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asic1a诱导自噬促进酸性微环境刺激的肝癌细胞迁移和侵袭

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ASIC1a诱导自噬促进酸性微环境刺激的肝癌细胞迁移和侵袭

作者：张锦安徽医科大学

学位级别：硕士

近年来,肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)已发展为国内外最常见的癌症之一,肝癌发病率在各种癌症中排名第四,位居世界前列。目前,肝切除术、靶向放化疗等肝癌治疗手段发展较快,但肝癌患者的5年生存率仍然较低,并且其预后较差。因此... 详细信息

近年来,肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)已发展为国内外最常见的癌症之一,肝癌发病率在各种癌症中排名第四,位居世界前列。目前,肝切除术、靶向放化疗等肝癌治疗手段发展较快,但肝癌患者的5年生存率仍然较低,并且其预后较差。因此寻找更加安全有效、提升患者生存质量的治疗肝癌的方法有着重要的意义。肝癌细胞的酸性微环境与肝癌的高转移性密切相关。癌症根据是否能被影像手段检测到可分为实体瘤和非实体瘤,而肝癌作为其中一种实体瘤,由于其迅速增殖可导致耗氧量增加。在氧气不足的情况下,细胞通过糖酵解的代谢方式产生L-乳酸和游离H,于是就形成了p H6.5～p H6.9局部的弱酸性环境,而正常组织的p H为7.3～7.4的范围内。因此肝癌细胞微环境的酸碱性可能会影响肝癌的发生发展进程,为癌细胞的侵袭和转移提供条件。酸敏感离子通道(acid sensing ion channels,asics)是一类可由胞膜外H瞬时激活的阳离子门控通道。作为上皮钠离子通道/退变素家族的一员,其在哺乳动物的肺组织、神经系统、骨细胞等均有大量表达。同时多项研究发现,asics广泛参与多种疾病的发展过程,如肿瘤、血栓栓塞引起的脑部缺血、癫痫和炎症等,这些疾病的共同特征之一就是局部组织酸化。大量研究已报道,asics具有多种亚型,包括asic1、asic2、asic3和asic4。酸敏感离子通道1a(acid-sensing ion channel 1a,asic1a)是asic1的其中一个亚型,Na、Ca等离子可经由asic1a内流从胞外进入胞内,从而影响到细胞内一系列的变化。自噬是细胞对胞质细胞器、蛋白质和大分子的降解从而实现降解产物的循环利用,是一种高度保守的真核细胞循环过程,对细胞的存活和维持起着重要的作用,这一过程的功能障碍导致了许多人类疾病的病理。在一些应激条件下,自噬可被诱导,如内质网应激、饥饿、缺氧及酸化等,但是自噬的过度激活可导致细胞的死亡。肿瘤细胞和自噬之间的关系十分复杂,在肿瘤发生发展的不同阶段,自噬可能起到促进或抑制肿瘤发生发展的双重作用。在不同情况下,细胞自噬不仅可以成为治疗肿瘤的靶点,成为攻克肿瘤的方向,也可帮助癌细胞避免凋亡,成为癌症恶化发展的机制之一。本研究基于课题组前期多年研究肝脏、asic1a及自噬的基础上,通过在酸性环境下培养肝癌细胞Hep G2,研究肿瘤酸性微环境下asic1a对Hep G2细胞侵袭和转移的影响,探究自噬是否参与其中及在肝癌发病过程中的作用。这有助于明确肝癌在酸性微环境下的发病特点,进一步完善相关发病机制研究,为肝癌的预防和治疗提供新的思路。本课题首先采用蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)观察Hep G2细胞在p H7.4和p H6.5的酸性微环境下asic1a蛋白的表达。体外使用asic1a特异性阻断剂Psalmotoxin-1(PcTx-1),阻断asic1a蛋白表达与mRNA的转录,采用Transwell小室侵袭实验和划痕愈合实验观察asic1a对肝癌细胞侵袭和迁移的影响;采用e GFP-m Cherry-LC3双荧光质粒转染观察asic1a对自噬通量的影响;并检测使用自噬抑制剂3-MA抑制自噬的表达,观察自噬对肝癌细胞侵袭和转移的影响,最后通过透射电镜验证酸性环境下阻断asic1a对肝癌细胞中自噬小泡的亚微结构的影响;使用激光共聚焦观察肝癌细胞在瞬时酸刺激的条件下,胞内钙离子的瞬时变化。研究结果发现,在酸性微环境中,WB和qRT-PCR实验结果表明,肝癌细胞中asic1a和自噬相关蛋白Beclin1,LC3II/I的表达显著上调,p62表达下调;Transwell小室侵袭实验和细胞划痕实验结果证明,阻断asic1a可显著抑制肝癌细胞在酸性微环境中的迁移和侵袭;抑制自噬减少肝癌细胞在酸性微环境中的迁移和侵袭;阻断或沉默asic1a可显著抑制酸性微环境刺激的肝癌细胞自噬;asic1a可通过诱导自噬促进酸性微环境诱导的Hep G2细胞迁移和侵袭,这可能与Ca内流有关。综上所述,asic1a可诱导自噬促进酸性微环境刺激的肝癌细胞迁移和侵袭,抑制asic1a和自噬水平可显著延缓肝癌细胞迁移和侵袭的进程,且asic1a加速肝癌细胞侵袭和转移的作用可能与Ca内流有潜在联系。

