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atf2在低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡中的作用

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中国现代医学杂志 2010年第8期20卷 1121-1124页

作者：袁忠民李丹罗景燕何伟文广州医学院神经科学研究所广东广州510260 中山大学附属第三医院放射科广东广州510630 中山大学中山医学院药理教研室广东广州510089

目的探讨bZip家族蛋白atf2在撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时的作用及机制。方法体外培养小脑颗粒神经元,用含5mM KCl的无血清培养基(简称为低钾或5K)处理诱导凋亡,Western blot检测atf2和c-Jun蛋白的表达及磷酸化水平;免疫耗竭检测atf2... 详细信息

目的探讨bZip家族蛋白atf2在撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时的作用及机制。方法体外培养小脑颗粒神经元,用含5mM KCl的无血清培养基(简称为低钾或5K)处理诱导凋亡,Western blot检测atf2和c-Jun蛋白的表达及磷酸化水平;免疫耗竭检测atf2是否主要与c-Jun形成复合物;转染小分子干扰RNA检测沉默atf2与c-Jun表达对神经元凋亡的影响。结果低钾刺激使atf2和c-Jun磷酸化水平增加;atf2主要与c-Jun形成复合物。分别沉默atf2或c-Jun表达能抑制神经元凋亡(P0.05)。结论低钾条件下,atf2主要通过与c-Jun形成复合物促进小脑颗粒神经元凋亡。

关键词： atf2 c-Jun 小脑颗粒神经元凋亡

atf2基因促进肾癌细胞的增殖和转移与临床患者预后相关性的研究

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ATF2基因促进肾癌细胞的增殖和转移与临床患者预后相关性的研究

作者：吴登爽第二军医大学

学位级别：硕士

[目的]激活转录因子2(activating transcription factor 2,atf2)是碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,b ZIP)家族成员,在不同肿瘤的发生和发展当中,atf2发挥抑癌和促癌的双重作用。研究报道其在调节参与应激、DNA损伤应答和转录调控... 详细信息

[目的]激活转录因子2(activating transcription factor 2,atf2)是碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,b ZIP)家族成员,在不同肿瘤的发生和发展当中,atf2发挥抑癌和促癌的双重作用。研究报道其在调节参与应激、DNA损伤应答和转录调控基因和蛋白方面均发挥重要作用。然而,在肾脏肿瘤的相关研究中,atf2的作用鲜有报道。本课题旨在通过抑制atf2基因的表达,探究其对肾癌细胞系表型的影响,并结合临床资料研究其相关的临床意义。[研究方法]1、通过qRT-PCR(quantitative real-time,PCR)方式验证肾癌细胞系与正常肾脏细胞系,癌旁组织和癌组织,癌组织和癌栓组织中atf2 mRNA的表达差异。2、构建针对atf2基因的三条si RNA(small interfering RNA,si RNA)敲减序列,并通过qRT-PCR方式验证其敲减效率从而筛选敲减效率最强的一条序列制备慢病毒介导的atf2 sh RNA(short hairpin RNA,sh RNA),并再次在mRNA和蛋白水平验证其敲减效率。3、通过细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移和侵袭实验验证atf2敲减对肾癌细胞系786-O和ACHN的影响。同时利用qRT-PCR和Western blot技术检测影响细胞增殖和转移相关基因的表达。裸鼠皮下荷瘤实验再次验证atf2敲减对肾癌细胞增殖的影响。4、利用免疫组化和组织芯片技术,探究atf2在肾癌组织中的表达情况,并结合临床资料研究其对患者生存和预后的意义。[结果]1、qRT-PCR结果表明atf2 mRNA在肾癌细胞系中的表达高于正常肾脏细胞系,临床样本中结果表明其在癌组织中高表达,且相较于癌组织,癌栓组织中atf2 mRNA表达水平更高。2、qRT-PCR和Western blot结果表明构建的atf2 sh RNA能够有效的敲减atf2在mRNA和蛋白水平的表达,敲减效率在90%以上。3、相较于对照组,atf2敲减组肾癌细胞在增殖活性,迁移和侵袭能力方面均明显降低。atf2 sh RNA敲减组细胞凋亡增加,细胞周期出现G0/G1期阻滞。qRT-PCR和Western blot结果显示,atf2敲减后Cyclin B1,Cyclin D1,Snail和Vimentin基因的表达受到抑制,E-cadherin的表达升高。裸鼠皮下荷瘤实验显示实验组肿瘤生长明显受到抑制。4、组织芯片免疫组化染色结果分析,atf2在肾癌组织中高表达,atf2的表达与肾癌患者肿瘤的大小,有无癌栓,有无转移相关。高表达atf2肾癌患者的总体生存期和无进展生存期明显较短。[结论]慢病毒敲减atf2使其在mRNA和蛋白水平表达明显受到抑制,atf2通过调控Cyclin B1,Cyclin D1,Snail,Vimentin和E-cadherin基因的表达影响肾癌细胞的增殖和转移。结合临床资料分析atf2可能作为判断患者预后的生物学指标。

