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阻断TGF-β/TGF-βRⅠ通路对atdc5细胞增殖、分化及细胞外基质的影响

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第三军医大学学报 2013年第10期35卷 917-921页

作者：王权戚华兵王晓凤朱莹陈林第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室骨代谢与修复中心创伤烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042

目的研究转化生长因子βⅠ型受体(transforming growth factor beta typeⅠreceptor,TGF-βRⅠ)阻断剂SB-505124对软骨细胞增殖、分化及细胞外基质的影响与机制。方法利用Western blot检测不同浓度的SB-505124处理后,前软骨细胞系atdc5... 详细信息

目的研究转化生长因子βⅠ型受体(transforming growth factor beta typeⅠreceptor,TGF-βRⅠ)阻断剂SB-505124对软骨细胞增殖、分化及细胞外基质的影响与机制。方法利用Western blot检测不同浓度的SB-505124处理后,前软骨细胞系atdc5中p-Smad2/3的变化。MTT法检测SB-505124处理对atdc5细胞生长、增殖的影响及时间、浓度依赖性效应。Western blot检测c-Myc蛋白水平的变化。Real-time PCR检测SB-505124处理后软骨分化、细胞外基质合成及降解相关分子CollagenⅡ、Aggrecan及Adamts5表达与变化,并利用阿尔新蓝染色法检测SB-505124处理对atdc5细胞中蛋白聚糖合成的影响。结果 Western blot检测结果示:SB-505124处理atdc5细胞明显抑制TGF-β1激活的p-Smad2/3,并呈浓度依赖性;MTT检测结果示:SB-505124浓度和时间依赖性的抑制atdc5细胞增殖;Real-time PCR检测结果示:SB-505124处理明显抑制atdc5细胞中CollagenⅡ、Aggrecan的表达,同时上调了Adamts5的表达;阿尔新蓝染色结果提示SB-505124处理明显抑制atdc5细胞中蛋白聚糖的合成。结论利用SB-505124阻断内源性TGF-β信号,可抑制软骨细胞增殖、分化及细胞外基质的合成,同时促进细胞外基质的降解。

关键词：转化生长因子βⅠ型受体 SB-505124 atdc5 细胞增殖细胞外基质

构建FGFR3基因沉默慢病毒载体及其对atdc5细胞增殖和分化的影响

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第三军医大学学报 2013年第11期35卷 1043-1047页

作者：朱莹戚华兵王权王晓凤黄启钊陈林第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室创伤烧伤与复合伤国家重点实验室骨代谢修复中心重庆400042

目的通过构建慢病毒介导的FGFR3RNAi,观察FGFR3对小鼠前软骨细胞系atdc5增殖和分化的影响。方法针对FGFR3基因的有效靶序构建FGFR3RNAi慢病毒载体,并转染293T细胞进行病毒包装。用包装成功的慢病毒转染atdc5细胞,Real-time PCR和Western... 详细信息

目的通过构建慢病毒介导的FGFR3RNAi,观察FGFR3对小鼠前软骨细胞系atdc5增殖和分化的影响。方法针对FGFR3基因的有效靶序构建FGFR3RNAi慢病毒载体,并转染293T细胞进行病毒包装。用包装成功的慢病毒转染atdc5细胞,Real-time PCR和Western blot检测atdc5中FGFR3RNAi效率,细胞计数及MTT检测atdc5的增殖变化,Real-time PCR检测atdc5中软骨分化相关分子Ⅱ型胶原(collagenⅡ,ColⅡ)、Ⅹ型胶原(collagenⅩ,ColⅩ)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的表达与变化。结果FGFR3RNAi慢病毒载体构建成功,并包装出相应的慢病毒,滴度为5×108TU/mL。FGFR3RNAi慢病毒转染atdc5后FGFR3mRNA水平分别较空白组和阴性对照(NC)组下降了65.2%和68.8%(P5,Patdc5细胞中FGFR3基因的表达。FGFR3表达水平降低后对atdc5细胞增殖和分化的抑制作用明显减弱。

