-Gly-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)模体并富含半胱氨酸的小分子量蛋白质。RGD序列可竞争性结合整合素αⅡ b β3、αvβ3、α5β1等受体，从而阻止肿瘤细胞与细胞外基质的粘附，诱导肿瘤细胞凋亡;通过阻断整合素-黏着斑激酶途径，抑制肿瘤细胞粘附、增殖、转移和血管新生。adinbitor是从旅顺白眉蝮蛇(Agkistrodon halysbrevicaudus stejneger)毒腺为原料克隆得到的。adinbitor由73个氨基酸残基组成，含有1个去整合素特征性RGD三肽识别序列和12个半胱氨酸残基，相对分子量9kD，是去整合素家族的新成员，可作为多种整合素受体的拮抗剂，具显著抗肿瘤作用。目的：研究adinbitor对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移行为影响，以及对荷瘤小鼠免疫能力、肿瘤生长及转移的作用。方法：1.体外实验：采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测adinbitor对小鼠肝癌H细胞和鼠肝癌高淋巴道转移Hca-F细胞株的增殖抑制作用;采用Transwell小室法检测adinbitor对Hca-F细胞迁移及侵袭的影响。2.体内实验：小鼠H肿瘤模型实验，80只BALB/C小鼠分为口服和腹腔注射两组，每组再分为4个小组，设adinbitor浓度0.5mg/kg、1.25mg/kg和5mg/kg低、中、高三组和对照组，观察并记录小鼠生存状态。给药第15天对全部小鼠眼底取血并处死，测血清中interleukin-18(IL-18)的含量，取瘤体和对照组小鼠颈部组织，对瘤体和颈部组织做病理学分析。建立免疫鼠模型，将20只昆明鼠随机分为实验组和对照组，每组10只。实验组每天口服adinbitor(1.25mg/kg);对照组口服同等剂量的生理盐水，给药7天后对全部小鼠眼底取血并处死，测血清中免疫球蛋白IgG的含量。结果： ***抑制H细胞和Hca-F细胞的增殖，有效抑制Hca-F细胞的迁移和侵袭。 2.在小鼠肝癌模型实验中，adinbitor显著降低血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)和CD34蛋白的表达(Padinbitor中、高剂量给药组可有效提高荷瘤小鼠的生存率。 ***影响小鼠免疫功能的实验结果表明：adinbitor可显著提高小鼠血清中免疫球白IgG的含量(Padinbitor可明显抑制H和Hca-F细胞的增殖，降低其侵袭和迁移能力。 2. adinbitor可通过抑制内皮细胞的增殖，抑制肿瘤血管新生，抑制肿瘤的生长和转移，降低肿瘤恶化程度，延长荷瘤小鼠生存周期。 3. adinbitor抑制肿瘤生长和转移的初步机制：可直接抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭;可激活免疫细胞并刺激其增殖，分泌炎症细胞因子和免疫球蛋白，提高机体免疫功能，抑制血管新生和肿瘤生长。

关键词： adinbitor 去整合素白介素-18 CD34 血管内皮生长因子

重组蛋白adinbitor对人肝癌细胞株SMMC-7721黏附与增殖影响的初步研究

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重组蛋白Adinbitor对人肝癌细胞株SMMC-7721黏附与增殖影响的初步...

作者：赵春玲大连医科大学

学位级别：硕士

目的:恶性肿瘤是严重威胁人类健康、造成人类死亡的主要原因之一。抗癌药物由于其不同程度的毒副作用而成为肿瘤治疗的一大主要障碍。利用新的靶点来寻找高效低毒的新型抗癌药物仍是当务之急。信号转导阻滞剂和细胞凋亡诱导剂都是新的... 详细信息