关键词： atf2 肾细胞癌基因敲减增殖转移预后

atf2在食管癌中的表达和分子机制的初步探索

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ATF2在食管癌中的表达和分子机制的初步探索

作者：高闯郑州大学

学位级别：硕士

背景食管癌主要包括食管鳞癌和食管腺癌,在我国主要以食管鳞癌为主,我国是世界上食管癌高发国家之一,也是世界上食管癌高死亡率之一。随着我国医疗技术飞速发展,食管癌早期诊断大大提高,早期食管癌及时发现并且手术根治预后良好,食管癌... 详细信息

背景食管癌主要包括食管鳞癌和食管腺癌,在我国主要以食管鳞癌为主,我国是世界上食管癌高发国家之一,也是世界上食管癌高死亡率之一。随着我国医疗技术飞速发展,食管癌早期诊断大大提高,早期食管癌及时发现并且手术根治预后良好,食管癌预后差多与缺乏早期诊断有关,大多数食管癌患者出现症状后多已进展至晚期,预后很差。目前关于肿瘤的基因转录调控方面的研究取得了可喜的成果,已知激活转录因子-2(activating transcription factor-2,atf-2)是细胞的生长及存活过程中的重要转录因子,最新研究表明atf2在肿瘤细胞基因的转录调控方面发挥重要作用,atf2在细胞中定位不同,发挥作用也不一致,atf2核定位与致癌作用有关,胞质定位与抑癌作用有关,本研究通过检测atf2mRNA及atf2在食管癌组织中的表达及改变atf2表达水平对食管癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响来探讨atf2在食管癌中的作用。目的通过检测atf2 mRNA及atf2在食管癌组织中的表达、构建过表达atf2基因的慢病毒载体,包装慢病毒并转染食管癌细胞系获得过表达atf2的稳转细胞系,研究过表达atf2对于食管癌细胞系的增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响,探讨atf2在食管癌中的作用,为食管癌的靶向治疗提供更多理论依据。方法1.对120例食管癌患者的食管癌组织与癌旁组织标本进行atf2 mRNA基因测序分析。2.免疫组织化学染色检测atf2蛋白在食管癌组织与癌旁组织标本中的表达。3.使用Western Blot检测10种食管癌细胞系中atf2的表达。4.根据atf2基因序列使用PCR技术获得atf2基因片段,包装慢病毒质粒载体,获得含有atf2野生型慢病毒载体和atf2 Thr71位点突变的慢病毒载体基因的慢病毒载体。然后对KYSE-140食管癌细胞系进行慢病毒载体转染实验,将细胞分为3组,(1)空白对照组:使用病毒空载体转染食管癌KYSE-140细胞系;(2)atf2野生型过表达组:使用atf2野生型慢病毒载体转染食管癌KYSE-140细胞系;(3)atf2 T71A突变型过表达组:使用含有atf2 T71A突变的慢病毒载体转染食管癌KYSE-140细胞系,其中atf2突变型基因表达的atf2蛋白为转录活性受损的蛋白。*** Blot检测病毒转染后三组细胞系atf2蛋白的表达6.使用活细胞动态成像与分析系统IncuCyte Zoom对3组食管癌细胞系进行动态增殖生存分析。7.使用Annexin-FITC-PI凋亡试剂盒处理三组食管癌细胞后使用流式细胞仪检测过表达atf2细胞周期和细胞凋亡的影响;使用PI染色法处理三组食管癌细胞后使用流式细胞仪分析过表达atf2对细胞周期的影响。结果1.120例食管癌患者组织mRNA测序:在食管癌组织中atf2 mRNA表达水平高于癌旁组织对照组(P2.免疫组织化学:atf2蛋白在食管癌组织中的表达高于癌旁组织对照组(Patf2在食管癌细胞系中的表达:10种食管癌细胞系中均有atf2蛋白表达,且在细胞系KYSE-140中表达较低。*** Blot检测三组KYSE-140细胞系中atf2的表达:空白病毒载体转染细胞中atf2的表达较少,加入atf2野生型慢病毒载体和atf2 Thr71A突变的慢病毒载体转染的食管癌细胞中中atf2均为过表达,证实稳定转染成功。5.病毒载体转染食管癌细胞后,3组食管癌细胞系动态增殖分析:空白对照组的细胞增殖水平高于过表达atf2的突变组和野生组(Patf2突变组细胞增殖水平高于过表达atf2野生组(P2期比例变化:atf2野生型过表达组G2和S期比例高于空白病毒载体转染组和atf2突变型过表达组,G1期低于空白病毒载体转染组和atf2突变型过表达组(Patf2突变型过表达组G1期高于空白病毒载体转染组和atf2野生型过表达组,S期低于空白病毒载体转染组和atf2野生型过表达组(Patf2突变型过表达组与空白病毒载体转染组G2期相比没有统计学意义(P>0.05)。7.流式细胞仪进行细胞凋亡水平检测,结果发现atf2野生型过表达组的凋亡率明显高于空白对照组和atf2突变型过表达组(P2 mRNA及atf2蛋白在食管癌组织中表达均升高。***2可以促进食管癌细胞凋亡,但同时也促进细胞周期由G1期向S期与G2期转变,综合表现为抑制食管癌细胞生长。

