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asf1a-dependent P300-mediated histone H3 lysine 18 lactylation promotes atherosclerosis by regulating EndMT

Acta Pharmaceutica Sinica B 2024年第7期14卷 3027-3048页

作者： Mengdie Dong Yunjia Zhang Minghong Chen Yongkang Tan Jiao Min Xian He Fuhao Liu Jiaming Gu Hong Jiang Longbin Zheng Jiajing Chen Quanwen Yin Xuesong Li Xiang Chen Yongfeng Shao Yong Ji Hongshan Chen Department of Cardiovascular Surgery the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical Universityand Key Laboratory of Cardiovascular and Cerebrovascular MedicineSchool of PharmacyNational Vaccine Innovation PlatformNanjing Medical UniversityNanjing 211166China Key Laboratory of Cardiovascular and Cerebrovascular Medicine School of PharmacyNanjing Medical UniversityNanjing 211166China Department of Clinical Medicine Nanjing Medical University TIANYUAN Honors SchoolNanjing Medical UniversityNanjing 211166China Department of Anesthesiology Sir Run Run HospitalNanjing Medical UniversityNanjing 211166China Department of Cardiovascular Surgery the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical UniversityNanjing 211166China Key Laboratory of Cardiovascular and Cerebrovascular Medicine Key Laboratory of Targeted Intervention of Cardiovascular DiseaseCollaborative Innovation Center for Cardiovascular Disease Translational MedicineState Key Laboratory of Reproductive MedicineSchool of Pharmacythe Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical UniversityGusu SchoolNanjing Medical UniversityNanjing 211166China National Key Laboratory of Frigid Zone Cardiovascular Diseases(NKLFZCD) Department of Pharmacology(State-Province Key Laboratories of Biomedicine-Pharmaceutics of China)College of PharmacyKey Laboratory of Cardiovascular Medicine Research and Key Laboratory of Myocardial IschemiaChinese Ministry of EducationNHC Key Laboratory of Cell Transplantationthe Central Laboratory of the First Affiliated HospitalHarbin Medical UniversityHarbin 150081China Key Laboratory of Targeted Intervention of Cardiovascular Disease Collaborative Innovation Center for Cardiovascular Disease Translational MedicineNanjing Medical UniversityNanjing 211166China Department of Cardiology Huai’an First People’s Hospital Affiliated with Nanjing Medical UniversityHuai’an 223399China

Endothelial-to-mesenchymal transition(EndMT)is a key driver of *** glycolysis is increased in the endothelium of atheroprone areas,accompanied by elevated lactate *** lactylation,mediated by lactate,can regulate gene expression and participate in disease ***,whether histone lactylation is involved in atherosclerosis remains ***,we report that lipid peroxidation could lead to EndMT-induced atherosclerosis by increasing lactatedependent histone H3 lysine 18 lactylation(H3K18la)in vitro and in vivo,as well as in atherosclerotic patients’***,the histone chaperone asf1a was first identified as a cofactor of P300,which precisely regulated the enrichment of H3K18la at the promoter of SNAI1,thereby activating SNAI1 transcription and promoting *** found that deletion of asf1a inhibited EndMT and improved endothelial *** analysis based on Apoe^(KO)asf1a^(ECKO) mice in the atherosclerosis model confirmed the involvement of H3K18la in atherosclerosis and found that endotheliumspecific asf1a deficiency inhibited EndMT and alleviated atherosclerosis *** of glycolysis by pharmacologic inhibition and advanced PROTAC attenuated H3K18la,SNAI1 transcription,and EndMT-induced *** study illustrates precise crosstalk between metabolism and epigenetics via H3K18la by the P300/asf1a molecular complex during EndMT-induced atherogenesis,which provides emerging therapies for atherosclerosis.