目的:恶性肿瘤是严重威胁人类健康、造成人类死亡的主要原因之一。抗癌药物由于其不同程度的毒副作用而成为肿瘤治疗的一大主要障碍。利用新的靶点来寻找高效低毒的新型抗癌药物仍是当务之急。信号转导阻滞剂和细胞凋亡诱导剂都是新的研究领域。肿瘤细胞的黏附性在恶性肿瘤转移中起着极为重要的作用,而细胞黏附于细胞外基质是细胞生存与增殖的基础,有赖于细胞表面的黏附分子尤其是整合蛋白介导的黏附信号的转导。因此,阻断肿瘤细胞的黏附,防止肿瘤细胞定植,是发展抗癌药物的一个重要策略。含RGD模体的多肽,包括蛇毒去整合素的阻断瘤细胞与基质的黏附,从而发挥抗肿瘤转移的作用,引起了人们的关注。可溶性的RGD肽(soluble RGD peptide, sRGD)还能促使许多类型的细胞凋亡。为研究本实验室基因重组的RGD 肽—adinbitor对肿瘤细胞的作用,本实验应用体外细胞培养技术,模拟体内环境,用纤连蛋白(fibronectin, FN)预刺激人肝癌细胞株SMMC-7721,旨在观察adinbitor对SMMC-7721细胞黏附的影响。另外还初步研究了adinbitor对SMMC-7721细胞生长增殖及诱导凋亡的作用,为adinbitor抗肿瘤的作用机制提供实验依据。方法:实验分为两部分:(1)检测adinbitor对SMMC-7721细胞黏附的影响。以细胞黏附实验观察纤连蛋白FN基质对SMMC-7721细胞的黏附影响;分别采用结晶紫染色法和MTT比色法测定重组蛋白

关键词： adinbitor 黏附增殖细胞凋亡

adinbitor对人胃癌MGC803细胞增殖及凋亡的作用

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实用癌症杂志 2009年第3期24卷 233-236页

作者：徐跃飞任凤赵宝昌大连医科大学生物化学与分子生物学教研室 116044

目的探讨adinbitor对人胃癌MGC803细胞生长及凋亡的作用。方法应用adinbitor作用于体外培养的人胃癌MGC803细胞,采用MTT比色法分析其对MGC803细胞生长的影响;采用相差显微镜、苏木精-伊红(HE)和Hoechst染色观察不同浓度的adinbitor诱导M... 详细信息

目的探讨adinbitor对人胃癌MGC803细胞生长及凋亡的作用。方法应用adinbitor作用于体外培养的人胃癌MGC803细胞,采用MTT比色法分析其对MGC803细胞生长的影响;采用相差显微镜、苏木精-伊红(HE)和Hoechst染色观察不同浓度的adinbitor诱导MGC803细胞凋亡的形态变化。结果adinbitor可呈剂量依赖性方式抑制MGC803细胞的增殖,其抑制MGC803细胞增殖的ID50为3.52μmol/L。Adinbito诱导的MGC803细胞凋亡实验,显示出细胞凋亡的典型的形态学特征,如胞间连丝消失,细胞皱缩成团,胞内出现空泡等现象,而且随adinbitor浓度的增加,凋亡现象越明显。结论adinbitor对人胃癌MGC803细胞生长具有抑制作用,其机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关。

关键词： adinbitor 胃癌细胞增殖细胞凋亡

adinbitor对B16黑色素瘤细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响

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实用癌症杂志 2010年第5期25卷 447-449,456页

作者：徐跃飞任凤赵宝昌大连医科大学生物化学与分子生物学教研室 116044

目的探讨adinbitor对B16黑色素瘤细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响。方法 MTT法检测adinbitor对B16黑色素瘤细胞增殖的影响;双苯并咪唑(Hoechst33258,Ho)染色法观察adinbitor作用于B16黑色素瘤细胞后细胞形态的改变;结晶紫染色法和聚碳... 详细信息

