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附睾头中自噬核心蛋白atg5对附睾功能和精子活力影响的研究

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附睾头中自噬核心蛋白ATG5对附睾功能和精子活力影响的研究

作者：张雪娣广东工业大学

学位级别：硕士

过去一百年来,全球范围出现了男性精子数目及质量的大幅下滑,使男性不育的问题日益严重,成为威胁人口安全的重大问题。附睾是精子成熟和获能的重要部位,深入了解附睾功能及精子在附睾中的成熟机制,对改善精子质量、解决男性不育问题至... 详细信息

过去一百年来,全球范围出现了男性精子数目及质量的大幅下滑,使男性不育的问题日益严重,成为威胁人口安全的重大问题。附睾是精子成熟和获能的重要部位,深入了解附睾功能及精子在附睾中的成熟机制,对改善精子质量、解决男性不育问题至关重要。自噬,一种进化保守的溶酶体分解代谢过程,可降解和循环机体中损伤的细胞成分以及外侵的细菌或病毒,对于哺乳动物的生殖发育过程至关重要。自噬机制存在于睾丸、附睾及精子中,参与睾丸和附睾生理功能的维持、精子的发生过程以及调节精子细胞的活力和流动性。睾丸中自噬过程受阻可导致精子发生障碍及不育,但是自噬在附睾中的功能研究寥寥无几,因此本课题通过附睾头4-5段主细胞中atg5特异性敲除模型小鼠来研究附睾中的自噬过程对生殖系统的影响,尤其是对精子的成熟过程的影响,为附睾中精子成熟的精微调控机制奠定一定的基础,也可为治疗男性不育提供新的治疗靶点,具有重要的临床意义。目的:探讨自噬蛋白atg5在维持附睾生理功能及精子的成熟过程中发挥的作用。方法:(1)利用Cre-lox P技术构建附睾头4-5段主细胞中atg5特异性敲除模型鼠,并通过Western Blot、PCR、QPCR、免疫荧光等实验技术验证atg5的敲除;(2)通过Western Blot技术检测附睾头4-5段自噬流的变化;(3)通过蛋白组学检测普通饲料喂养条件下,小鼠附睾头4-5段蛋白的变化;(4)通过HE染色,观察模型鼠附睾头4-5段组织形态的变化;(5)普通饲料喂养条件下,利用精子活力测量仪,检测14-15周龄小鼠的精子质量的各项基本指标(精子活力、精子数目、精子的运动速率等)及通过合笼实验评估小鼠的生育能力;(6)自然衰老条件下,利用精子活力测量仪检测精子质量的各项基本指标,评估附睾头4-5段atg5的缺失对精子质量的影响;(7)雄激素与其受体结合受阻的条件下,通过Western Blot检测附睾头4-5段的自噬流水平以及利用精子测量仪检测精子质量的各项基本指标。结果:(1)附睾头4-5段主细胞中atg5特异性敲除模型鼠构建成功,小鼠模型各组包括野生型小鼠(atg5)、杂合敲除基因型小鼠(atg5)以及纯合敲除小鼠(atg5)。(2)与对照组、杂合敲除组相比,纯合敲除组小鼠中,附睾头4-5段主细胞atg5特异性敲除后,自噬标记蛋白LC3-Ⅰ以及p62积累,自噬过程成功阻断。(3)普通饲料喂养条件下,附睾头4-5段atg5特异性敲除后,其敲除段的组织形态没有变化;(4)普通饲料喂养条件下,附睾头4-5段atg5的缺失对小鼠的生育能力(精子活力、精子数目、精子直线运动速率、精子曲线运动速率、精子平均运动速率、致孕率、产仔数等)没有影响。(5)普通饲料喂养条件下,与野生型小鼠相比,纯合敲除鼠中附睾头4-5段有31个蛋白的表达量显著上调以及有22个蛋白的表达量显著下调(差异倍数>2倍)。上调蛋白中有蛋白功能与不依赖于atg5的自噬通路相关,推测可能存在潜在的其它自噬通路补偿。(6)自然衰老的条件下,附睾头4-5段atg5的缺失对小鼠的精子质量没有影响。(7)在睾酮与受体结合阻断的条件下,在atg5小鼠中精子的某些指标发生了显著变化。但是,在附睾头4-5段均未检测到自噬流的显著变化,推测可能是附睾头4-5段组织相对较小,总蛋白量相对较低,通过Western Blot技术并不一定能精确的检测到自噬流的变化;再者是否可以检测到自噬流水平的变化与氟他胺和西米替丁的药效、自噬通路产生应激信号的时间以及作用时间长度相关,后期需进一步优化给药剂量、给药时间以及给药后取材的时间点。结论:在正常条件下(无外界刺激),atg5特异性敲除导致附睾头4-5段的自噬过程阻断后,可能激活了不依赖于atg5的自噬通路,从而维持了小鼠附睾头正常的生理功能以及使精子成熟过程不受影响。此后,还需要更多的研究来准确定义自噬(尤其atg5)在附睾及精子成熟中发挥的作用。