关键词： FGFR3 RNAi 慢病毒 atdc5 增殖分化

硫酸氨基葡萄糖对atdc5细胞分化和细胞外基质基因表达的影响

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江苏医药 2011年第8期37卷 880-882页

作者：孙立胜蒋青李建新蒋旭邵振兴史冬泉南京大学附属南京鼓楼医院关节中心 210008 南京大学化学系

目的研究硫酸氨基葡萄糖对软骨细胞株atdc5增殖分化及细胞外基质基因表达的影响。方法将软骨细胞株atdc5分为硫酸氨基葡萄糖组(A组)和空白对照组(B组)。阿利新蓝染色检测蛋白多糖(GAG)含量,碱性磷酸酶染色(ALP)检测碱性磷酸酶活性,逆转... 详细信息

目的研究硫酸氨基葡萄糖对软骨细胞株atdc5增殖分化及细胞外基质基因表达的影响。方法将软骨细胞株atdc5分为硫酸氨基葡萄糖组(A组)和空白对照组(B组)。阿利新蓝染色检测蛋白多糖(GAG)含量,碱性磷酸酶染色(ALP)检测碱性磷酸酶活性,逆转录-聚合酶链反应检测Col2及Smad2、Runx2等。结果硫酸氨基葡萄糖抑制了碱性磷酸酶的活性及Smad2和Runx2基因的表达,促进了GAG的合成与Col2基因的表达。结论硫酸氨基葡萄糖不仅促进软骨基质的合成,同时也影响软骨细胞株atdc5分化。

关键词：硫酸氨基葡萄糖 atdc5 Smad

RASSF1基因与高糖环境对软骨细胞atdc5影响的分子生物学研究

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RASSF1基因与高糖环境对软骨细胞ATDC5影响的分子生物学研究

作者：葛贵喧山西医科大学

学位级别：硕士

第一部分不同糖浓度对atdc5细胞及其RASSF1基因表达的影响目的:探究不同葡萄糖浓度对atdc5细胞的活力和其RASSF1基因表达的影响。方法:(1)通过配置不同浓度的葡萄糖(5.5 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、100mmol/L)培养基处理atdc5细胞... 详细信息

第一部分不同糖浓度对atdc5细胞及其RASSF1基因表达的影响目的:探究不同葡萄糖浓度对atdc5细胞的活力和其RASSF1基因表达的影响。方法:(1)通过配置不同浓度的葡萄糖(5.5 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、100mmol/L)培养基处理atdc5细胞并分别培养24小时、48小时。通过CCK8实验检测不同处理组的atdc5细胞的活力。选取CCK8有差异的时间点作为后续实验的培养时间。(2)通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同葡萄糖浓度处理下培养48小时的atdc5细胞RASSF1蛋白表达情况。结果:结果显示培养24小时各组细胞之间增殖没有明显的差异(P>0.05)。培养48小时后,与5.5 mmol/L葡萄糖处理组细胞相比25mmol/L葡萄糖处理组细胞活力增加明显(P5),50 mmol/L葡萄糖处理组细胞细胞活力降低,差异有统计学意义(P5),100 mmol/L葡萄糖处理组细胞细胞活力降低,差异有统计学意义(P5)。培养48小时后,与5.5 mmol/L葡萄糖处理的atdc5细胞相比,25mmol/L葡萄糖处理的atdc5细胞RASSF1基因蛋白表达水平明显降低(P5),50mmol/L葡萄糖处理的atdc5细胞RASSF1基因蛋白表达水平明显降低(P5)。结论:高浓度的葡萄糖(50mmol/L、100mmol/L)处理atdc5细胞会抑制其活力,高浓度的葡萄糖(25mmol/L、50mmol/L)会处理抑制RASSF1蛋白的表达。第二部分敲低RASSF1基因对软骨细胞atdc5的影响目的:在体外敲低atdc5的RASSF1基因,探讨该基因对软骨细胞增殖、迁移以及对AKT/m TOR及RA信号通路的影响。方法:(1)利用慢病毒感染技术将含有空载体的慢病毒感染atdc5细胞,使用含有2μg/m L的嘌呤霉素完全培养基培养atdc5细胞一周,得到携带空载体稳定感染的atdc5细胞株用于后续实验。使用含有敲减RASSF1基因的慢病毒感染atdc5细胞,使用含有2μg/m L的嘌呤霉素完全培养基培养atdc5细胞一周,得到稳定感染的RASSF1基因敲减atdc5细胞株用于后续实验。(2)96孔板分别培养感染空载的atdc5细胞和感染敲减RASSF1基因的atdc5细胞24小时、48小时、72小时。CCK8测不同时间点细胞增殖情况。(3)划痕实验培养两组细胞24小时、48小时检测敲低RASSF1对atdc5细胞迁移的影响。(4)采用q RT-PCR检测两组细胞RALDH2、CYP26A1、AKT的表达情况。(5)采用Western Blot检测两组细胞AKT、m TOR的表达情况。结果:使用慢病毒成功构建RASSF1敲减稳定株。与NC组相比RASSF1组24小时开始细胞增殖出现明显抑制(P5)。敲低RASSF1抑制atdc5细胞的迁移能力。q RT-PCR显示敲低RASSF1基因会抑制RALDH2、CYP26A1、AKT表达(P5)。Western Blot显示敲低RASSF1会抑制AKT、m TOR磷酸化(P5)。结论:降低RASSF1能够抑制细胞增殖、抑制细胞迁移、抑制细胞RA信号通路、抑制细胞AKT/m-TOR信号通路。

