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Single-nucleotide editing for zebra3 and wsl5 phenotypes in rice using CRISPR/Cas9-mediated adenine base editors

aBIOTECH 2020年第2期1卷 106-118页

作者： Kutubuddin A.Molla Justin Shih Yinong Yang Department of Plant Pathology and Environmental Microbiology and the Huck Institute of the Life Sciences The Pennsylvania State UniversityUniversity ParkPA 16802USA ICAR-National Rice Research Institute Cuttack 753006India

The CRISPR/Cas9-mediated base editing technology can efficiently generate point mutations in the genome without introducing a double-strand break(DSB)or supplying a DNA donor template for homology-directed repair(HDR).In this study,adenine base editors(ABEs)were used for rapid generation of precise point mutations in two distinct genes,OsWSL5,and OsZEBRA3(Z3),in both rice protoplasts and regenerated *** precisely engineered point mutations were stably inherited to subsequent *** single nucleotide alterations resulted in single amino acid changes and associated wsl5 and z3 phenotypes as evidenced by white stripe leaf and light green/dark green leaf pattern,*** selfing and genetic segregation,transgene-free,base edited wsl5 and z3 mutants were obtained in a short period of *** noticed a novel mutation(V540A)in Z3 locus could also mimic the phenotype of Z3 mutation(S542P).Furthermore,we observed unexpected non-A/G or T/C mutations in the ABE editing window in a few of the edited *** ABE vectors and the method from this study could be used to simultaneously generate point mutations in multiple target genes in a single transformation and serve as a useful base editing tool for crop improvement as well as basic studies in plant biology.

关键词： adenine base editor CRISPR/Cas9 genome editing Plant base editing Precise point mutation Transgene-free rice

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CRISPR base editing and prime editing:DSB and template-free editing systems for bacteria and plants

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Synthetic and Systems Biotechnology 2020年第4期5卷 277-292页

作者： Abdullah Zhengzheng Jiang Xulin Hong Shun Zhang Ruilian Yao Yi Xiao State Key Laboratory of Microbial Metabolism School of Life Sciences and BiotechnologyShanghai Jiao Tong UniversityShanghai200240China Joint International Research Laboratory of Metabolic&Developmental Sciences Shanghai Jiao Tong UniversityShanghai200240China

CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated)has been extensively exploited as a genetic tool for genome *** RNA guided Cas nucleases generate DNA doublestrand break(DSB),triggering cellular repair systems mainly Non-homologous end-joining(NHEJ,imprecise repair)or Homology-directed repair(HDR,precise repair).However,DSB typically leads to unexpected DNA changes and lethality in some *** establishment of bacteria and plants into major bio-production platforms require efficient and precise editing ***,in this review,we focus on the non-DSB and template-free genome editing,i.e.,base editing(BE)and prime editing(PE)in bacteria and *** first highlight the development of base and prime editors and summarize their studies in bacteria and *** then discuss current and future applications of BE/PE in synthetic biology,crop improvement,evolutionary engineering,and metabolic ***,we critically consider the challenges and prospects of BE/PE in PAM specificity,editing efficiency,off-targeting,sequence specification,and editing window.

关键词： CRISPR base editing Prime editing Cytosine base editor adenine base editor

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Precise genome editing with base editors

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Medical Review 2023年第1期3卷 75-84页

作者： Hongcai Liu Yao Zhu Minjie Li Zhimin Gu Institute of Systems Medicine Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical CollegeBeijingChina Suzhou Institute of Systems Medicine SuzhouJiangsu ProvinceChina Institute of Systems Medicine Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical CollegeBeijing 100005China Suzhou Institute of Systems Medicine Suzhou 215123Jiangsu ProvinceChina

Single-nucleotide variants account for about half of known pathogenic genetic variants in *** editing strategies by reversing pathogenic point mutations with minimum side effects have great therapeutic potential and are now being actively *** emerge of precise and effcient genome editing strategies such as base editing and prime editing provide powerful tools for nucleotide conversion without inducing double-stranded DNA breaks(DSBs),which have shown great potential for curing genetic disorders.A diverse toolkit of base editors has been devel-oped to improve the editing effciency and accuracy in different context of ***,we summarized the evolving of base editors(BEs),their limitations and future perspective of base editing-based therapeutic strategies.