关键词：食管鳞癌 atf2 二聚体慢病毒细胞周期

川楝素下调atf2蛋白的表达增强顺铂对肺癌细胞的凋亡诱导活性研究

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中国现代应用药学 2018年第4期35卷 547-551页

作者：张伟星张浩翁伟芳建德市第一人民医院呼吸科杭州311600 浙江大学医学院附属第二医院呼吸科杭州310000

目的探讨川楝素辅助治疗是否能增强顺铂对肺癌细胞的凋亡诱导活性并研究其机制。方法 MTT法检测肺癌细胞系A549在顺铂和川楝素处理下的细胞活力。Western blot试验检测顺铂和川楝素对A549细胞atf2磷酸化水平,Bcl-xl蛋白表达水平、细胞色... 详细信息

目的探讨川楝素辅助治疗是否能增强顺铂对肺癌细胞的凋亡诱导活性并研究其机制。方法 MTT法检测肺癌细胞系A549在顺铂和川楝素处理下的细胞活力。Western blot试验检测顺铂和川楝素对A549细胞atf2磷酸化水平,Bcl-xl蛋白表达水平、细胞色素C释放水平、caspase-9和caspase-3活化水平的影响。流式细胞术检测A549细胞在顺铂和川楝素联合处理下的细胞凋亡率。结果 MTT试验结果显示,川楝素辅助治疗能明显提降低顺铂对A549的IC50。Western blot试验结果显示川楝素处理能显著抑制A549细胞atf2的表达和磷酸化。MTT试验结果显示,转染atf2表达质粒显著抑制川楝素对顺铂的协同抗肺癌活性。Western blot和流式细胞试验结果显示,川楝素能显著抑制A549细胞中顺铂诱导的Bcl-xl表达水平的上调,进而促进A549细胞中顺铂诱导的细胞色素C的释放、caspase-9和caspase-3活化及A549细胞的凋亡水平。结论川楝素通过抑制atf2蛋白的磷酸化增强顺铂对肺癌细胞的凋亡诱导活性。

关键词：肺癌川楝素 atf2 顺铂 Bcl-xl

Lnc000440通过ERK1/atf2途径调控单核/巨噬细胞脂质摄取的分子机制研究

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Lnc000440通过ERK1/ATF2途径调控单核/巨噬细胞脂质摄取的分子机...