目的探讨adinbitor对B16黑色素瘤细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响。方法 MTT法检测adinbitor对B16黑色素瘤细胞增殖的影响;双苯并咪唑(Hoechst33258,Ho)染色法观察adinbitor作用于B16黑色素瘤细胞后细胞形态的改变;结晶紫染色法和聚碳酸酯膜浸润试验观察其对黑色素瘤细胞体外黏附以及迁移的影响。结果 adinbitor可呈剂量依赖性方式抑制B16黑色素瘤细胞的增殖,其抑制B16黑色素瘤细胞增殖的ID50为2.68μmol/L。adinbitor可明显诱导黑色素瘤细胞凋亡,并且剂量依赖性地抑制瘤细胞的黏附和迁移(Padinbitor在体外能够显著降低黑色素瘤细胞的黏附及迁移能力,有效地抑制黑色素瘤细胞的增殖,同时促进细胞凋亡。

关键词： adinbitor 黑色素瘤增殖凋亡迁移

白眉蝮蛇去整合素radinbitor对人肝癌细胞系SMMC-7721细胞黏附与增殖的影响

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中国癌症杂志 2006年第11期16卷 958-963页

作者：赵春玲崔秀云王继红吴毓任凤赵宝昌大连医科大学生物化学与分子生物学教研室辽宁大连116027

背景与目的:蛇毒去整合素是一类从多种蛇毒和水蛭中分离到的含RGD(Arg-Gly-Asp)或KGD(Lys-Gly-Asp)模体的小分子蛋白质,其由于能竞争性地结合细胞表面的整合蛋白受体,阻断肿瘤细胞与细胞外基质的黏附,从而发挥抗肿瘤转移的作用。rAdinbi... 详细信息

背景与目的:蛇毒去整合素是一类从多种蛇毒和水蛭中分离到的含RGD(Arg-Gly-Asp)或KGD(Lys-Gly-Asp)模体的小分子蛋白质,其由于能竞争性地结合细胞表面的整合蛋白受体,阻断肿瘤细胞与细胞外基质的黏附,从而发挥抗肿瘤转移的作用。radinbitor是我实验室采用基因克隆方法从大连产白眉蝮蛇(Gloydiusblomhoffibrevicaudus)的毒腺中获得的一种含有RGD模体的去整合素。本实验的目的是探讨radinbitor对人肝癌细胞系SMMC-7721黏附、增殖的抑制作用,为radinbitor抗肿瘤转移的作用机制提供实验依据。方法:以细胞黏附实验观察纤连蛋白(FN)基质对SMMC-7721细胞黏附的影响。分别采用结晶紫染色法和MTT比色法测定重组蛋白rAd-inbitor对SMMC-7721向FN黏附的影响,及对已黏附于FN上的SMMC-7721的影响。以MTT比色法检测不同浓度的radinbitor对SMMC-7721细胞增殖的影响;HE染色观察200μg/mladinbitor诱导SMMC-7721细胞36h凋亡的形态变化;采用流式细胞仪检测radinbitor对细胞凋亡的诱导作用。结果:①radinbitor对SMMC-7721细胞在FN基质上的黏附有一定的抑制作用,并呈浓度依赖关系,25、50、100、200μg/ml浓度组radinbitor的黏附抑制率分别为4.90%、11.73%、22.84%、37.28%,各组差异有显著性(Padinbitor作用后,已黏附的SMMC-7721细胞变圆、脱落,各浓度组黏附细胞的存活率的平均值分别为98.89%、90.01%、63.37%、35.13%,细胞的增殖受到明显抑制(Padinbitor对SMMC-7721细胞的增殖具有较强的抑制作用,且随着药物浓度的增加,其抑制作用增强(Padinbitor对SMMC-7721细胞作用48h的IC50值为177.83μg/ml。④200μg/mlrAd-inbitor作用SMMC-7721细胞36h呈现早期细胞凋亡的形态改变,凋亡率达20.68%,明显高于未经处理的对照组的2.38%(Padinbitor能够剂量依赖性地抑制SMMC-7721细胞在FN上的黏附,并促使已黏附的SMMC-7721细胞脱落,剂量依赖性抑制SMMC-7721细胞增殖并诱导其凋亡。

关键词： adinbitor 去整合素肝癌黏附增殖凋亡