关键词：酸性微环境肝细胞癌 asic1a 自噬

黄芪丹参配伍调控asic1a/CaMKⅡδ信号抑制酸性微环境中心肌细胞焦亡

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南京中医药大学学报 2023年第2期39卷 138-145页

作者：张蒙王新东南京中医药大学第三临床医学院江苏南京210028 上海中医药大学附属曙光医院上海201203

目的探讨黄芪丹参配伍对乳酸诱导的酸性微环境中心肌细胞焦亡损伤的保护作用及基于酸敏感离子通道1a(asic1a)/钙离子-钙调蛋白依赖性激酶Ⅱδ(CaMKⅡδ)信号通路的调控机制。方法采用Lactate刺激H9C2心肌细胞建立pH 6.5酸性微环境细胞... 详细信息

目的探讨黄芪丹参配伍对乳酸诱导的酸性微环境中心肌细胞焦亡损伤的保护作用及基于酸敏感离子通道1a(asic1a)/钙离子-钙调蛋白依赖性激酶Ⅱδ(CaMKⅡδ)信号通路的调控机制。方法采用Lactate刺激H9C2心肌细胞建立pH 6.5酸性微环境细胞损伤模型。分为正常对照组、模型组、黄芪丹参提取物(HQ)组、HQ+asic激动剂Nocistatin组和asic抑制剂NS383阳性药对照组。采用CCK-8法测定心肌细胞活力,流式细胞术检测心肌细胞凋亡,免疫荧光检测asic1a表达,qPCR分析NLRP3、Caspase-1、IL-1β及GSDMD mRNA表达,Western blot检测asic1a、CaMKⅡδ、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-1、GSDMD及GSDME-N蛋白的表达。结果在pH 6.5酸性环境中,心肌细胞活力显著降低(Pasic1a、CaMKⅡδ、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-1、GSDMD及GSDME-N蛋白表达明显增加(Pasic1a、CaMKⅡδ、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-1、GSDMD及GSDME-N蛋白表达(Pasic激动剂Nocistatin逆转。结论黄芪丹参配伍可下调asic1a/CaMKⅡδ信号抑制酸性微环境下NLRP3炎症小体介导的心肌细胞焦亡。

关键词：黄芪丹参配伍冠心病 asic1a 酸性微环境细胞焦亡

asic1a通过circRNA18-658/miR-127-5p/TRIM72轴促进急性肺损伤

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ASIC1a通过circRNA18-658/miR-127-5p/TRIM72轴促进急性肺损伤

作者：李洋洋安徽医科大学

学位级别：硕士

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是一种严重的呼吸系统疾病,常表现为低氧血症,弥漫性双侧肺浸润,肺水肿,肺应变性减少,功能性残气量减少,肺内分流增加和通气-灌注不平衡。急性肺损伤常累及肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelia... 详细信息