作者：袁玉婵大连医科大学

学位级别：硕士

目的:研究长链非编码RNA lnc000440对ox-LDL诱导的THP-1单核/巨噬细胞脂质摄取的调控作用及其分子机制。方法:Lnc000440作为一个长链非编码RNA,首先理论上使用系统发育密码子替换频率(Phylo CSF)预测长链非编码RNA lnc000440是否具有编... 详细信息

目的:研究长链非编码RNA lnc000440对ox-LDL诱导的THP-1单核/巨噬细胞脂质摄取的调控作用及其分子机制。方法:Lnc000440作为一个长链非编码RNA,首先理论上使用系统发育密码子替换频率(Phylo CSF)预测长链非编码RNA lnc000440是否具有编码蛋白质的潜能,实验中通过在长链非编码RNA lnc000440的开放阅读框(ORF)羧基端融合GFP质粒,同时将ORF的起始密码子ATG突变成ATT作为阴性对照,进一步体外验证长链非编码RNA lnc000440是否具有编码蛋白质的能力。然后通过分离正常THP-1细胞胞质和胞核RNA,细胞质以β-actin作为内参,细胞核以U6作为内参,通过q PCR检测lnc000440在细胞质和细胞核中的含量确定lnc000440在THP-1细胞中的亚分布状态。接着我们通过q PCR检测不同浓度梯度的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)(0ug/ml,50ug/ml,100ug/ml,150ug/ml,200ug/ml)诱导的THP-1单核/巨噬细胞长链非编码RNA lnc000440的表达情况研究lnc000440是否与ox-LDL诱导的动脉粥样硬化细胞模型有关。我们通过构建长链非编码RNA lnc000440过表达慢病毒载体干预THP-1细胞或经PMA诱导的THP-1来源的巨噬细胞,通过细胞油红O染色,Dil-ox-LDL摄取实验,Western Blot,q PCR方法分别检测SR-A、CD36的表达水平,检测长链非编码RNA lnc000440对THP-1细胞或PMA诱导的THP-1来源的巨噬细胞的脂质摄取影响。为进一步探索其中的分子机制,我们通过Western Blot方法分别检测T-ERK1/2,p-ERK1/2,T-atf2,p-atf2的表达水平,同时分别检测胞质胞核T-ERK1/2,p-ERK1/2,T-atf2,p-atf2的表达水平,进一步研究长链非编码RNA lnc000440是否通过调控p-ERK1/2-p-atf2的核质定位改变来调控THP-1细胞的脂质摄取。最后应用Graph Pad Prism 7.00,Adobe Illustrator CS6,Image J软件进行统计和数据分析。结果:我们的研究发现lnc000440是一种主要分布于细胞质的长链非编码RNA,可通过在细胞质中调控相关基因调控细胞功能。在不同浓度梯度的ox-LDL的诱导下,THP-1单核/巨噬细胞随着ox-LDL浓度升高,lnc000440表达量呈剂量依赖性降低。lnc000440的过表达能够抑制CD36的表达,从而抑制THP-1单核/巨噬细胞对ox-LDL的摄取。另外,在THP-1细胞中,p-ERK1主要分布在细胞质中,p-atf2主要在细胞核中,在经ox-LDL诱导的THP-1单核/巨噬细胞中,p-ERK1在细胞质中的表达量增多促进p-atf2入核,因此p-atf2在细胞核中的表达量也明显增多。而在ox-LDL诱导下,过表达lnc000440能够明显抑制THP-1单核/巨噬细胞p-ERK1、p-atf2的表达。结论:长链非编码RNA lnc000440能够通过抑制脂质摄取进而延缓THP-1单核/巨噬细胞泡沫化,其机制是通过其抑制ERK1磷酸化减少p-atf2入核降低CD36的表达实现的。

关键词： lnc000440 ERK1 atf2 脂质摄取动脉粥样硬化

转录激活因子atf2对伪狂犬病毒感染PK-15细胞的作用研究

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转录激活因子ATF2对伪狂犬病毒感染PK-15细胞的作用研究