关键词：自噬附睾精子 atg5

肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠脊髓中自噬相关基因atg5表达降低

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中国组织化学与细胞化学杂志 2016年第2期25卷 107-111页

作者：刘永新管英俊陈燕春王巧真接琳琳周风华张皓云卢强潍坊医学院组织学与胚胎学教研室潍坊261053 潍坊医学院人体解剖学教研室潍坊261053 潍坊医学院病理学教研室潍坊261053

目的明确自噬相关基因atg5在肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)转基因鼠脊髓中的表达情况.方法取95d、108d和122d ALS转基因小鼠和野生型小鼠脊髓,应用免疫荧光、Western blot和RT-PCR技术,检测atg5在脊髓中的表达.... 详细信息

目的明确自噬相关基因atg5在肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)转基因鼠脊髓中的表达情况.方法取95d、108d和122d ALS转基因小鼠和野生型小鼠脊髓,应用免疫荧光、Western blot和RT-PCR技术,检测atg5在脊髓中的表达.结果免疫荧光染色检测显示,在脊髓内,atg5免疫反应产物主要定位于神经元;与同窝野生型小鼠比较,脊髓内atg5免疫反应性在95d转基因小鼠无明显差异,而在108d和122d转基因小鼠明显降低.Western blot和RT-PCR分析显示,与同窝野生型小鼠比较,脊髓内atg5 mRNA和蛋白表达水平在95d无明显变化,但在108d和122d时,转基因小鼠脊髓内atg5 mRNA和蛋白表达均显著低于同窝野生型小鼠.结论atg5在ALS转基因鼠脊髓中表达降低,提示atg5表达异常与ALS发生密切相关.

关键词：肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠自噬 atg5 脊髓

基于自噬探讨健脾益肠散对溃疡性结肠炎模型大鼠肠黏膜保护的作用机制

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中药新药与临床药理 2024年第6期35卷 814-821页

作者：刘琴周赛男刘杰民蔺晓源湖南中医药大学第一附属医院湖南长沙410007 贵州省人民医院贵州贵阳550002

目的通过观察健脾益肠散对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠自噬相关分子表达的影响,探讨其肠黏膜保护的作用机制。方法将SD大鼠随机分为正常组、模型组、健脾益肠散组和柳氮磺吡啶组。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)-乙醇溶液复合法建立溃疡性... 详细信息

目的通过观察健脾益肠散对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠自噬相关分子表达的影响,探讨其肠黏膜保护的作用机制。方法将SD大鼠随机分为正常组、模型组、健脾益肠散组和柳氮磺吡啶组。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)-乙醇溶液复合法建立溃疡性结肠炎大鼠模型;模型复制成功后灌胃给药,每日1次,持续14 d。观察大鼠一般状况,计算疾病活动指数(DAI)评分;苏木素-伊红(HE)染色法观察结肠组织病理形态;透射电镜观察结肠上皮细胞自噬情况;免疫荧光染色法、蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测结肠组织肌球蛋白样BCL2结合蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测自噬蛋白5(atg5)、自噬蛋白7(atg7)、泛素结合蛋白62(p62)mRNA表达。结果与正常组比较,模型组一般情况较差,DAI评分明显升高(Patg5、atg7 mRNA表达明显降低(Patg5、atg7 mRNA表达明显升高(Patg5及atg7的表达,下调p62的表达,增强自噬以达到保护溃疡性结肠炎模型大鼠结肠黏膜损伤的作用。

关键词：健脾益肠散溃疡性结肠炎自噬 Beclin1 LC3 atg5 atg7 p62 大鼠

Beclin1和atg5在急性白血病中的表达及其临床意义

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Beclin1和Atg5在急性白血病中的表达及其临床意义

作者：王嘉敏河北医科大学

学位级别：硕士

目的：检测人急性白血病（AL）骨髓单个核细胞（BMMNC）中自噬相关基因Beclin1和atg5的表达，探讨其表达水平在急性白血病中的临床意义,为进一步探讨Beclin1和atg5在白血病发病中的分子机制奠定基础，同时为把Beclin1和atg5作为靶基因... 详细信息