关键词：先天性脊柱侧凸高糖 atdc5 RASSF1

改性氨基葡萄糖诱导atdc5细胞向软骨分化的研究

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改性氨基葡萄糖诱导ATDC5细胞向软骨分化的研究

作者：薛婧晨华南理工大学

学位级别：硕士

软骨一旦损伤很难进行自我修复,因此探寻治疗软骨疾病如骨关节炎的方法显得尤为重要。氨基葡萄糖是健康关节软骨的天然组织成分,是软骨基质中合成蛋白聚糖的重要元素,被广泛用于治疗骨关节炎。但是高浓度的氨基葡萄糖对细胞有毒性,使用... 详细信息

软骨一旦损伤很难进行自我修复,因此探寻治疗软骨疾病如骨关节炎的方法显得尤为重要。氨基葡萄糖是健康关节软骨的天然组织成分,是软骨基质中合成蛋白聚糖的重要元素,被广泛用于治疗骨关节炎。但是高浓度的氨基葡萄糖对细胞有毒性,使用具有生物活性的小分子对氨基葡萄糖中的功能性基团进行改性可以得到具有不同生理特性的小分子化合物,这些化合物相比于氨基葡萄糖,具有更低的细胞毒性和更好的促软骨分化效果。atdc5细胞系是体外研究软骨分化的理想模型,因而本研究使用atdc5细胞系作为软骨分化的工具细胞系来评估新型改性氨基葡萄糖化合物在软骨分化过程中的作用,具体分为以下三个内容:(1)使用前期合成的氨基葡萄糖丙烯酰化衍生物——N-丙烯酰氨基葡萄糖作为软骨分化培养基的添加剂,使用传统micromass方法诱导atdc5细胞向软骨分化。首先通过细胞增殖毒性实验评估了不同浓度的N-丙烯酰氨基葡萄糖对atdc5细胞增殖的影响。然后通过阿利新蓝染色实验、糖胺聚糖定量实验、实时荧光聚合酶链式反应和免疫荧光实验评估了所选浓度的N-丙烯酰氨基葡萄糖对atdc5细胞向软骨分化的影响。结果表明,2mM N-丙烯酰氨基葡萄糖对促进atdc5细胞向软骨分化有着最佳的效果并且优于未进行改性的氨基葡萄糖和广泛应用的N-乙酰氨基葡萄糖。(2)使用前期合成的氨基葡萄糖胆酰化衍生物——胆酰氨基葡萄糖作为软骨分化培养基的添加剂,使用传统micromass方法诱导atdc5细胞向软骨分化。首先通过细胞增殖毒性实验评估了不同浓度的胆氨基葡萄糖对atdc5细胞增殖的影响,初步筛选了胆酰氨基葡萄糖作为软骨分化培养基添加剂的添加浓度。然后通过阿利新蓝染色实验、糖胺聚糖定量实验、实时荧光聚合酶链式反应、免疫蛋白印迹实验和免疫荧光实验评估了所选浓度的胆酰氨基葡萄糖对atdc5细胞向软骨分化的影响。结果表明,1.6 mM胆酰氨基葡萄糖对促进atdc5细胞向软骨分化有着最佳的效果并且优于未进行改性的氨基葡萄糖。(3)基于现有的贴壁培养的micromass方法会造成细胞I型胶原表达过高,从而导致纤维软骨形成的问题,本研究进行了atdc5细胞向软骨分化新方法的探索。将细胞球进行软骨诱导14天后,H&E染色实验可以观察到类似软骨细胞形态的细胞形成;阿利新蓝染色实验可以观察到细胞团中细胞外基质糖胺聚糖的分布情况;实时荧光聚合酶链式反应实验可以检测到软骨相关基因的表达,并且Collagen I基因的表达远低于micromass方法;免疫荧光染色实验可以观察到软骨相关蛋白的阳性区域,证明了这种方法能够成功诱导atdc5细胞向软骨分化。本研究不仅利用琼脂糖本身的特性促进细胞向软骨分化,同时由于悬浮培养可以使I型胶原的表达大幅度降低,从而避免软骨分化过程中纤维软骨的形成。