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是一种严重的呼吸系统疾病,常表现为低氧血症,弥漫性双侧肺浸润,肺水肿,肺应变性减少,功能性残气量减少,肺内分流增加和通气-灌注不平衡。急性肺损伤常累及肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cells),急性肺损伤的发生和发展往往伴随着Ⅱ型肺泡上皮细胞的凋亡。酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels,asics)是一种与电压无关的质子门控阳离子通道,在啮齿动物和人类的中枢神经和外周神经中广泛表达。在其众多亚型中,只有asic1a(acid-sensitive ion channel 1a,asic1a)对钙离子具有通透性,因而asic1a成为重要的研究对象。asic1a在酸性环境中被激活以调节酸中毒、炎症、缺氧和缺血等病理生理过程。Circ RNA(circular RNA)是一类以共价封闭环状结构为特征的新型RNA分子,由反向剪接产生。因其闭合成环,故而对核酸外切酶具有抗性,能更稳定的存在于细胞中并不断积累。Circ RNA具有多种作用,其中一个重要作用便是特异性结合mi RNA充当分子海绵,circ RNA还可作为转录调节因子,分子支架和小蛋白质/肽翻译的来源调节多种生理过程。Mi RNA(micro RNA)是内源性的小型(约20-25个核苷酸)非编码RNA,常作为基因表达的负调节因子,因为它们负责其靶m RNA的降解与翻译抑制。单个mi RNA能够通过抑制靶m RNA翻译或促进其降解来调节多个靶基因的表达,从而影响了许多水平的发育途径。因而在疾病的发生、生物发育、表观遗传学和新陈代谢方面起着极其重要的作用。TRIM72(tripartite motif-containing protein 72)是三基序蛋白家族成员之一,在小鼠骨骼和心肌中高度表达,是一种膜修复蛋白。已有研究表明,抑制TRIM72可减轻肺部重症细菌感染,同时,TRIM72可作用于肺泡上皮细胞促进急性肺损伤。此外,TRIM72已被证实参与修复细胞膜损伤。它对多个依赖氧气的器官(如心脏、大脑、肺、肾和肝脏)的缺氧/再灌注损伤有保护效应。重组体人类TRIM72在心肌缺血再灌注损伤、败血症和其他方面也发挥着独特的作用。在省杰青项目资助下,课题组前期研究发现,急性肺损伤常伴随着炎症反应,炎症部位的p H值会降低,asic1a可以感知到这种变化,进而影响急性肺损伤,但其具体的作用机制如何目前尚不明确,circ RNA作为一种重要的非编码RNA,在急性肺损伤中又有怎样的作用?asic1a是否通过circ RNA影响急性肺损伤?因而,我们设计了实验进行了探究。本课题从动物和细胞分子水平上,研究了asic1a在急性肺损伤中的作用并对其可能的作用机制进行了探究,同时,对ALI大鼠肺组织进行了高通量测序,发现并验证了circ RNA18-658/mi R-127-5p/TRIM72轴对急性肺损伤的作用,为急性肺损伤的机制研究以及新药的开发提供新的靶点和思路。主要研究内容概括如下:1、ALI大鼠中asic1a与凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3)的表达变化本课题通过气管内滴注LPS(5mg/kg)构建大鼠急性肺损伤模型,使用TUNEL染色观察各组大鼠肺组织凋亡情况,各组大鼠肺组织的病理学变化情况则通过HE染色观察,并观察各组大鼠的血气分析结果以及干湿重比。结果显示:HE染色显示LPS诱导的肺组织结构破坏和腔内炎症细胞浸润。TUNEL染色结果显示Pc Tx-1抑制asic1a可缓解急性肺损伤的核DNA碎片症状。干/湿重量比还显示,asic1a阻断剂Pc Tx-1可以缓解肺水肿。动脉血气分析显示,Pc Tx-1可提高动脉氧分压(PO),降低动脉二氧化碳分压(Pa CO)和p H,缓解肺功能障碍。进一步采用免疫组化、western blot和免疫荧光方法检测肺组织中线粒体凋亡相关蛋白与asic1a的表达。结果显示,Bax、Cleaved caspase-3、asic1a在急性肺损伤组(ALI组)表达增加,asic1a抑制组(Pc Tx-1组)表达减少,Bcl-2在ALI组表达减少,Pc Tx-1组表达增加。使用q RT-PCR检测肺组织中Bcl-2、asic1a、Bax的信使RNA的表达水平,结果与蛋白质的结果一致。2、LPS诱导的细胞模型中asic1a与凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3)的表达变化在肺泡上皮细胞RLE-6TN培养皿中按10μg/m L浓度给予LPS刺激24h诱导急性肺损伤体外细胞模型。asic1a抑制组在加入LPS前24h滴加Pc Tx-1(100ng/m L)阻断asic1a。采用免疫荧光、WB和q RT-PCR检测各组细胞Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3和

关键词：急性肺损伤 asic1a circRNA miRNA TRIM72 凋亡 PcTx-1 肺泡Ⅱ型上皮细胞

酸敏感离子通道asic1a通过Wnt/β-catenin通路调控类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞增殖

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酸敏感离子通道ASIC1a通过Wnt/β-catenin通路调控类风湿性关节炎...

作者：卢铮安徽医科大学

学位级别：硕士

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以中晚期滑膜增生和进行性关节破坏为特征的慢性自身免疫性疾病。活化的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASF)的增殖是滑膜增生和骨破坏的直接原因。我们之前的研究发现酸敏感离子通道1a(asic1a)调... 详细信息