关键词： adenine base editor base editing clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein cytosine base editor

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甘蓝型油菜抗裂角突变体的评价和ABE单碱基编辑工具的建立

甘蓝型油菜抗裂角突变体的评价和ABE单碱基编辑工具的建立

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作者：许磊华中农业大学

学位级别：硕士

油菜是世界三大主要油料作物之一,同时也是我国最主要的食用植物油来源。油菜收获时由于角果很易开裂,通常会导致产量的很大损失,是目前油菜机械化收获的主要限制因素之一。因此,培育出具有适宜抗裂能力的油菜品种对推动油菜的机械化生... 详细信息

油菜是世界三大主要油料作物之一,同时也是我国最主要的食用植物油来源。油菜收获时由于角果很易开裂,通常会导致产量的很大损失,是目前油菜机械化收获的主要限制因素之一。因此,培育出具有适宜抗裂能力的油菜品种对推动油菜的机械化生产、保障油菜的高产和稳产具有重要意义。本实验室前期已经通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在甘蓝型油菜中创建了BnaIND、BnaSHP1、BnaSHP2、BnaCEL6和BnaMAN7等抗裂角相关基因的突变体。在此基础上,本研究对这些突变体进行田间农艺性状的考察和抗裂能力的测定,评价其实际应用价值;同时,初步解析它们在甘蓝型油菜中参与抗裂角调控的机制。以外,本研究还首次在甘蓝型油菜中建立了有效的ABE单碱基编辑体系。本文主要研究结果如下:1.生物信息分析表明BnaIND的两个拷贝和拟南芥AtIND编码的蛋白高度同源,均具有b HLH保守结构域;BnaSHP基因家族的蛋白都包含MADS-box和K-box保守结构域。这两个保守结构域是其作为转录因子调节下游基因的重要基础;BnaCEL6和BnaMAN7这两个基因编码的是纤维素酶和半纤维素酶,这两种酶蛋白功能保守,其氨基酸序列同源性很高。2.对各抗裂候选基因的纯合突变体进行农艺性状考察以及抗裂系数的测定。结果发现BnaIND的A03拷贝单突和双拷贝突变体均表现出显著的抗裂性,除了角果长和每角粒数外其他农艺性状如株高、千粒重、有效分枝数、第一分枝高和主花序长等均无显著变化;BnaSHP1的五拷贝纯合突变体也表现出显著的抗裂能力,BnaSHP2突变后抗裂能力无明显变化;它们的主要农艺性状均无显著变化;BnaCEL6和BnaMAN7的突变体抗裂能力无明显变化。3.对BnaIND的启动子进行序列比对发现,仅***拷贝的启动子中具有与AtIND相似的400bp保守结构域。进一步通过启动子截短实验和双荧光素酶报告实验证实该保守结构域对上调该基因的表达具有重要作用。4.为了创建甘蓝型油菜ABE单碱基编辑体系,我们改造了4个ABE骨架,分别针对BnaPDS、BnaALS、BnaCLV3、BnaCLV2、BnaTT12、BnaCRTISO、BnaDET2、BnaBRC1和BnaZEP等9个基因设计了18个sgRNA进行不同ABE系统的效率测试。结果发现,pBGE17的编辑效率最高,平均编辑效率为3.51%;编辑窗口在A5到A8之间。在此基础上,进一步开发了识别NGPAM的ABEmax-n Cas9NG系统;测试结果证实可以在甘蓝型油菜中实现ABE编辑,其效率达到1.22%。综上所述,本研究通过对甘蓝型油菜中的BnaIND、BnaSHP1、BnaSHP2、BnaCEL6和BnaMAN7等基因突变体进行抗裂角能力测定和综合农艺性状评价,筛选出具有抗裂角的优异资源。同时,对BnaIND的重要启动子调控元件进行了初步分析,为解析该基因的功能分化奠定了基础。此外,本研究首次在甘蓝型油菜中创建了有效的ABE单碱基编辑系统,为油菜种质资源创新提供了精准的编辑工具。

关键词：甘蓝型油菜抗裂角 CRISPR/Cas9 启动子 adenine base editor 作物改良

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针对G6PC3缺乏症胚胎水平的基因编辑治疗研究

针对G6PC3缺乏症胚胎水平的基因编辑治疗研究

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作者：洪嫚贵州大学

学位级别：硕士

如何治愈并防止单基因遗传病传递给后代,实现这部分夫妻孕育健康后代的梦想,是目前亟待解决的问题,这需要在生殖细胞水平进行基因编辑治疗。G6PC3基因作为重型先天性中性粒细胞减少症（Severe Congenital Neutropenia Type 4,SCN4）的... 详细信息