作者：姜芳芳华中农业大学

学位级别：硕士

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)是疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科中的重要成员。伪狂犬病是PRV引发的猪的重要传染病之一,对养猪行业造成了巨大的经济损失。目前伪狂犬病已被农业部列为优先防治的16种动物疫病之一。因此研究PRV复制、... 详细信息

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)是疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科中的重要成员。伪狂犬病是PRV引发的猪的重要传染病之一,对养猪行业造成了巨大的经济损失。目前伪狂犬病已被农业部列为优先防治的16种动物疫病之一。因此研究PRV复制、与宿主之间互作等过程对寻找治疗α-疱疹病毒的药物靶点、研制新型疫苗是十分必要的。本课题以伪狂犬病毒(PRV)为材料,系统地研究猪肾上皮细胞(PK-15)在PRV感染后的信号通路转导过程。应用iTRAQ联用LC-MS/MS技术获取宿主蛋白质磷酸化水平的全局动态并基于生物信息学全面分析PRV感染对PK-15蛋白质磷酸化的影响。应用siRNA敲低atf2等基因表达、抑制剂阻断MAPK Pathway(ERK、JNK、p38通路)信号传导、慢病毒gRNA表达系统及Cas9表达细胞系构建atf2基因缺失细胞系、超表达atf2完整型及69/71苏氨酸磷酸化位点突变型表达质粒等实验方法,研究atf2基因及MAPK Pathway对PRV复制的影响。期望从宿主磷酸化蛋白质组学入手,对PRV在PK-15中的增殖机制进行深入研究。该研究可以对寻找PRV增殖依赖的宿主基因、发掘治疗α-疱疹病毒潜在药物的靶点、研制新型疫苗提供一些重要指导意义。关于本课题涉及到的具体工作内容及研究结果如下:***-15细胞iTRAQ磷酸化蛋白质组学分析以MOI=10的PRV感染PK-15细胞,2.5 h.p.i.提取细胞的总蛋白,应用iTRAQ定量技术检测宿主细胞蛋白质磷酸化情况,生物信息学方法分析鉴定到的结果。显著性差异分析显示,共鉴定到磷酸化肽段5723个,蛋白质2180个,按照Ratio>+/-1.2且P value2倍率的磷酸化肽段有678个,磷酸化水平下调0.83倍率的磷酸化肽段有603个。差异蛋白质KEGG Pathway富集分析显示:MAPK Pathway是显著性差异蛋白较多且富集程度最高的信号通路。2.组学数据的验证及atf2基因的初步筛选通过检测atf2(pT/pT)及RSK2(pS)蛋白质磷酸化水平对组学数据进行了验证。Western blotting结果与组学数据一致,说明组学数据的可靠性。进一步通过siRNA干扰及空斑形成单位测定(PFU)实验,检测MAPK Pathway中有差异磷酸化表达的sos、max、nfκb、rsk2、atf2基因对于PRV增殖过程的影响。实验结果显示,对照组PRV滴度为10 PFU/mL,atf2基因下调表达时,PRV滴度为10 PFU/mL,下调10.6.6 PFU/mL;rsk2基因下调表达时,PRV滴度为10 PFU/mL,下调10 PFU/mL;结果显示atf2、rsk2基因下调表达时,对于PRV增殖有一定程度地抑制作用。3.抑制剂阻断MAPK Pathway信号传递对于PRV复制的影响为了进一步确定在MAPK Pathway中rsk2和atf2所涉及到的ERK和JNK、p38信号通路是否参与PRV增殖过程,研究中分别使用针对ERK和JNK、p38信号通路的特异性抑制剂U0126、SP600125、SB202190抑制或阻断对应通路中的信号传递。Western blotting实验检测抑制剂的阻断效果,结果显示:U0126可抑制ERK Pathway信号传递,对于RSK2蛋白磷酸化水平有明显下调作用;SP600125通过抑制JNK Pathway信号转导起到下调atf2磷酸化水平的作用;SB202190无法通过阻断p38信号转导下调atf2磷酸化水平;因此可知PRV对于atf2基因的激活作用主要依赖于JNK Pathway。使用紫外灭活病毒(UV-PRV)及活病毒(WT-PRV)激活ERK和JNK、p38信号通路,Western blotting实验显示用UV-PRV刺激不能引起其下游基因rsk2及atf2磷酸化水平增加,该结果表明ERK、JNK和p38信号通路的激活不依赖于PRV的结构蛋白。病毒滴度测定结果显示,对照组PRV滴度为10 PFU/mL,SP600125处理组PRV滴度为10 PFU/mL;显示PRV在PK-15上的复制依赖于JNK Pathway信号转导途径。通过抑制剂SP600125抑制JNK Pathway信号传递在下调atf2磷酸化水平的同时会抑制PRV在PK-15上的复制。4.敲除atf2基因对PRV在PK-15细胞中复制的影响基于Cas9表达系统,通过慢病毒转导方法成功构建atf2基因敲除的Cas9PK-15细胞系。在此基础上,进一步验证atf2基因敲除对于PRV增殖的影响。通过对不同感染时间点进行病毒滴度测定,结果显示:12 h.p.i.时,在亲本细胞株Cas9 PK-1