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以中晚期滑膜增生和进行性关节破坏为特征的慢性自身免疫性疾病。活化的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASF)的增殖是滑膜增生和骨破坏的直接原因。我们之前的研究发现酸敏感离子通道1a(asic1a)调控RASF活化以响应细胞外酸性微环境。然而,asic1a在RASF增殖中的作用仍不清楚。本文在体内和体外研究了asic1a对RASF增殖的影响及其分子机制。我们发现asic1a在p H 6.0酸性环境中促进RASF的增殖,并在佐剂性关节炎(AA)大鼠中被阻断时减少大鼠滑膜增生和骨损伤。asic1a在p H 6.0的酸性环境中激活典型的Wnt/β-catenin信号通路,从而上调原癌基因c-Myc的表达并介导RASF的增殖。综上所述,本研究揭示了asic1a作为一种酸敏感离子通道,通过Wnt/β-catenin/c-Myc通路促进RASF增殖,提示asic1a可能是RA潜在的治疗靶点。目的:本研究旨在探讨酸活化的asic1a对RASF增殖的作用,并探讨其在RA中的病理生理意义。方法:1.体外酸刺激对RASF增殖的影响给予RASF不同时间点体外p H 6.0酸刺激,采用Ed U、CCK-8以及细胞生长曲线来探究RASF增殖现象。利用Western blotting检测增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达水平。2.asic1a在人类风湿性关节炎滑膜组织中的表达使用Western blotting及q-PCR实验对人类风湿性关节炎滑膜组织与人正常滑膜组织中asic1a的表达量进行探究。利用流式细胞术对提取分离的细胞进行鉴定。3.酸刺激激活asic1a对RASF增殖的作用使用asic1a-si RNA或慢病毒来将RASF中的asic1a基因沉默或过表达,通过western blotting和q-PCR分析asic1a的表达水平,检测沉默或过表达效果。采用Western blotting检测对照组、加酸刺激组、沉默asic1a组、过表达asic1a组、asic1a特异性抑制剂(Pc Tx-1)组中asic1a、PCNA的蛋白表达水平。利用Ed U细胞增殖实验探究不同处理下RASF的增殖变化。4.Wnt/β-catenin通路在asic1a调控的RASF增殖中的作用使用Western blotting、q-PCR、免疫荧光实验探究各组中Wnt/β-catenin通路的靶基因β-catenin和c-Myc蛋白表达。利用Western blotting、免疫荧光实验探究体外酸刺激对β-catenin核积累的影响。进一步的实验中,采用Wnt/β-catenin通路抑制剂(xav939)来处理RASF,通过Western blotting、q-PCR、免疫荧光实验探究β-catenin、c-Myc以及PCNA的表达水平。利用Ed U细胞增殖实验探究不同处理下RASF的增殖变化。5.阻断asic1a通道对AA大鼠体内滑膜组织增殖的影响构建佐剂型关节炎AA大鼠,注射Pc Tx-1后,检测大鼠体重变化、足肿胀度、并利用关节炎评分细则对AA大鼠关节炎症进行评分。采用HE染色、甲苯胺蓝染色、免疫组化实验探究asic1a通道阻断后,AA大鼠体内滑膜组织的增殖状况。结果:1.体外p H 6.0酸刺激促进RASF增殖;2.asic1a在类风湿性关节炎滑膜组织内表达较人正常滑膜组织高;3.酸刺激可以通过激活asic1a调控RASF增殖,沉默或过表达asic1a后,细胞增殖指标蛋白PCNA表达水平明显下调或上调,RASF生长能力也随之减弱或增加。4.asic1a表达减少或增加后,Wnt/β-catenin通路靶基因β-catenin和c-Myc的表达随之减少或增加。使用Wnt/β-catenin通路抑制剂后,体外酸化诱导的RASF增殖现象减少。5.阻断asic1a通道抑制AA大鼠滑膜组织增殖。结论:1.酸化微环境诱导RASF增殖2.酸感受器asic1a通过调控Wnt/β-catenin/c-Myc通路促进RASF增殖。

关键词：类风湿关节炎 asic1a 滑膜增生 Wnt/β-catenin通路

雌激素拮抗asic1a诱导的软骨细胞线粒体应激在类风湿关节炎中的作用及机制研究

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雌激素拮抗ASIC1a诱导的软骨细胞线粒体应激在类风湿关节炎中的作...

作者：宰卓妍安徽医科大学

学位级别：硕士

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种病因未明的慢性,全身性,自身免疫性疾病,其发病率与性别差异有关。女性在绝经后达到RA发病率的高峰,而排卵后可以暂时缓解RA疾病症状,提示雌激素水平的变化可能在RA的发生发展中起关键作用... 详细信息