目的：检测人急性白血病（AL）骨髓单个核细胞（BMMNC）中自噬相关基因Beclin1和atg5的表达，探讨其表达水平在急性白血病中的临床意义,为进一步探讨Beclin1和atg5在白血病发病中的分子机制奠定基础，同时为把Beclin1和atg5作为靶基因治疗白血病提供理论依据。方法：采用荧光定量RT-PCR方法检测45例急性髓系白血病（AML，15例低危组、15例中危组和15例高危组）、30例急性淋巴细胞白血病（ALL，15例标危组和15例高危组）和15例正常人骨髓单个核细胞中Beclin1和atg5mRNA的表达水平。同时应用Pearson相关分析检测这两个指标在正常单个核细胞与白血病单个核细胞中表达的相关性，P＜0.05有统计学意义。结果： 1荧光定量RT-PCR检测Beclin1mRNA的表达 Beclin1在正常对照组的相对表达量是（1.2264±0.0582），在急性髓系白血病低危组、中危组、高危组的相对表达量分别是（1.0847±0.0765）、（0.8352±0.0411）和（0.7656±0.0464）,在急性淋巴细胞白血病标危组和高危组的相对表达量分别是（11.0577±0.0676）和（1.8099±0.0588）。各组之间的差异有统计学意义（P＜0.01）。 2荧光定量RT-PCR检测atg5mRNA的表达 atg5在正常对照组的相对表达量是（0.6353±0.0474），在急性髓系白血病低危组、中危组、高危组的相对表达量分别是（0.5410±0.0355）、（0.4592±0.0410）和（0.3610±0.0480）,在急性淋巴细胞白血病标危组和高危组的相对表达量分别是（6.3728±0.0490）和（0.6211±0.0343）。其中急性淋巴细胞白血病高危组和正常对照组比较差异无统计学意义（P=0.37＞0.05），其余各组之间差异均有统计学意义（P＜0.01）。 3Beclin1和atg5之间的相关关系在正常对照组、急性髓系白血病组和急性淋巴细胞白血病组，Beclin1和atg5mRNA的表达水平之间的Pearson相关系数r分别为0.97、0.84、0.89（P＜0.01）,有统计学意义。结论： 1正常对照者和白血病患者骨髓单个核细胞中自噬相关基因Beclin1和atg5mRNA均有表达，提示细胞自噬现象普遍存在于正常细胞和病态细胞中，然而在不同细胞类型中其表达量不同，表明自噬活性的不同在不同类型的白血病的发生、发展中发挥不同的作用。 2在急性髓系白血病中，Beclin1的相对表达量均低于正常对照组，即Beclin1在急性髓系白血病中是低表达的，并且随着白血病危险度级别的增加，Beclin1的表达水平降低更为明显;在急性淋巴细胞白血病高危组合和低危组中Beclin1的相对表达量均高于正常对照组，虽然随着白血病危险度级别的增加其表达水平更是明显降低，但是仍高于正常对照组的表达水平。 3在急性髓系白血病中atg5的相对表达量均低于正常对照组，即atg5在急性髓系白血病中是低表达的，同时随着白血病危险度级别的增加，atg5的表达水平降低更为明显;在急性淋巴细胞白血病标危组中，atg5的相对表达量高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），但在急性淋巴细胞白血病高危组，atg5的相对表达量与正常对照组比较差异无统计学意义（P=0.37＞0.01），同样atg5的相对表达量在急性淋巴细胞白血病中随着白血病危险度级别的增加，其表达水平明显降低。 4自噬相关基因Beclin1mRNA和atg5mRNA在正常对照组、急性髓系白血病组和急性淋巴细胞白血病组的表达水平均存在相关性，且为正相关关系。提示在细胞自噬过程中，Beclin1和atg5是参与自噬的重要基因，它们的一致表达，共同调节着自噬体形成及成熟过程的不同阶段，可能与白血病的发生、发展，甚至复发耐药相关。

关键词：急性白血病自噬 Beclin1 atg5 RT-PCR

成年小鼠不同生殖时期子宫颈组织中脂滴和自噬体PPAR、LC3和atg5基因表达特点及其分布规律的研究

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成年小鼠不同生殖时期子宫颈组织中脂滴和自噬体PPAR、LC3和Atg5...