关键词： α-疱疹病毒伪狂犬病毒(PRV) iTRAQ atf2 磷酸化位点

小鼠感染猪血凝性脑脊髓炎病毒后大脑内atf2和atf3表达的动态变化

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小鼠感染猪血凝性脑脊髓炎病毒后大脑内ATF2和ATF3表达的动态变化

作者：张英俊沈阳农业大学

学位级别：硕士

血凝性脑脊髓炎病毒主要感染1～3周龄的哺乳仔猪,常被称为猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV),仔猪感染后可出现明显的神经症状,病死率可达20%～100%。小鼠可感染PHEV,常作为感染PHEV的病理... 详细信息

血凝性脑脊髓炎病毒主要感染1～3周龄的哺乳仔猪,常被称为猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV),仔猪感染后可出现明显的神经症状,病死率可达20%～100%。小鼠可感染PHEV,常作为感染PHEV的病理模型。本课题组前期研究表明小鼠感染PHEV后,激活转录因子3(Activating transcription factor 3,atf3)的表达也增加。atf3可作为atf2的下游靶基因,atf2为JNK信号通路中的一员。除JNK信号通路外,atf3还可由P53、TGF-β/smad和c-Myc等信号通路诱导激活。但是前期研究中仅发现JNK信号通路相关因子被激活。据此推测PHEV感染小鼠后,大脑中atf3的高表达可能是由JNK信号通路所诱导的。若此推论成立,作为调控atf3的上游基因atf2也应呈现高表达。为验证上述假设,本实验对感染PHEV后不同时间段的小鼠大脑中的atf2和atf3的表达水平进行检测。本实验首先构建了 PHEV急性感染小鼠的模型,采用颅内接种方式,以小鼠在接毒后第5天全部死亡的接种剂量最为最佳接种剂量。选取4周龄SPF雌性昆明小鼠30只,随机分两组,接毒组和对照组,每组15只。接毒组以最佳接种剂量颅内接种PHEV,对照组以相同剂量颅内接种PBS。于接毒后的第1天,2天,3天,4天,5天每组随机选取3只小鼠进行剖杀。采取大脑,一部分固定于福尔马林溶液,另一部分冻存于液氮中。固定于福尔马林溶液中的大脑用于病理组织学病变的观察;冻存于液氮中的大脑,采用Real-time PCR和Western Blot法检测atf2和atf3 mRNA和蛋白在大脑内的表达情况。采用2-△△Ct相对表达量检测atf2、atf3和PHEVmRNA的表达水平,采用半定量法检测其蛋白的表达水平,并采用SPSS 17.0软件进行数据分析和处理。结果显示,小鼠感染PHEV后主要表现为非化脓性脑炎的病理组织学变化,且随着感染时间的延长,病理损伤逐渐加重。同时,随着感染时间的延长,atf2、atf3与PHEV的mRNA和蛋白表达水平均呈逐渐上升趋势。经相关性分析,atf2和atf3的表达呈正相关(patf2表达与PHEV之间呈正相关(patf3和PHEV之间表达呈正相关(patf2的表达量的增高,atf3表达和PHEV病毒载量也增高。小鼠感染PHEV后atf3的高表达可能是JNK信号通路激活后由atf2诱导调控的。本研究为进一步探明PHEV感染的神经细胞过程中atf3高表达的机制指引了新方向,为深入解析PHEV的分子致病机制提供重要的理论依据。