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种病因未明的慢性,全身性,自身免疫性疾病,其发病率与性别差异有关。女性在绝经后达到RA发病率的高峰,而排卵后可以暂时缓解RA疾病症状,提示雌激素水平的变化可能在RA的发生发展中起关键作用。前期研究表明,软骨细胞死亡导致的关节软骨和骨骼的破坏是引起RA关节功能障碍的主要原因,并且组织酸化是导致软骨细胞死亡的重要因素。酸敏感离子通道1a(Acid-sensing ion channel 1a,asic1a)是一种响应于细胞外酸化信号,进而介导钙离子内流,最终导致软骨细胞和组织损伤的重要离子通道。课题组前期研究成果表明雌激素通过自噬溶酶体途径诱导asic1a蛋白降解,保护软骨细胞免受酸中毒的影响,进而起到保护关节软骨的作用。在病理条件下,钙离子超载可引起线粒体应激介导细胞死亡和组织损伤,但钙离子在RA中的潜在功能尚不清楚。目的:本研究主要阐明asic1a引起的软骨损伤过程中是否会发生线粒体应激,以及雌激素是否可以通过调控asic1a功能来拮抗线粒体应激,旨在为RA的发病机制和治疗策略提供新见解。方法:1.asic1a激活对线粒体应激的影响采用p H 6.0酸溶液分别刺激软骨细胞不同时间(0 h,45 min,1.5 h,3 h,6h,12 h),实时定量PCR(Real-time quantification-polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测酸刺激激活asic1a对线粒体应激蛋白HSP10,LONP1,Clp P m RNA水平的影响,免疫荧光法检测asic1a激活对线粒体应激蛋白HSP10和LONP1的荧光水平影响。应用JC-1试剂盒检测asic1a激活对线粒体膜电位的影响,靶向线粒体活性氧(Mitochondrial Reactive oxygen species,mt ROS)荧光探针检测线粒体ROS水平变化。最后用透射电镜观察酸刺激对线粒体形态的影响。采用asic1a特异性抑制剂狼蛛毒素(Psalmotoxin-1,Pc Tx-1)预处理细胞后加酸刺激6 h。免疫荧光检测抑制asic1a活性后线粒体应激蛋白表达情况,激光共聚焦检测线粒体膜电位和mt ROS,透射电镜观察线粒体形态。2.asic1a激活介导的钙离子内流对线粒体应激的影响用p H 6.0酸溶液分别刺激软骨细胞不同时间(0 h,45 min,1.5 h,3 h,6 h,12 h),用Fura-3/AM探针检测Ca水平。用钙离子螯合剂乙二醇四乙酸(Ethylene Glycol Tetraacetic Acid,EGTA)处理软骨细胞,RT-q PCR和免疫荧光分别检测阻断细胞外Ca内流后胞内线粒体应激蛋白HSP10,LONP1,Clp P的m RNA和荧光水平变化,激光共聚焦检测线粒体膜电位和mt ROS释放量变化。3.雌激素对asic1a功能的影响Western blot检测雌激素在不同时间下(0 h,12 h,24 h,36 h,48 h,72 h)对asic1a蛋白表达的影响。接下来将细胞分为对照组,p H 6.0组,雌激素+p H6.0组,Pc Tx-1+p H 6.0组,用免疫荧光检测asic1a荧光水平,Fura-3/AM探针标记细胞内Ca后观察Ca水平变化。4.雌激素对asic1a介导的线粒体应激的影响分别使用雌激素和Pc Tx-1处理大鼠关节软骨细胞,RT-q PCR检测线粒体应激蛋白HSP10,LONP1,Clp P m RNA水平。用雌激素预处理细胞48 h后用p H 6.0酸刺激6 h,免疫荧光检测线粒体应激蛋白HSP10,LONP1,Clp P荧光水平,激光共聚焦检测mt ROS和线粒体膜电位水平,透射电子显微镜观察雌激素对线粒体形态改变的作用。5.雌激素对AA大鼠关节软骨的保护作用将雌性SD大鼠进行卵巢摘除手术后分为以下几组:正常组,AA模型组,雌激素给药组(低剂量:0.1 mg/kg;中剂量:0.2 mg/kg;高剂量:0.3 mg/kg),阳性药曲安奈德组(Triamcinolone acetonide,TA)组。另外假手术组只对卵巢周围脂肪组织进行摘除。采用苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin,HE)法观察大鼠关节组织病理学病变,甲苯胺蓝对关节进行染色,用玻片扫描仪观察大鼠软骨损伤情况。免疫组织化学法检测线粒体应激蛋白(HSP10,LONP1,Clp P)表达情况。结果:1.asic1a激活对线粒体应激的影响与正常大鼠关节软骨细胞相比,酸刺激导致线粒体应激蛋白m RNA和荧光水平上升,线粒体膜电位下降,mt ROS释放量增加,此外线粒体逐渐出现肿胀、嵴断裂破坏、膜破坏等一些结构损伤。抑制asic1a活性可以明显降低线粒体应激蛋白由于酸刺激导致的表达升高现象,并翻转酸刺激导致的线粒体膜电位下降现象,使mt

关键词：类风湿关节炎线粒体应激雌激素 asic1a 钙离子

asic1a和TASKs在大鼠癫痫持续状态模型中的作用

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神经解剖学杂志 2020年第3期36卷 283-288页

作者：李凤珍介崇崇韩文静柴晓燕李杰新乡医学院第一临床学院卫辉453100 新乡医学院第一附属医院神经内科卫辉453100

目的:探讨酸敏感离子通道1a(asic1a)、弱内向整流钾通道相关的酸敏感钾通道1和3(TASK-1和TASK-3)在大鼠癫痫持续状态(SE)中的表达及其在癫痫持续状态中的作用.方法:成年雄性SD大鼠随机分为对照组(control)和SE组,应用氯化锂-匹罗卡品诱... 详细信息

目的:探讨酸敏感离子通道1a(asic1a)、弱内向整流钾通道相关的酸敏感钾通道1和3(TASK-1和TASK-3)在大鼠癫痫持续状态(SE)中的表达及其在癫痫持续状态中的作用.方法:成年雄性SD大鼠随机分为对照组(control)和SE组,应用氯化锂-匹罗卡品诱导SE模型,采用real time RT-PCR和Western Blot技术分别检测海马组织asic1a、TASK-1和TASK-3在SE后0、1、2和3 h mRNA、蛋白表达水平,应用膜片钳技术观察SE后asic1a、TASK-1和TASK-3对海马CA1区锥体神经元兴奋性的影响.结果:在mRNA水平,与control组相比,SE组asic1a在2和3h、TASK-1在1h、TASK-3在3h时间点表达显著减少.在蛋白水平,与control组相比,SE组asic1a、TASK-1和TASK-3在3h时间点表达均显著降低.与SE control组相比,给予asic1a抑制剂后动作电位(AP)的频率明显降低,给予TASK-1和TASK-3抑制剂后,AP的频率均显著增加.结论:SE后大鼠海马区asic1a、TASK-1和TASK-3表达下调,且asic1a、TASK-1和TASK-3改变了海马CA1区锥体神经元的兴奋性,参与了SE的发生过程.

关键词：癫痫癫痫持续状态 asic1a TASK-1 TASK-3 大鼠

asic1a通过Ca2+/Rac1信号通路调控类风湿关节炎滑膜侵袭的作用及其机制的研究

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ASIC1a通过Ca2+/Rac1信号通路调控类风湿关节炎滑膜侵袭的作用及...