作者：李刘慧山东农业大学

学位级别：硕士

脂类是生命中必不可少的营养成分,在不同条件下细胞内脂类的代谢状况影响着组织器官的生理功能。脂类的合成、修饰与分解受到多种因素的影响,例如能量供应变化、细胞膜完整性、信号分子的转导、激素及细胞因子的调控以及外界环境的改变... 详细信息

脂类是生命中必不可少的营养成分,在不同条件下细胞内脂类的代谢状况影响着组织器官的生理功能。脂类的合成、修饰与分解受到多种因素的影响,例如能量供应变化、细胞膜完整性、信号分子的转导、激素及细胞因子的调控以及外界环境的改变等。由于脂质代谢中多余的脂肪酸(FAs)对细胞是有害的,脂质的相对稳定性对细胞生存至关重要。为了预防脂类中毒,细胞会将多余的脂肪酸转移到中性脂质中,储存在被叫做脂滴(LD)的细胞器中。这种细胞器不仅是脂质和能量的存储库,而且还参与蛋白质信号传导与转运、某些激素的合成、膜的生物合成和胆固醇的稳定性等。近年来,脂滴生物学研究的焦点之一是噬脂体对脂滴内脂质代谢的调节上。自噬体作为多功能细胞器,在维持细胞内稳态起着非常重要的作用,它主要起着细胞内“清道夫”作用,可以清理胞质内被分解的蛋白质、衰老的细胞器和进入的病原体等。子宫颈是妊娠期间保胎的门户和分娩时胎儿产出的必经之路,其收缩与开张是主动耗能的过程。子宫颈的关闭与开张是否正常直接影响妊娠和分娩。但是,小鼠子宫颈的能量来源是否与脂滴及自噬体调节有一定的关系,目前鲜有报道。本文为了探索小鼠子宫颈组织中脂滴与自噬体的分布规律及其相关性,分别采集成熟小鼠不同生殖时期的子宫颈,即空怀期、妊娠中期和分娩期三组,每组为50只,用免疫组织化学法(IHC)对组织中LC3和atg5进行定位,并与油红O染色对LC3和atg5和脂滴进行复和定位;用Western Blot方法检测组织中抗LC3和atg5抗体的特异性;用荧光定量RT-PCR方法检测LC3和atg5及PPARγⅡmRNA的相对表达水平;利用透射电镜观察脂滴和自噬体在子宫颈的分布。结果表明:脂滴和自噬体在成熟小鼠子宫颈的不同时期均存在,并呈现一定的变化规律。利用Image-proplus 6.0软件和IBM SPSS Statistics 19软件对不同时期小鼠子宫颈组织中LC3和atg5蛋白分布的定量分析显示空怀期、妊娠中期、分娩期小鼠子宫颈中的LC3和atg5蛋白表达均有极显著差异(P﹤0.01);利用Image J软件和IBM SPSS Statistics 19软件进行单因素方差统计分析Western Blot结果显示空怀期、妊娠中期、分娩期小鼠子宫颈中的atg5蛋白表达均有极显著差异(P5);脂滴和自噬体蛋白的mRNA表达量妊娠中期最高,其次分娩期,空怀期最低,并且各期之间差异极显著(P<0.01)。另外,空怀期脂滴和自噬体较大,但数量相对较少,主要集聚在宫颈腔上皮细胞第一层细胞的细胞核下侧,成簇存在,接触较为松散。在电镜下观察脂滴呈现浅灰或灰白色。妊娠中期脂滴较小,呈现深灰色,主要聚集在腔上皮第一层细胞的腔侧,有的脱离腔上皮,成簇存在,并且数量多于空怀期;分娩期脂滴体积也较小,呈灰色不等,紧密聚集在腔上皮第一层细胞的腔侧。各时期的自噬体与脂滴的表达成正相关。以上这些结果表明,不同生殖时期的子宫颈中的脂滴与自噬体存在着密切关系,脂滴的大小和数量受自噬体的调节。这预示着妊娠期子宫颈的强劲收缩所消耗的能量可能比分娩期子宫颈的急性开张耗能更大,而空怀时期子宫颈耗能最少。自噬体表达的增强可能预示着其在清理更多的来自脂滴的脂肪酸,预防细胞内脂肪酸中毒上起重要作用。

关键词：小鼠子宫颈自噬体脂滴 LC3 atg5 PPARγⅡ

肠上皮特异性敲除自噬基因atg5/atg7小鼠肠道微生物宏基因组测序分析

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肠上皮特异性敲除自噬基因Atg5/Atg7小鼠肠道微生物宏基因组测序...