关键词：猪血凝性脑脊髓炎病毒 atf2 表达与调控

JNK/ANXA7信号通路通过atf2及相关lncRNA影响小鼠肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的研究

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JNK/ANXA7信号通路通过ATF2及相关lncRNA影响小鼠肝癌细胞增殖、...

作者：邓棋大连医科大学

学位级别：硕士

目的:肝癌是慢性肝病患者最常见的恶性肿瘤之一,其预后不良的主要原因是淋巴道转移和复发。肝癌细胞增殖、迁移、侵袭行为是其转移或复发的早期生物学特征。本研究目的旨在探讨肝癌细胞中JNK/p53/ANXA7信号通路的表达及其对肝癌细胞增... 详细信息

目的:肝癌是慢性肝病患者最常见的恶性肿瘤之一,其预后不良的主要原因是淋巴道转移和复发。肝癌细胞增殖、迁移、侵袭行为是其转移或复发的早期生物学特征。本研究目的旨在探讨肝癌细胞中JNK/p53/ANXA7信号通路的表达及其对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响;并进一步探讨JNK和ANXA7是否通过atf2及其相关lncRNA影响肝癌的淋巴黏附能力,揭示肝癌转移早期有关生物学行为的机制,为临床治疗提供新靶点。方法:1.分别下调Hca-P细胞中JNK、p53、ANXA7的表达水平并验证下调效率:(1)利用Lipofectamine2000将化学合成的sh RNA-JNK、sh RNA-p53、sh RNA-ANXA7以及对照无关序列(control-sh RNA-treated)转染小鼠腹水型肝癌细胞Hca-P,并通过荧光倒置显微镜观察GFP表达量、qRT-PCR及Western blot验证转染效率。(2)采用G418对转染后的细胞进行28天的筛选,建立稳转细胞系。2.探讨在Hca-P细胞中JNK/p53/ANXA7信号通路的表达:分别下调JNK、p53、ANXA7及采用JNK抑制剂(JNK-inhibitor-treated),通过qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光检测与Hca-P组和control-sh RNA-treated组相比JNK/p53/ANXA7信号通路各基因及蛋白水平的表达情况。***/p53/ANXA7信号通路对Hca-P细胞增殖、迁移和侵袭的影响:(1)通过CCK8实验检测Hca-P、control-sh RNA-treated、sh RNA-JNK、sh RNA-p53、sh RNA-ANXA7、JNK inhibitor-treated组的细胞增殖能力。(2)通过Transwell实验检测上述6组细胞的迁移和侵袭能力。4.下调JNK、ANXA7对atf2表达量的影响:通过qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光检测control-sh RNA-treated、sh RNA-JNK和sh RNA-ANXA7组中atf2在基因和蛋白水平的表达量。5.下调JNK、ANXA7对淋巴黏附的影响:通过淋巴黏附实验检测control-sh RNA-treated、sh RNA-JNK和sh RNA-ANXA7组细胞的淋巴黏附能力。6.下调JNK、ANXA7对atf2相关lncRNA NONMMUT114121.1表达量的影响:通过qRT-PCR检测control-sh RNA-treated、sh RNA-JNK和sh RNA-ANXA7组中lncRNA NONMMUT114121.1的表达量。结果:1.利用sh RNA在Hca-P细胞中下调ANXA7、p53、JNK的表达。通过qRT-PCR和Western blot在基因和蛋白水平验证,已成功建立下调ANXA7、p53、JNK细胞株(P2.肝癌细胞中JNK/p53/ANXA7信号通路表达。(1)与Hca-P组和control-sh RNA-treated组相比,下调JNK和使用JNK抑制剂后,JNK、p53、ANXA7在基因水平和蛋白水平均下降(P2)细胞免疫荧光结果显示,与Hca-P组和control-sh RNA-treated组相比,下调JNK和使用JNK抑制剂组中JNK、p53、ANXA7荧光亮度减弱;下调p53组中JNK、p53、ANXA7荧光亮度减弱;在下调ANXA7组中ANXA7荧光亮度减弱,而JNK和p53的荧光亮度无明显变化。证明Hca-P细胞中表达JNK/p53/ANXA7信号通路。***/p53/ANXA7信号通路对Hca-P细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。(1)CCK8实验结果显示:与Hca-P组和control-sh RNA-treated组相比,下调JNK、p53、ANXA7及使用JNK抑制剂后,细胞增殖能力均下降,差异具有统计学意义(P2)Transwell实验结果显示:下调JNK、p53、ANXA7及使用JNK抑制剂组的细胞培养24h后,穿膜及穿过基质胶的细胞数量少于Hca-P组和control-sh RNA-treated组,差异具有统计学意义(Patf2表达量的影响。(1)qRT-PCR和Western blot检测,下调JNK、ANXA7后与control-sh RNA-treated组相比atf2在基因和蛋白水平表达量均