关键词：软骨分化 N-丙烯酰氨基葡萄糖胆酰氨基葡萄糖悬浮培养 atdc5

氟通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制atdc5细胞增殖和分化

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氟通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制ATDC5细胞增殖和分化

作者：张瑞雪中国医科大学

学位级别：硕士

目的:氟是一种人体必需微量元素,适量氟能够维持机体正常生理功能,过量氟则会引起氟中毒。流行病学调查显示,高氟地区儿童骨龄延迟,身高、体重、胸围均低于正常同龄儿童。本课题组前期动物实验和器官培养实验发现氟通过抑制软骨内成骨... 详细信息

目的:氟是一种人体必需微量元素,适量氟能够维持机体正常生理功能,过量氟则会引起氟中毒。流行病学调查显示,高氟地区儿童骨龄延迟,身高、体重、胸围均低于正常同龄儿童。本课题组前期动物实验和器官培养实验发现氟通过抑制软骨内成骨过程损害长骨纵向生长。软骨内成骨是骨形成的主要方式,此过程受到全身激素、细胞因子和局部产生的信号因子共同作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种广泛存在于生物细胞中的丝氨酸/苏氨酸激酶,是细胞生长、增殖、分化、存活和自噬的中心调控因子。然而,氟是否通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制软骨内成骨尚未见报道。为此,我们通过体外器官培养胚胎大鼠胫骨和体外培养源于畸胎瘤细胞的小鼠软骨发生细胞atdc5细胞模拟软骨细胞分化,观察氟是否通过调控PI3K/AKT/m TOR信号通路抑制软骨细胞的增殖和分化。本研究为阐明氟抑制长骨生长的机制提供线索,为氟骨症的防治提供依据。实验方法:本研究选取胚胎第20天的胎鼠胫骨,采用左右配对的方法分为两组,左侧胫骨为对照组,右侧胫骨为染氟组(10-4M NaF),培养于含0.2%牛血清蛋白、0.05mg/ml Vc、1m Mβ-甘油磷酸钠的α-MEM培养基中。7天后,胫骨经固定、石蜡包埋并切片,免疫组织化学方法检测胫骨PCNA和p-S6的蛋白表达,观察氟对软骨细胞增殖和mTOR活性的影响。atdc5细胞培养于含有5%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素和1?ITS的DMEM培养基中,分别予以染氟3、5、7、14和21天。采用CCK8方法检测atdc5细胞活力并在倒置显微镜下观察细胞形态的变化;阿利新蓝染色检测聚集蛋白多糖(Aggrecan)的合成及软骨结节的形成情况;Western blot和实时荧光定量PCR分别检测软骨细胞分化相关基因(Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X)和PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因(PI3K、AKT、mTOR、S6K1、4EBP1、LC3II/I、Beclin1、P62)的mRNA和蛋白表达,应用m TOR激动剂MHY1485和mTOR抑制剂Rapamycin,探讨PI3K/AKT/mTOR信号通路在氟致软骨损伤中的作用。结果:1.