作者：赵文静上海交通大学

学位级别：硕士

自噬属于细胞程序性死亡,其广泛存在于动物体内并在各个组织器官发挥着广泛的作用。一方面,它降解胞内蛋白产生新的营养物质供机体利用;另一方面,它也能够吞噬有害病原保护机体正常功能。atg5、atg7作为自噬通路中两种重要的基因,参与... 详细信息

自噬属于细胞程序性死亡,其广泛存在于动物体内并在各个组织器官发挥着广泛的作用。一方面,它降解胞内蛋白产生新的营养物质供机体利用;另一方面,它也能够吞噬有害病原保护机体正常功能。atg5、atg7作为自噬通路中两种重要的基因,参与两条泛素化途径,作用于自噬体的形成,是自噬发挥正常功能所必需。动物肠道中存在着大量的微生物,它们广泛地参与了宿主的营养、代谢和免疫等活动。尤其是在肠道免疫功能方面,已有研究证明微生物能够产生直接的作用破坏或保护肠道屏障来影响机体整体免疫功能。尽管如此,宿主自噬功能与肠道微生物之间的关系却仍不十分清楚。实验以宿主自噬基因和肠道微生物为切入点,制造了肠上皮特异性敲除自噬基因atg5和atg7小鼠,检测和观察了宿主自噬信号通路和肠粘膜组织学变化;并采用高通量测序技术对肠道微生物的种类、分布及其代谢通路进行检测和分析。实验结果显示,(1)敲除atg5、atg7基因后,宿主自噬信号受到阻滞;宿主肠道潘氏细胞呈现畸形;免疫蛋白MUC2表达量上升。说明实验成功获得了敲除atg5、atg7基因小鼠,而且引起了自噬阻滞和免疫系统应答。(2)基因敲除小鼠同野生小鼠比较,肠道微生物的种类和分布存在显著差异。进一步分析显示,差异菌种大多与宿主代谢和免疫疾病有关,如Butyricicoccus pullicaecorum在atg5和atg7敲除小鼠中均同野生小鼠呈现显著差异,暗示其可能同宿主自噬和免疫密切相关。(3)对肠道微生物功能预测结果显示,敲除小鼠与野生小鼠差异肠道微生物在分子运输、遗传信息传递、营养代谢等分子通路上表现明显差异,暗示肠道微生物在相关分子通路上同宿主自噬机制有一定互作和关联。实验证实了宿主自噬机制能够影响肠道微生物的种类和分布,反映了当宿主基因发生变化时,肠道微生物也会发生相应的改变,而且这种改变同相应的代谢通路相关联。实验为进一步研究宿主与肠道微生物与的互作机制提供了新的视角和重要参考。

关键词：自噬 atg5 atg7 条件性基因敲除肠道微生物宏基因组测序宿主-微生物互作小鼠

IFN-λ1下调自噬因子atg5和GABARAP表达抑制HCV复制的机制研究

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IFN-λ1下调自噬因子ATG5和GABARAP表达抑制HCV复制的机制研究

作者：李旭广西医科大学

学位级别：硕士

目的:研究Ⅲ型干扰素(Interferon,IFN)IFN-λ1对肝细胞细胞自噬的影响,探讨IFN-λ1通过抑制细胞自噬从而抑制丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)复制的作用及相关机制。方法:本研究采用了体外研究的方法,利用肝细胞系Huh7细胞,首先使... 详细信息