关键词：肝癌 JNK p53 Annexin A7 atf2 lncRNA

清脑益元汤对脑缺血损伤大鼠海马神经元c-jun、atf2表达的影响

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清脑益元汤对脑缺血损伤大鼠海马神经元c-jun、ATF2表达的影响

作者：张冰川广西中医药大学

学位级别：硕士

目的:通过观察清脑益元汤对大鼠脑缺血损伤海马c-jun、atf2表达的影响,探讨清脑益元汤对大鼠脑缺血损伤神经元保护的部分作用机制。方法:将成年健康雄性SD大鼠192只,按随机数字表分为两大组,每大组96只,继续随机分为4个亚组:空白组(A组6... 详细信息

目的:通过观察清脑益元汤对大鼠脑缺血损伤海马c-jun、atf2表达的影响,探讨清脑益元汤对大鼠脑缺血损伤神经元保护的部分作用机制。方法:将成年健康雄性SD大鼠192只,按随机数字表分为两大组,每大组96只,继续随机分为4个亚组:空白组(A组6只)、假手术组(B组30只)、模型对照组(C组30只)、清脑益元汤组(D组30只)。B、C、D三组均按缺血损伤后1d、3d、7d、14d、28d五个处死时间点分为5个亚组(n=6),并分别作如下处理:空白组正常饲养,灌胃等体积蒸馏水;假手术组参照大鼠急性脑缺血损伤模型进行手术,但手术插入栓线长度仅为8mm,术后正常饲养,灌胃等体积蒸馏水;模型对照组灌胃等体积蒸馏水7d后,采用线栓法制成大鼠急性脑缺血损伤模型,继续予生理盐水灌胃至各处死时间点。清脑益元汤组灌胃等体积清脑益元汤7d后,采用线栓法制成大鼠急性脑缺血损伤模型,继续予清脑益元汤灌胃至大鼠各处死时间点。参考Longa的5分制法对大鼠进行神经功能缺损评分,并按各时间点进行标本采集。两组大鼠分别进行取材后,一组应用免疫组化法检测大鼠脑缺血侧海马c-jun细胞阳性的表达水平,另一组应用蛋白质印迹法(Western blot)检测大鼠脑缺血侧海马atf2蛋白的表达水平。结果:1.神经功能缺损评分结果:空白对照组和假手术组大鼠神经功能缺损评分均为零,模型对照组和清脑益元汤组两组大鼠均出现不同程度的神经功能缺损,与模型对照组相比,清脑益元汤组大鼠的神经功能缺损评分较低,差异有统计学意义(p2.免疫组化法检测结果:与假手术组比较,模型对照组和清脑益元汤组大鼠c-jun细胞阳性的表达水平在各时间点均显著升高,差异有统计学意义(patf2蛋白的表达水平在各时间点均显著升高,差异有统计学意义(patf2蛋白表达水平在各时间点均有所降低,差异有统计学意义(Patf2蛋白的表达水平,这可能是其发挥脑缺血后神经元保护作用的机制之一。

关键词：清脑益元汤脑缺血损伤 c-jun atf2