氟对胫骨软骨细胞增殖和m TOR活性的影响:染氟组胫骨中PCNA和p-S6阳性细胞率显著低于对照组,差异具有统计学意义(Patdc5细胞活力及细胞形态的影响:染氟浓度为10-3M时,细胞活力显著低于对照组,差异具有统计学意义(Patdc5细胞分化的影响:在ITS的作用下,atdc5细胞快速增殖融合成单层,融合后的细胞形成软骨结节,软骨结节形态随培养时间增加逐渐扩大,软骨结节数量逐渐增多;对照组细胞阿利新蓝染色强度随培养时间增加而增强,染氟组细胞染色强度低于对照组、软骨结节数量少于对照组;与对照组比较,染氟组细胞Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X mRNA表达和Sox9、Col II蛋白表达均显著下降,差异具有统计学意义(P5)。4.氟对软骨细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响:染氟组细胞mTOR、S6K1和4EBP1 mRNA表达和PI3K、AKT、mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达均显著低于对照组,差异具有统计学意义(P5)。5.氟对atdc5细胞自噬相关基因表达的影响:与对照组相比,染氟组细胞Beclin1和LC3II/LC3I的蛋白表达显著增加,P62蛋表达白显著降低,差异具有统计学意义(P5)。***激动剂MHY1485上调氟抑制的p-mTOR、p-S6K1和p-4EBP1的表达:染氟组细胞中mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达显著低于对照组,mTOR激动剂MHY1485组中细胞mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达显著高于对照组。染氟+m TOR激动剂MHY1485组细胞mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达显著高于染氟组,差异具均有统计学意义(P5)。与对照组相比,染氟+mTOR激动剂MHY1485组细胞中mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达无明显差异,mTOR抑制剂Rapamycin组细胞中mTOR,S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达显著降低,差异具有统计学意义(P5)。7.氟通过抑制mTOR的磷酸化诱导atdc5细胞自噬:与对照组比较,染氟组细胞中P62的蛋白表达显著下调,mTOR激

关键词：氟 atdc5 增殖分化自噬 PI3K/AKT/mTOR信号通路

压应力作用下atdc5细胞早期应答中成软骨分化相关信号通路初探

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压应力作用下ATDC5细胞早期应答中成软骨分化相关信号通路初探

作者：李文昊南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景颞下颌关节(temporomandibularjoint,TMJ)是人体中最精细、也是承力最频繁的关节之一。相应地,在分散咀嚼压力过程中发挥重要作用的髁突软骨即成为关节系统中与力学刺激最密切的结构之一。压力是关节稳定性保持必不可少的生理... 详细信息