作者：牛若雯安徽医科大学

学位级别：硕士

类风湿关节炎(RA)是一种原因不明的慢性自身免疫性疾病,主要影响关节并最终导致其破坏。现在,位于滑膜边缘的RA成纤维样滑膜细胞(RA-FLSs)被认为是RA病理生理过程的关键参与者,研究表明RA-FLSs与肿瘤细胞具有许多相似的特性,包括不受接... 详细信息

类风湿关节炎(RA)是一种原因不明的慢性自身免疫性疾病,主要影响关节并最终导致其破坏。现在,位于滑膜边缘的RA成纤维样滑膜细胞(RA-FLSs)被认为是RA病理生理过程的关键参与者,研究表明RA-FLSs与肿瘤细胞具有许多相似的特性,包括不受接触抑制的过度增殖,及其对软骨的迁移和侵袭能力。酸敏感离子通道(asics)作为细胞外酸性PH的关键受体,在各种炎症,缺血,缺氧,肿瘤等疾病中具有不同的表达,并且与疾病潜在的发病机制有关。诸多研究表明asic1a参与了肝癌,胃癌等肿瘤细胞的迁移和侵袭。因此,我们旨在探索asic1a是否也参与了类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLSs)这种类肿瘤细胞的迁移和侵袭,从而造成软骨和骨质破坏。目的:本课题通过检测在RA-FLSs以及佐剂性关节炎(AA)大鼠中asic1a的表达情况,从而探讨asic1a是否调控类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLSs)迁移和侵袭从而导致滑膜对关节软骨的侵袭性破坏,以及酸化激活asic1a是否是通过介导Ca内流从而活化Rac1信号,进而促进RA-FLSs迁移和侵袭。方法:采用免疫组化法检测asic1a在RA患者和正常人滑膜组织中的表达水平。采用Western blot法,免疫荧光法,q RT-PCR检测asic1a在RA滑膜成纤维细胞和正常人滑膜成纤维细胞中的表达情况。采用弗氏佐剂建立佐剂性关节炎AA大鼠模型,处理组的AA组在造模成功后第14天注射asic1a的特异性阻断剂PCTX-1或阳性药醋酸曲安奈德(1mg/kg)或PBS,采用HE染色,甲苯胺蓝染色法观察大鼠关节处滑膜增生,浸润,侵袭软骨现象,Western blot和免疫组化检测大鼠关节滑膜中迁移和侵袭相关基因的表达。使用asic1a sh RNA的慢病毒质粒转染RA-FLSs,构建asic1a基因沉默组以及过表达组。用q RT-PCR,western blot和ELISA法评估不同PH下和asic1a-RNAi或过表达asic1a转染的RA-FLSs中靶基因和蛋白的表达。通过划痕和transwell法检测不同组别中RA-FLSs迁移和侵袭能力。将RA-FLSs分为对照组,PH6.0酸化组以及PCTX-1+PH6.0酸化组。分别使用钙离子荧光探针Fluo-3 AM标记每组RA-FLSs中的钙离子,采用激光共聚焦显微镜观察细胞中钙荧光强度变化。将RA-FLSs分为PH7.4,PH6.0和PH6.0+asic1a-RNAi或过表达asic1a组。再使用Rac1活性检测试剂盒检测RA-FLSs中Rac1的活性。在BAPTA-AM螯合细胞内钙离子后,检测RA-FLSs中Rac1的活性变化。采用Rac1特异性抑制剂NSC23766抑制Rac1活性后用q RT-PCR,western blot和ELISA法评估不同PH下和asic1a-RNAi或过表达asic1a转染的RA-FLSs中靶基因和蛋白的表达,通过划痕和transwell法检测细胞迁移和侵袭。结果:我们的结果显示asic1a在RA滑膜组织和RA-FLSs中高表达。PCTX-1对asic1a的抑制作用可降低滑膜侵袭,并能保护AA大鼠关节软骨,降低MMP2,MMP9,p-FAK的表达。此外,asic1a-RNAi和PCTX-1抑制asic1a后,酸诱导的RA-FLSs的侵袭和迁移降低,而过表达-asic1a则使之升高。MMP2,MMP9,p-FAK的表达也与此相一致。asic1a介导Ca内流和Rac1的激活,而胞内钙螯合剂BAPTA-AM降低Rac1的活性。同时,Rac1特异性阻断剂NSC23766抑制了RA-FLSs的迁移侵袭以及MMP2,MMP9,p-FAK的表达。总之,这项研究表明asic1a可能是通过Ca/Rac1途径引起的滑膜侵袭的主要调节因子。结论:1.asic1a能够调控RA-FLSs的迁移和侵袭。2.asic1a通过Ca/Rac1信号通路调控RA-FLSs的迁移和侵袭。