关键词： Histone lactylation Atherosclerosis Endothelial-tomesenchymal transition asf1a SNAI1 Endothelial dysfunction Lactate Epigenetic

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asf1a在小鼠卵子成熟和早期胚胎发育过程中的表观遗传学机理研究

ASF1A在小鼠卵子成熟和早期胚胎发育过程中的表观遗传学机理研究

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作者：王雪梅内蒙古大学

学位级别：硕士

抗沉默因子1(Anti-Silencing Factor 1,asf1)是组蛋白H3和H4的分子伴侣,通过组装和拆解核小体,调节染色质动态,参与DNA复制修复、基因组重编程、细胞增殖以及细胞衰老等多种重要的生物学过程。在哺乳动物中asf1有两个亚型asf1a和asf1B... 详细信息

抗沉默因子1(Anti-Silencing Factor 1,asf1)是组蛋白H3和H4的分子伴侣,通过组装和拆解核小体,调节染色质动态,参与DNA复制修复、基因组重编程、细胞增殖以及细胞衰老等多种重要的生物学过程。在哺乳动物中asf1有两个亚型asf1a和asf1B。研究表明asf1B在小鼠早期胚胎发育过程中主要调控细胞增殖。但是asf1a在小鼠卵子成熟和早期胚胎发育过程中的功能及其机理尚未完全阐明。因此,我们利用特异性Morpholino抑制其表达,探索asf1a在小鼠卵子成熟和早期胚胎发育过程中的功能及其表观遗传机理。在GV期卵母细胞中敲减asf1a,发现asf1a的敲减并不影响第一次减数分裂纺锤体形成以及卵子成熟过程;在受精卵中敲减asf1a,发现沉积到雄原核中的组蛋白H3.3的水平明显降低,并且受精卵到囊胚的发育受到了阻碍;受精卵中asf1a的敲减显著降低了囊胚时期H3K56ac,Oct4和PCNA水平,并造成囊胚中DNA损伤积累。这些研究结果表明,组蛋白分子伴侣asf1a参与组蛋白H3.3在受精卵雄原核染色质中的沉积,并调节H3K56ac、Oct4和PCNA在植入前胚胎中的表达水平,避免植入前胚胎中DNA损伤积累,从而调节小鼠植入前胚胎发育。

关键词：卵子植入前胚胎 asf1a H3.3 H3K56ac Oct4

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asf1a在猪卵母细胞体外成熟过程中的作用

ASF1A在猪卵母细胞体外成熟过程中的作用

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作者：刘明兰西北农林科技大学

学位级别：硕士

为研究组蛋白伴侣分子asf1a(Anti-Silence Function1A)在体外成熟的猪卵母细胞减数分裂过程中的作用，以猪卵巢为材料，首先本试验用地衣红染色技术观察了体外培养猪卵母细胞减数分裂各时期细胞核的形态变化，明确了体外培养的猪卵母细... 详细信息

为研究组蛋白伴侣分子asf1a(Anti-Silence Function1A)在体外成熟的猪卵母细胞减数分裂过程中的作用，以猪卵巢为材料，首先本试验用地衣红染色技术观察了体外培养猪卵母细胞减数分裂各时期细胞核的形态变化，明确了体外培养的猪卵母细胞减数分裂各时期所对应的具体时间;其次用RT-PCR技术从猪成纤维细胞克隆了asf1a基因，构建了pasf1a-Venus真核表达载体，并将其体外转录为RNA;再次通过荧光定量PCR技术和显微注射asf1a-Venus RNA的方法检测了asf1a在猪卵母细胞中的表达;最后用显微注射asf1a-Venus RNA和asf1a SiRNA到GV期猪卵卵母细胞中的方法，初步研究了超表达和干扰asf1a对猪卵母细胞体外成熟的影响。研究取得如下结果： 1.通过地衣红染色系统观察了体外培养猪卵母细胞减数分裂过程中核形态学特征，据此明确了不同培养时间段卵母细胞所处的细胞周期，建立了猪卵母细胞体外成熟过程中染色体发育的时间进程表。即在体外培养的07.56h、17.565.98h、25.981.56h、31..563.91h、33.917.73h、37.73h2h分别为猪卵母细胞体外成熟减数分裂的GV期、GVBDre-MⅠ期、MⅠ期、AⅠ期、TⅠ期、MⅡ期。 2.成功克隆了猪asf1a基因CDS全长序列并构建了pasf1a-Venus真核表达载体，转染Hela细胞后能正确工作;成功获得asf1a-Venus体外转录产物asf1a-VenusRNA。 3.在mRNA水平上猪卵母细胞体外成熟不同时期均有asf1a的表达;蛋白水平上，GV期asf1a在卵母细胞的核和胞质中都有表达，主要分布在核上，MⅡ期asf1a均匀分布在核和胞质中;超表达asf1a对猪卵母细胞第一极体排放无显著影响(P>0.05)，用SiRNA干扰asf1a的表达后极显著的抑制了卵母细胞第一极体的排放(P1)，但对GVBD的发生无影响(P>0.05)，纺锤体形态也正常。结论：建立了猪卵母细胞体外成熟过程中减数分裂时间进程表;asf1a在猪卵母细胞成熟各期均有表达，有细胞周期特异性定位;asf1a对猪卵母细胞成熟是必不可少的，干扰asf1a的表达会抑制猪卵母细胞第一极体的排放。