研究背景颞下颌关节(temporomandibularjoint,TMJ)是人体中最精细、也是承力最频繁的关节之一。相应地,在分散咀嚼压力过程中发挥重要作用的髁突软骨即成为关节系统中与力学刺激最密切的结构之一。压力是关节稳定性保持必不可少的生理性因素,关节腔内存在适宜的压力有助于维持关节软骨的健康,但是,当压力负荷过大时则极有可能造成关节软骨不可逆的损伤,甚至导致骨关节炎(osteoarthritis,OA)。国内外已有文献证实,应力刺激能够激活前软骨细胞内信号通路并调节成软骨过程,但鲜有研究针对压应力下成软骨分化的早期信号通路激活情况。atdc5细胞系(mouse embryonic tumor cell line)作为一种软骨细胞系,其分化过程与软骨细胞的分化过程相似,可被用于模拟体外成软骨的分化过程。目的本实验试图明确atdc5成软骨性能达到最佳的压应力条件,探究atdc5内参与早期应答反应的相关信号通路激活情况,并筛选出压应力刺激早期应答中参与信号通路调控成软骨功能的关键信号因子。方法1.使用琼脂糖凝胶改良micromass方法,对atdc5细胞进行7 d成软骨诱导,通过阿利辛蓝染色实验检测糖胺聚糖形成情况,通过免疫荧光实验、RT-qPCR和Western Blot检测SOX9、Collagen Ⅱ和Aggrecan等成软骨相关指标的表达。2.使用transwell小室建立成软骨细胞三维培养压应力加载模型,分别对atdc5细胞施加0、1、2、3、4、5g/cm2的压应力(设置0 g/cm2作为对照组),持续时间24 h。细胞胶原块加压后,经FITC标记鬼笔环肽染色后,通过荧光共聚焦显微镜观察atdc5细胞三维培养形态,采用CCK8法检测细胞活性,通过RT-qPCR 和 Western Blot 观察 SOX9、Collagen Ⅱ 和 Aggrecan 等成软骨相关指标的表达情况,筛选出早期应答中的最佳压应力值。3.使用上述已建立的成软骨细胞三维培养压应力加载模型,分别对atdc5细胞施加0、4 g/cm2的压应力(设置0 g/cm2作为对照组),持续作用6 h。通过磷酸化蛋白芯片技术和GO富集分析,检测早期生物应答下MAPK、PI3K-Akt信号通路的蛋白磷酸化表达情况。结果1.使用琼脂糖改良micromass方法可在7d内成功对atdc5细胞进行成软骨诱导,形成成熟的软骨小结;阿利辛蓝染色实验中,胞外基质呈天蓝色;免疫荧光实验中SOX9、Collagen Ⅱ和Aggrecan均呈高表达阳性荧光结果;SOX9、Collagen Ⅱ和Aggrecan在7 d成软骨诱导后,RT-qPCR和Western Blot中呈现时间点一致的高表达同步性。2.对atdc5细胞施加0、1、2、3、4、5 g/cm2的压应力持续24h后,FITC标记鬼笔环肽染色中,atdc5细胞的肌动蛋白着荧光绿色,atdc5细胞在压应力作用下维持相互联接的三维生长模式;CCK8法检测细胞活性实验中,6组间的OD值差异无统计学意义(P>0.05);当对atdc5细胞施加4 g/cm2的压应力持续 24 h 时,SOX9、Collagen Ⅱ 和 Aggrecan 在 RT-qPCR 和 Western Blot 中相较对照组的表达上升最为显著。3.对atdc5细胞施加4 g/cm2压应力持续6 h时,p-MKK6、p-ERK1/2、p-AKT、p-MSK2、p-P70S6k、p-CREB、p-GSK3β、p-HSP27、p-RSK1、p-mTOR、p-p53、p-MEK1、p-p38磷酸化蛋白表达水平高于对照组(foldchange>1.2)。结论1.琼脂糖改良micromass方法可在7d内较好地建立atdc5细胞体外成软骨诱导模型,在mRNA及蛋白质层面均可检测到SOX9、Collagen Ⅱ和Aggrecan的表达。2.本实验中的成软骨细胞压应力加载模型能够维持成软骨细胞的三维培养条件,并且不影响成软骨细胞活性。3.压应力作用下成软骨相关信号通路产生早期应答反应的关键力值是4 g/cm2。4.p-ERK1/2、p-AKT、p-CREB、p-RSK1、p-mTOR、p-p38 是本实验模型中可能参与成软骨适宜压应力下早期生物应答的重要磷酸化蛋白。

关键词：压应力 atdc5 SOX9 Collagen Ⅱ Aggrecan 磷酸化蛋白芯片信号通路

硫酸氨基葡萄糖对atdc5细胞分化与细胞外基质基因表达的影响

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硫酸氨基葡萄糖对ATDC5细胞分化与细胞外基质基因表达的影响

作者：孙立胜南京大学

学位级别：硕士

实验一、硫酸氨基葡萄对软骨细胞侏atdc5细胞增殖分化与细胞外基质基因表达的影响目的：从细胞水平观察硫酸氨基葡萄糖(glucosamine sulfate)对软骨细胞侏atdc5细胞增殖分化及细胞外基质基因表达的影响,为硫酸氨基葡萄糖的临床应用提供... 详细信息