关键词： asic1a 类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞迁移侵袭

asic1a敲除下调小鼠M2型巨噬细胞极化的机制研究

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ASIC1a敲除下调小鼠M2型巨噬细胞极化的机制研究

作者：吴娜明华中科技大学

学位级别：硕士

研究背景:酸敏感离子通道(acid-sensing ion channel,asic)是由至少5个基因(ACCN1-5)选择性剪切表达的产物,目前已发现有7种不同蛋白表达(asic1a、asic1b、asic2a、asic2b、asic3、asic4及asic5)。近年来,asic的研究有了很大的进展,尤其是asic1a的研究,asic1a(acid-sensitive ion channel 1a)除广泛表达于中枢、周围神经系统神经元上,亦表达于巨噬细胞(macrophage)、树突状细胞(DC)等免疫细胞。asic1a属于H门控上皮钠通道家族,酸中毒可激活此通道,导致胞外Na内流及其他生物学效应,在多种生理、病理生理过程中起着至关重要的作用。巨噬细胞活化成M2的过程中,除了细胞因子、膜表面分子及功能相关蛋白表达变化外,其胞内合成代谢、分解代谢和获得ATP的方式等也通过代谢再编程(metabolic reprogramming)发生调整。组织微环境可以影响巨噬细胞极化;巨噬细胞极化过程中,可通过代谢途径再编程适应不同的活化状态。代谢途径再编程过程偏转,亦可反过来影响巨噬细胞极化。ATP是所有活细胞的主要能量来源。线粒体内膜上的ATP合酶利用跨线粒体膜质子(H)动力势合成ATP,部分细菌、古细菌等低等生物则通过其细胞膜上的ATP合酶,利用跨细胞膜Na动力势合成ATP。生理条件下,高等生物细胞胞外Na浓度高达145m M,胞内Na浓度仅12m M,形成跨膜Na浓度梯度。但部分厌氧菌(如酒石酸泥杆菌、温和生丙酸菌、伍氏醋杆状菌、争论梭状芽孢杆菌等)和一些病原菌(如霍乱弧菌、沙眼衣原体、流感嗜血杆菌等)与此相反,其钠泵偶联脱羧酶等,其脱羧反应等产生的自由能将胞内Na泵至胞外形成内低外高的Na动力势供能给ATP合酶。尽管高、低等生物ATP合酶结构、功能有差异,但高等生物胞内Na浓度变化是否通过某种机制影响ATP合酶活性;又是否、如何影响其细胞(如小鼠巨噬细胞)合成ATP均有待深入研究。利用多种钠离子通道和转运蛋白协同,才能既保证细胞所需的适度Na内流(如VGSC、ENa C、asic等通道开放导致的胞内Na浓度升高),又能随后将胞内Na浓度逐渐恢复至正常水平(如Na/K-ATP酶可按泵出3个Na、偶联摄入2个K的方式跨膜转运离子,降低胞内Na浓度直至恢复稳态)。最近有研究表明,单纯微环境中的高Na浓度就可诱导巨噬细胞活化为M2,从而促进肿瘤生长。而生理、病理生理情况下,正常胞内Na浓度变化程序(Na内流及随后的向胞外转运)受影响后,是否、如何影响巨噬细胞极化;是否、如何通过影响ATP的生成而影响其极化;尚未有研究。本课题组前期研究发现,asic1a缺失下调M2型巨噬细胞极化,但具体机制不明。由其开放后,通过介导Na内流升高胞内Na浓度的通道特性推论,巨噬细胞极化过程中可能也伴随着胞内Na浓度升高的过程;阻断或减弱其他类似钠离子内流通道,可能有类似于asic1a缺失后的下调效应。在asic1a小鼠的基础上,我们还选取小鼠巨噬细胞表达的Na1.5、Na1.6为靶点,用阻断剂TTX和激动剂VTD验证Na内流参与巨噬细胞极化。研究目的:asic1a缺失对小鼠M2型巨噬细胞极化的影响及其机制研究。研究方法:取WT与asic1a小鼠诱导BMM与PM,IL-4刺激24h分别诱导M2型BMM与PM:检测M2型巨噬细胞相关分子、STAT6磷酸化水平、电子传递链、ATP含量、线粒体膜电位、ATP合酶活性及蛋白表达、胞外Na内流等。皮下注射B16细胞建立asic1a小鼠黑色素瘤模型,2周后记录肿瘤体积,免疫荧光检测浸润的巨噬细胞。进一步干预Na内流后检测巨噬细胞相关分子及ATP含量。研究结果:1)asic1a下调M2型巨噬细胞极化,但不影响STAT6磷酸化。asic1aM2型巨噬细胞极化过程中胞外Na内流减少,进一步影响ATP合酶使其活性下降,胞内ATP含量减少,并下调M2极化,而线粒体膜电位及电子传递链无明显变化。2)asic1a减缓黑色素瘤小鼠肿瘤生长,浸润的巨噬细胞也有所减少。3)用TTX特异性阻断Na介导的Na内流后发现,巨噬细胞胞内ATP含量减少,并下调M2极化,但上调M1极化;用VTD特异性激活Na介导的Na内流后发现,巨噬细胞胞内ATP含量增加,并上调M2极化,与之相反,VTD下调M1极化。

关键词： asic1a ATP Na+ 巨噬细胞

asic1a通过调控Ca2+/PI3K/AKT信号通路诱导人肝癌耐药

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ASIC1a通过调控Ca2+/PI3K/AKT信号通路诱导人肝癌耐药

作者：张医浩安徽医科大学

学位级别：硕士

肝癌(HCC)是在临床中最为常见的恶性肿瘤之一。在中国,肝癌的形势十分严峻,其发病人数和死亡人数均位列世界首位。目前临床上的肝癌治疗方式有手术治疗、介入治疗、化疗、放疗等,但由于早期肝癌没有明显症状,多数患者不能及时察觉就医,... 详细信息