目的:研究Ⅲ型干扰素(Interferon,IFN)IFN-λ1对肝细胞细胞自噬的影响,探讨IFN-λ1通过抑制细胞自噬从而抑制丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)复制的作用及相关机制。方法:本研究采用了体外研究的方法,利用肝细胞系Huh7细胞,首先使用IFN-λ1处理HCV JFH-1病毒感染的细胞,通过实时荧光定量PCR和免疫印迹法(Western Blot,WB)分别检测细胞内HCV RNA、HCV core蛋白表达水平,观察IFN-λ1对HCV复制的影响;其次使用IFN-λ1分别处理正常Huh7细胞、HCV感染以及自噬诱导剂衣霉素处理的细胞,通过实时荧光定量PCR检测自噬标志基因LC3 mRNA表达水平,免疫印迹法检测自噬标志蛋白LC3B-II表达水平以及自噬转化率LC3B-II/LC3B-I的变化,同时在透射电子显微镜和荧光显微镜下分别观察细胞自噬体形成以及GFP-LC3点状聚集分布的变化,综合分析IFN-λ1对细胞自噬的作用;进一步利用自噬基因PCR阵列(PCR Array)筛选出受IFN-λ1处理表达发生较大变化的自噬相关基因,运用实时荧光定量PCR法和免疫印迹法进行验证;再通过过表达验证筛选出来的自噬相关基因在IFN-λ1抑制HCV中的作用,研究IFN-λ1是否通过调节该基因的表达调控细胞自噬,进而发挥抑制HCV复制的作用;最后利用生物信息学工具筛选IFN-λ1可能调控靶向自噬基因的miRNAs,通过实时荧光定量PCR进行验证,并进一步沉默筛选出来的miRNA,分析其在IFN-λ1抑制HCV复制中的作用。结果:1、IFN-λ1抑制HCV在Huh7细胞中的复制HCV JFH-1感染的Huh7细胞中,与对照组相比,在病毒RNA水平上,IFN-λ1处理的细胞中HCV RNA表达水平降低;在病毒蛋白水平上,IFN-λ1处理的细胞中HCV core蛋白的表达水平也显著降低。2、IFN-λ1抑制Huh7细胞中的细胞自噬(1)在不加入自噬溶酶体抑制剂BafA1的条件下,用IFN-λ1处理正常Huh7细胞、HCV JFH-1感染的Huh7细胞以及衣霉素处理的Huh7细胞。结果表明,IFN-λ1处理不影响细胞自噬标志基因LC3 mRNA的表达水平,但在蛋白质水平上,IFN-λ1对三组细胞中自噬标志蛋白LC3B-II的表达以及自噬转化率LC3B-II/LC3B-I有显著抑制作用。(2)在加入自噬溶酶体抑制剂BafA1的条件下,用IFN-λ1处理正常Huh7细胞、HCV JFH-1感染的Huh7细胞以及衣霉素处理的Huh7细胞。结果显示,IFN-λ1处理同样不影响细胞自噬标志基因LC3 mRNA的表达水平,但在蛋白质水平上,IFN-λ1对三组细胞中LC3B-II的表达以及自噬转化率LC3B-II/LC3B-I有显著的抑制作用。(3)在加入自噬溶酶体抑制剂BafA1预处理细胞后,透射电子显微镜(TEM)下观察到正常Huh7细胞和IFN-λ1处理的正常Huh7细胞中仅有少量双膜囊泡结构的自噬体;而HCV感染或衣霉素处理可观察到自噬体数量的大量增加。当HCV感染或衣霉素处理的细胞同时进行IFN-λ1处理时自噬体数量减少。(4)在加入自噬溶酶体抑制剂BafA1预处理细胞后,倒置荧光显微镜观察正常Huh7细胞或IFN-λ1处理的正常细胞,观察到少量GFP-LC3蛋白点状聚集。而HCV感染或衣霉素处理的条件下,观察到GFP-LC3点状聚集大量增加。当HCV感染或衣霉素处理的细胞同时进行IFN-λ1处理时,GFP-LC3蛋白点状聚集减少。3、IFN-λ1对细胞自噬相关基因表达的影响(1)在未感染或感染HCV-JFH1的Huh7细胞中,通过自噬基因PCR阵列(PCR Array)筛选发现IFN-λ1处理后atg5,GABARAP,BAX,MTOR基因在mRNA的表达水平显著降低(>2倍)。(2)在未感染HCV JFH-1的Huh7细胞中,实时荧光定量PCR证实IFN-λ1处理后atg5,GABARAP的表达显著降低,未观察到BAX和MTOR基因表达的明显变化。Western blot进一步证实IFN-λ1处理后atg5,GABARAP表达明显降低。(3)在感染HCV JFH-1的Huh7细胞中,实时荧光定量PCR证实IFN-λ1处理后atg5,GABARAP的表达显著降低,未观察到BAX和MTOR基因表达的明显变化。Western blot进一步证实IFN-λ1处理后atg5,GABARAP表达明显降低。4、在自噬相关基因atg5、GABARAP过表达条件下,IFN-λ1对HCV复制水平的抑制效果减弱(1)在无IFN-λ1处理条件下,当质粒atg5和GABARAP单独或共同转染HCV-JFH1感染的细胞后,与未转染的对照组细胞

关键词： Ⅲ型干扰素 HCV 细胞自噬 atg5 GABARAP

降脂颗粒上调atg5活化自噬改善非酒精性脂肪性肝炎的效应机制

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降脂颗粒上调ATG5活化自噬改善非酒精性脂肪性肝炎的效应机制

作者：周盐上海中医药大学

学位级别：硕士

目的基于m TOR-atg5介导细胞自噬研究降脂颗粒改善非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)的药效机制。方法1.46只雄性C57BL/6J小鼠,按体重随机分为正常组(n=13)和模型组(n=33),模型组采用高脂饮食喂饲,正常组给予正常... 详细信息