实验一、硫酸氨基葡萄对软骨细胞侏atdc5细胞增殖分化与细胞外基质基因表达的影响目的：从细胞水平观察硫酸氨基葡萄糖(glucosamine sulfate)对软骨细胞侏atdc5细胞增殖分化及细胞外基质基因表达的影响,为硫酸氨基葡萄糖的临床应用提供实验依据。方法：体外培养软骨细胞侏atdc5细胞,将软骨细胞株atdc5分为硫酸氨基葡萄糖组(实验组)和空白对照组(对照组),阿利新蓝染色检测蛋白多糖(glycosaminoglycan, GAG)含量,碱性磷酸酶染色检测碱性磷酸酶活性,逆转录-聚合酶链反应(reverese transcript-polymerase chain rea ction, RT-PCR)检测Col2及Smad2, Runx2等。结果：硫酸氨基葡萄糖抑制了碱性磷酸酶的活性及smad2和runx2基因的表达,促进了蛋白多糖的合成与Col2基因的表达。结论：硫酸氨基葡萄糖不仅促进软骨基质的合成同时影响软骨细胞株atdc5分化。实验二、骨质疏松与GDF5基因多态性的相关性研究目的：观察健康人群和骨质疏松(OP)患者中GDF5基因的基因型分布状况,并且进一步研究GDF5基因单核苷酸多态性与OP患者易感性之间的相关性。方法：选取177名(OP)患者,正常对照组108例,年龄50-80岁口腔拭子并抽提DNA,采用Taqman技术检测GDF5基因上的SNP位点(rs7605378)等位基因、基因型在实验组和对照组中的分布状况,行统计学分析,研究其与骨质疏松(OP)的相关性。结果：比较该位点病例组和对照组基因型构成,两者无显著差异性(P>0.05)。对性别比较也没有发现病例组与对照组的差异性。结论：在中国汉人群中,GDF5基因多态性位点(rs7605378)可能与OP的发病无相关性。

关键词：硫酸氨基葡萄糖 atdc5 smad 骨质疏松 GDF5基因单核苷酸多态性

共培养体系中不同代数的软骨细胞对atdc5细胞软骨分化影响的实验研究

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共培养体系中不同代数的软骨细胞对ATDC5细胞软骨分化影响的实验...

作者：陈汉政广州医科大学

学位级别：硕士

研究目的基于三维共培养体系,将不同代数的猪关节软骨细胞(ACs)转染后与小鼠胚胎瘤细胞(atdc5)包裹在水凝胶中以建立可有效释放生长因子的共培养体系,探索不同代数软骨细胞对生长因子释放的影响规律及共培养体系中atdc5细胞的成软骨分... 详细信息