肝癌(HCC)是在临床中最为常见的恶性肿瘤之一。在中国,肝癌的形势十分严峻,其发病人数和死亡人数均位列世界首位。目前临床上的肝癌治疗方式有手术治疗、介入治疗、化疗、放疗等,但由于早期肝癌没有明显症状,多数患者不能及时察觉就医,当确诊时病情已经发展为中晚期肝癌,错过了进行手术治疗的时机,此时化疗为主要治疗手段。目前,肝癌对化疗药物已经出现严重的耐药现象,造成肝癌化疗效果不理想。肝癌化疗时,必须预防和逆转肝癌耐药,但目前仍然没有有效预防和逆转肝癌耐药的手段。因此阐明肝癌耐药的机制,寻找有效的干预靶点以提供有效的干预手段,是提高肝癌化疗效果的关键。肿瘤细胞外酸性微环境是实体瘤的主要特征之一,这是由于肿瘤组织缺氧和血流灌注不足、肿瘤细胞高水平的糖酵解引起的。已有研究发现,肿瘤细胞外酸性微环境能够介导肿瘤耐药。但是,这种酸性信号如何传递到细胞内,又如何介导肿瘤耐药呢?asic1a是酸敏感离子通道(asics)的一个亚基,其作为细胞膜上的酸感受器,在细胞外酸性环境中被激活,进而将细胞外低pH值的信号传递到细胞内。已有研究发现,asic1a能够紧密参与到肿瘤的发生发展过程。那么,肿瘤细胞外酸性微环境是否是通过激活asic1a,从而将酸性信号传递到细胞内,进一步介导肝癌耐药呢?因此,本课题组探究肿瘤细胞外酸性微环境是否通过激活asic1a介导肝癌耐药及其机制。目的:本实验采用两种人肝癌耐药细胞株bel7402/fu,hepg2/adm以及人肝癌组织,检测asic1a在肝癌耐药细胞以及人肝癌组织中的表达情况,进一步探讨在酸性环境中,asic1a是否介导肝癌耐药,以及asic1a是否通过介导ca2+内流激活pi3k/akt信号通路,进而诱导肝癌耐药。方法:1.采用westernblotting法检测asic1a在8对癌旁组织和人肝癌组织中的表达水平。2.采用westernblotting法检测asic1a在人肝癌耐药细胞bel7402/fu和hepg2/adm中的表达情况。3.采用mtt法分别检测人肝癌耐药细胞bel7402/fu对5-fu的耐药性以及人肝癌耐药细胞hepg2/adm对阿霉素的耐药性。4.使用25、100、400μΜ阿米洛利抑制asic1a,作用3、6、12、24、48h后,采用mtt法分别检测人肝癌耐药细胞bel7402/fu对5-fu的化学敏感性以及人肝癌耐药细胞hepg2/adm对阿霉素的化学敏感性。5.使用25、100、400μΜ阿米洛利抑制asic1a,作用24、48h后,采用集落形成分析分别检测人肝癌耐药细胞bel7402/fu对5-fu的化学敏感性以及人肝癌耐药细胞hepg2/adm对阿霉素的化学敏感性。6.使用携带asic1ashrna的慢病毒感染人肝癌耐药细胞bel7402/fu和hepg2/adm,构建asic1a基因沉默株。随后采用westernblotting法检测慢病毒感染后的人肝癌耐药细胞bel7402/fu和hepg2/adm中asic1a的表达情况,以筛选构建成功的沉默株。7.采用mtt法分别检测人肝癌耐药细胞bel7402/fu-shrna对5-fu的化学敏感性以及人肝癌耐药细胞hepg2/adm-shrna对阿霉素的化学敏感性。8.使用25、100、400μΜ阿米洛利处理bel7402/fu-shrna和hepg2/adm-shrna细胞,作用24、48h后,采用mtt法分别检测bel7402/fu-shrna对5-fu的化学敏感性和hepg2/adm-shrna对阿霉素的化学敏感性。9.使用携带asic1a基因的慢病毒感染人肝癌细胞bel7402和hepg2,构建asic1a基因过表达株。随后采用westernblotting法检测慢病毒感染后的人肝癌细胞bel7402和hepg2中asic1a的表达情况,以筛选构建成功的过表达株。10.采用mtt法分别检测人肝癌细胞bel7402-asic1a对5-fu的化学敏感性以及人肝癌细胞hepg2-asic1a对阿霉素的化学敏感性。11.使用25、100、400μΜ阿米洛利处理bel7402-asic1a和hepg2-asic1a细胞,作用24、48h后,采用mtt法分别检测bel7402-asic1a对5-fu的化学敏感性和hepg2-asic1a对阿霉素的化学敏感性。12.使用钙离子荧光探针fluo-3am标记人肝癌耐药细胞bel7402/fu和hepg2/adm中的钙离子,随后采用流式细胞术检测细胞内的钙离子水平。13.使用钙离子荧光探针fluo-3am标记人肝癌耐药细胞bel7402/fu和hepg2/adm中的钙离子,随后应用激光共聚焦显微镜检测asic1a是否介导钙离子内流。14.采用westernblotting法检测bel7402/fu-shrna和hepg2/adm-shrna细胞中pi3k和p-akt的表达情况。15.采用w

关键词： asic1a 肝癌耐药