目的基于m TOR-atg5介导细胞自噬研究降脂颗粒改善非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)的药效机制。方法1.46只雄性C57BL/6J小鼠,按体重随机分为正常组(n=13)和模型组(n=33),模型组采用高脂饮食喂饲,正常组给予正常饲料。22周后,正常和模型组各取3只小鼠,检测小鼠肝功能和肝组织病理,以确定NASH模型的成功建立。将造模成功的小鼠按照体重随机分为模型组及降脂颗粒低剂量组、高剂量组,继续高脂饮食,降脂颗粒组同时给予药物干预。8周后,记录小鼠体重、肝重及计算肝指数;检测炎症因子TNF-α、血清及肝脏甘油三酯、胆固醇水平;HE染色观察小鼠肝组织病理变化观察降脂颗粒对NASH模型小鼠的治疗作用。通过以上指标观察药效。应用电镜观察降脂颗粒干预后NASH模型小鼠肝组织自噬小体的变化;应用Western Blot分析降脂颗粒干预后NASH模型小鼠肝组织中m TOR-atg5信号分子及自噬标志蛋白表达的变化。2.分别应用棕榈酸(PA)或油酸/棕榈酸混合游离脂肪酸(O/P)诱导Hep G2细胞建立NASH体外细胞模型。应用atg5 sh RNA载体慢病毒转染构建atg5低表达的sh atg5-Hep G2细胞,并用棕榈酸诱导。以上NASH细胞模型分别用降脂颗粒提取物及自噬抑制剂3-MA干预24h。用油红O染色和甘油三酯检测观察细胞脂滴积聚情况,用CCK8试剂检测细胞活力,用DALGreen染色观察细胞自噬水平,应用Western Blot分析自噬标志蛋白及m TOR-atg5信号通路相关分子表达和活化水平。结果1.饮食喂饲22周后,模型小鼠的血清ALT水平、肝脏甘油三酯、胆固醇水平显著升高;体重、肝重、肝体比上升;肝组织病理显示干细胞胞浆内脂滴蓄积,有气球样变现象及炎细胞浸润,表明NASH小鼠模型成功建立。降脂颗粒干预7周后观察各组小鼠指标。与正常组相比,模型组小鼠血清中ALT、AST、LDH;TG、TC、LDL-c、HDL-c水平显著升高;小鼠体重、肝重、肝体比上升,模型组小鼠肝组织出现大面积肝细胞脂肪变性和炎性细胞浸润;电镜结果显示模型组较正常组溶酶体和自噬小体数量减少;Western Blot结果显示,模型组较正常组小鼠肝组织atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达下调,m TOR/P-m TOR比值、P62水平升高。与模型组相比,降脂颗粒组小鼠血清中ALT、AST、LDH;TG、TC、LDL-c、HDL-c水平显著降低;肝重和肝指数较模型组明显下降,病理显示降脂颗粒干预后小鼠肝组织脂肪变性明显减轻,炎性细胞浸润减少;电镜显示降脂颗粒组出现明显的自噬小体;Western Blot结果显示,与模型组相比,降脂颗粒组atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达上调,m TOR/P-m TOR比值、P62水平下降。降脂颗粒改善脂质积聚,活化自噬的作用明显增强。其中,降脂颗粒低剂量根据70kg成人体重与小鼠的的等效剂量计算,中药组灌胃低剂量为7.714mg/kg,高剂量2倍增加,每只小鼠每日灌胃药物体积为0.2ml。2.依据CCK8检测,确定降脂颗粒干预Hep G2细胞对细胞无损伤的低、中、高药物剂量分别为0.5、1、2μg/m L。PA及O/P诱导的Hep G2细胞内出现脂滴,细胞活力下降,降脂颗粒剂量依赖性地改善脂质积聚,并减轻细胞损伤。PA诱导Hep G2细胞DALGreen染色阳性细胞增加,自噬溶酶体数量增加;而降脂颗粒干预的细胞PA诱导的模型组细胞DALGreen染色阳性细胞更多;Western Blot结果显示PA诱导Hep G2细胞atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ增加,m TOR/P-m TOR比值、P62水平减少,而混合脂肪酸诱导Hep G2细胞m TOR/P-m TOR比值、P62水平增加,atg5表达减少;降脂颗粒干预Hep G2细胞atg5、P-m TOR及LC3Ⅱ/Ⅰ的表达上调,P62水平下降。以棕榈酸诱导sh atg5-Hep G2细胞脂质积聚较野生型Hep G2细胞明显、细胞活力下降,且活化自噬的作用明显减弱。降脂颗粒干预后,与sh atg5-Hep G2细胞模型组相比,TG、TC水平减少;与野生型Hep G2细胞相比,TG、TC水平增加。DALGreen染色显示,sh atg5-Hep G2细胞模型组较正常组阳性细胞增加,自噬溶酶体数量增加;降脂颗粒干预后自噬溶酶体数量仍然增加,但是较野生型Hep G2细胞降脂颗粒组自噬溶酶体数量少。Western Blot结果显示atg5敲减后,sh atg5-Hep G2模型组较正常组m TOR/P-m TOR比值、P62水平增加,LC3Ⅱ/Ⅰ减少。降脂颗粒干预后,与sh atg5-Hep G2模型组相比,降脂颗粒干预后自噬标志物蛋白表达无统计学