研究目的基于三维共培养体系,将不同代数的猪关节软骨细胞(ACs)转染后与小鼠胚胎瘤细胞(atdc5)包裹在水凝胶中以建立可有效释放生长因子的共培养体系,探索不同代数软骨细胞对生长因子释放的影响规律及共培养体系中atdc5细胞的成软骨分化效果的影响。方法一、小鼠胚胎瘤细胞与猪软骨细胞的获取及、培养及传代小鼠胚胎瘤细胞购自美国圣地亚哥的百奇生物公司,置于含有atdc5培养液的150cm培养瓶中进行培养。采用酶解法从新鲜猪关节的软骨组织中获取猪软骨细胞,置于软骨培养液中培养至第一代(P1)、第三代(P3)、第五代(P5)以供实验使用。二、观察软骨细胞的形态学特征及检测软骨相关基因的表达情况在软骨细胞体外扩增培养过程中,应用倒置显微镜观察不同代数软骨细胞的形态学变化,实时定量PCR(q-PCR)检测软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和聚集蛋白聚糖(ACAN)基因的表达水平。三、腺病毒转染软骨细胞及构建水凝胶三维共培养体系用携带转化生长因子β3(TGF-β3)基因的重组腺病毒分别转染P1、P3、P5软骨细胞,并在转染后第二天利用荧光显微镜观察病毒转染效果。随后分别取一定数量已转染的软骨细胞并与提前培养好的atdc5细胞按照1:3的比例混合,离心弃上清后用海藻酸钠溶液重悬细胞混合物,在CaCl溶液交联作用下将海藻酸钠/细胞混合液制作成凝胶微球,最后转移至含有软骨诱导液的24孔板进行28天的培养,并将这三组实验组分别命名为P1、P3、P5组。四、检测TGF-β3的释放情况及评估体外软骨分化效果。在规定的时间点收集共培养体系中的培养液,利用Elisa检测培养液中TGF-β3的浓度,并评估不同实验组之间TGF-β3的控释效果。在水凝胶中成软骨诱导过程的第28天,收集实验样本,并利用q-PCR评估相关成软骨特异性基因的表达,同时应用hematoxylin-eosin(HE)染色及免疫组化观察软骨标志蛋白的分泌情况;根据获得的数据,评估体外成软骨效果。结果一、本实验提取的新鲜原代软骨细胞在体外单层培养达到80%融合后传代至P1、P3、P5后使用。在此过程中,原代软骨细胞呈多角度形,传代之后的软骨细胞,细胞形态由多角形向梭形或类椭圆形变化;q-PCR检测软骨相关标志基因的结果显示,P1中的ACAN与ColⅡ基因表达相对较高,随着代数的增加,ACAN与ColⅡ基因表达下降,同时伴随着ColⅠ基因的表达上调,说明软骨细胞出现去分化现象。二、将携带TGF-β3基因的腺病毒感染P1、P3、P5软骨细胞,转染后第二天,利用荧光显微镜观察转染效率,可观察到三组细胞均有明显的荧光表达,转染效率均达到95%,其中P5组荧光强度最高,同时能观察到细胞生长状况良好。三、Elisa实验结果表明,P1、P3、P5三组实验组分泌TGF-β3的趋势是一样的,TGF-β3的分泌水平均在第3天到达最高点,其中峰值最高为P3组,峰值最低为P1组;然后在第6天出现明显的表达下降。在此后的共培养周期(第12天之后),软骨细胞分泌的TGF-β3保持在一个较低的范围。q-PCR结果显示,P5组atdc5细胞成软骨标志物基因(ACAN及ColⅡ)的表达水平高于P1、P3组,而ColⅠ基因在P3组的表达水平最低,P1组最高。而共培养体系中软骨细胞的ACAN及ColⅡ基因水平,P5组表达最低,而ColⅠ的表达水平却最高。HE染色结果显示各组切片样本中均有大量的细胞,成团生长,有软骨细胞的陷窝特征。番红O染色显示糖胺聚糖(GAG)的沉积情况,结果显示三组均有明显的红染区,其中P3组的染色相对淡一些。Ⅱ型胶原染色结果显示,P1、P3组染色较弱,棕褐色区域面积小,而P5组染色相对明显,细胞量及棕褐色区域相对多。结论本研究结果表明,不同代数的软骨细胞对三维共培养体系中atdc5的成软骨分化效果有着不同的影响。其中,P1组软骨细胞的成软骨诱导效果较差,原因可能是和P1组转基因软骨细胞的TGF-β3释放量较低有关,不足以诱导atdc5向软骨分化。相对于P1、P3组,P5组显示出较好的促软骨分化效果。然而在共培养期间P5组软骨细胞的去分化程度是最高的。不过,这些实验数据也进一步验证了构建共培养体系控释TGF-β3的可行性。通过更长时间的扩增可获得更多的P5软骨细胞,一方面可满足软骨组织工程的种子细胞数量的要求。另一方面,去分化程度越高,越接近凋亡的状态,从而可通过控制转染软骨细胞的凋亡来终止TGF-β3的释放,使间充质干细胞(MSCs)处于一个最佳TGF-β3浓度和时间下进行软骨分化,避免过量的TGF-β3对新分化生成的软骨细胞造成肥大、钙化甚至凋亡。

关键词： TGF-β3 atdc5 软骨细胞软骨形成