如何治愈并防止单基因遗传病传递给后代,实现这部分夫妻孕育健康后代的梦想,是目前亟待解决的问题,这需要在生殖细胞水平进行基因编辑治疗。G6PC3基因作为重型先天性中性粒细胞减少症（Severe Congenital Neutropenia Type 4,SCN4）的一大致病基因,其突变形式以单个碱基突变为主,可用于研究碱基编辑对遗传病治疗的效果。该病会导致中性粒细胞减少和功能障碍,患病儿童会发生严重的感染、严重者可累及心脏、泌尿、生殖系统异常等。碱基编辑技术是一种治疗遗传病的新兴方法,可通过碱基编辑工具对致病突变进行校正,从而恢复其编码蛋白的正常功能,达到治疗遗传病的目的。其中,规律成簇的间隔短回文重复及其相关蛋白核酸内切酶系统（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins,CRISPR/Cas）为第三代碱基编辑技术,被广泛地应用于生物学研究。尤其是基于CRISPR/Cas系统开发的单碱基编辑器（base editors,BEs）更是应用在单个碱基的精准编辑上。它可通过Cas9切口酶和相应脱氨酶对特定的碱基进行编辑,在不诱导DNA双链断裂的情况下介导嘧啶到嘧啶,嘌呤到嘌呤之间的转换,达到基因编辑的目的。虽然碱基编辑技术距离临床应用还有一定距离,但其已被广泛应用于培育良种、构建疾病模型等方面。我们在临床上发现了一例SCN4患者,经采集全血基因检测后发现患者存在两处杂合变异:c.295C>T,将谷氨酰胺转化为终止密码子;c.766-768del,导致氨基酸改变p.256-256del（缺失）。两种碱基突变分别来自患者父母。本研究对G6PC3基因突变所致SCN4患儿及其父母进行了临床特征及基因检测,利用CRISPR/Cas9技术构建了含该G6PC3基因突变的细胞系作为细胞模型,并基于患者父亲存在的单碱基突变的精细胞用于突变胚胎的构建,采用单碱基编辑器在细胞层面和胚胎水平纠正致病基因,探究细胞系及胚胎纠正的效果及安全性。研究结果如下:（1）采用CRISPR/Cas9和体外模板构建HEK293T突变细胞系:应用Cas9及ss ODN瞬转,成功构建了两株293突变细胞系;（2）采用ABE7.10和sg RNA在293突变细胞系中校正突变:根据突变碱基位点,设计了三个不同的Re-sg RNA,3个Re-sg RNA（A13、A8、A1）在突变位点的编辑效率分别为14.99%、19.56%和8.97%;在细胞中,ABE7.10编辑器除了对目标位点进行编辑以外,还在其附近进行了非靶位点的编辑。（3）采用ABE7.10校正致病胚胎:对18个胚胎进行编辑,共获得16个完全纠正的胚胎,校正效率达到了88.89%;同时,除了理想的校正外,在非靶位点上也检测到了明显的编辑现象,有44.44%的胚胎由无义突变转变成了错义突变,所编码的氨基酸从苯丙氨酸转换为脯氨酸或者亮氨酸。（4）采用深度测序对胚胎潜在脱靶位点进行脱靶分析:使用深度测序对4个sg RNA的32个潜在脱靶序列进行检测,共计检测了61个位点。除OTS11G5以外,其余的转换效率均低于0.5%。通过上述研究我们建立了一种新的基于人类致病胚胎的碱基纠正策略。它具有有效性、精确性和安全性。值得注意的是,使用的编辑工具受限于PAM位点,设计的两个sg RNA包含的目标位点均未在编辑窗口中,而且,还产生了一定的副产物,造成了编码氨基酸的改变,可能同样会影响该基因的功能。理论上这些限制可以通过使用基于新的Cas变体的碱基编辑器来规避,使绝大多数致病性突变具有靶向性。后续将尝试采用现有开发的编辑器变体或者不受PAM位点限制且精确地编辑碱基编辑器。本研究是ABE7.10介导SCN4治疗的首个案例,该策略不仅为治疗SCN4疾病,而且还为其他遗传病的治疗提供了一种新的思路。

关键词： G6PC3 CRISPR/Cas9技术 adenine base editor 致病胚胎

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