关键词：非酒精性脂肪性肝炎降脂颗粒自噬 atg5 mTOR

自噬相关基因Atg3、Atg5在新发IgA肾病治疗前患者外周血单个核细...

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作者：苏珊广西医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨自噬相关基因atg3及atg5在新发IgA肾病治疗前患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达特征及与临床病理关系。方法:选取2017年7月至2018年5月在广西医科大学第一附属医院及广西医科大学第二附属医院肾内科经病理活检确诊新发IgA肾... 详细信息

目的:探讨自噬相关基因atg3及atg5在新发IgA肾病治疗前患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达特征及与临床病理关系。方法:选取2017年7月至2018年5月在广西医科大学第一附属医院及广西医科大学第二附属医院肾内科经病理活检确诊新发IgA肾病治疗前患者28例为实验组,同期正常健康体检人32例为对照组,收集两组清晨外周血标本,以及新发IgA肾病治疗前患者的临床症状、实验室数据及病理资料,运用实时荧光定量PCR方法(RT-PCR)检测两组外周血单个核细胞atg3、atg5 mRNA的表达量,进一步应用SP免疫组化方法进行观察两组PBMC中atg3、atg5蛋白表达情况,分析atg3、atg5 mRNA表达水平与新发IgA肾病治疗前患者的临床特点、实验生化数据及肾脏病理资料间的关系。结果:1.新发IgA肾病治疗前患者组(n=28例)PBMC的atg3 mRNA表达量高于对照组(n=32例)(P5),而新发IgA肾病治疗前患者组(n=28例)PBMC的atg5 mRNA表达量与对照组(n=32例)比较无统计学差异性意义(P>0.05)。2.荧光显微镜下采用图像分析发现新发IgA肾病治疗前患者PBMC中atg3蛋白表达的阳性细胞率(80%)高于对照组(40%),新发IgA肾病治疗前患者PBMC中atg5蛋白表达的阳性细胞率(80%)高于对照组(60%)。3.在新发IgA肾病治疗前患者组中,atg3mRNA低表达组(n=14例)与高表达组(n=14例)两组间临床特点分析:上呼吸道感染、血尿、水肿、高血压、腰背痛发生率无统计学差异性意义(P>0.05)。两组实验室数据分析:血IgA、24小时尿蛋白、肌酐、CCR、尿素、尿酸、血HCO3、低密度脂蛋白、高密度脂蛋、血沉、白细胞无统计学差异性意义(P>0.05)。4.在新发IgA肾病治疗前患者组中,atg3mRNA低表达组(n=12例)与高表达组(n=13例)两组间病理分析:LEE氏分级、肾脏病理AI、CI评分无统计学差异性意义(P>0.05)。5.在新发IgA肾病治疗前患者组中,atg5 mRNA低表达组(n=14例)与高表达组(n=14例)两组间临床特点分析:在高表达组中,上呼吸道感染的发生率更低,差异有统计学意义(P5)。两组间实验室数据分析:在高表达组中,血IgA、血HCO3及血沉数值更低,差异有统计学意义(P5)。6.在新发IgA肾病治疗前患者组中,atg5 mRNA低表达组(n=12例)与高表达组(n=13例)两组间病理分析:LEE氏分级、肾脏病理AI、CI评分无统计学差异性意义(P>0.05)。结论:1.新发IgA肾病治疗前患者PBMC中自噬相关基因atg3 mRNA表达上调,可能通过调控自噬活动,影响IgA肾病的发展。2.自噬相关基因atg5 mRNA的高表达可能与新发IgA肾病治疗前患者上呼吸道感染发生率下降有关。3.自噬相关基因atg5 mRNA的表达增高可能与新发IgA肾病治疗前患者血清IgA、血沉水平下降有关,并影响肾小管重吸收HCO3。

关键词：新发IgA肾病治疗前期自噬外周血单个核细胞 atg3 atg5