关键词： asf1a 猪卵母细胞成熟超表达干扰RNA

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水牛asf1a基因克隆及高效敲除靶位点的筛选

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中国兽医学报 2019年第3期39卷 568-574页

作者：刘晓华邓凯范威宏黄永军杜姗姗冯万有潘尔科卢嘉卡文冬梅陆凤花石德顺广西大学亚热带资源保护与利用国家重点实验室广西南宁530005

本研究旨在对水牛anti-silence factor 1a (asf1a)基因进行克隆并行生物信息学分析,并进一步筛选基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的高效敲除asf1a基因位点。根据NCBI公布的牛asf1a基因mRNA序列设计特异性引物,以水牛GV期卵母细胞RNA反转录... 详细信息

本研究旨在对水牛anti-silence factor 1a (asf1a)基因进行克隆并行生物信息学分析,并进一步筛选基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的高效敲除asf1a基因位点。根据NCBI公布的牛asf1a基因mRNA序列设计特异性引物,以水牛GV期卵母细胞RNA反转录后的cDNA作为模板,通过PCR技术克隆获得asf1a基因序列片段,利用生物信息学分析方法,对克隆得到的序列进行和相应翻译的蛋白质进行了分析。在克隆得到的水牛asf1a基因序列上筛选3个PAM位点,并根据PAM位点构建3个gRNA载体(g1、g2、g3)以及相应的RGS载体,将pcDNA3.1-h Cas9连同gRNA、RGS 3种质粒按照3∶1∶1比例共转293T细胞,筛选高效的CRISPR/Cas9敲除位点。试验以水牛GV期的卵母细胞RNA作为模板,通过RT-PCR技术克隆获得asf1a基因序列,并据测序结果设计靶向区域筛选高效asf1a基因敲除位点。结果发现,水牛asf1a基因CDS区全长615 bp,编码204个氨基酸;多重序列分析显示,水牛asf1a基因核苷酸序列与黄牛、绵羊、猪、人、小鼠同源性分别达到了99%,98%,97%,96%,93%;蛋白质结构预测分析发现存在asf1-hist-chap等结构,二级结构含有9个α螺旋、12个β折叠、14个T转角、14个无规则卷曲。系统进化树分析表明,水牛和黄牛亲缘性最接近。根据水牛asf1a设计的敲除载体转染293T和成纤维细胞后,细胞基因组进行T7E1酶切的结果表明,g1位点对水牛成纤维细胞敲除效率最高,达到93.82%,同时,sanger测序表明效率达17/20。本研究成功克隆了水牛asf1a基因和分析了其生物学信息,同时筛选出了asf1a的高效敲除位点,为研究水牛asf1a基因功能奠定基础。

关键词：水牛 asf1a 克隆 CRISPR/Cas9 敲除

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RIF1和asf1a应答端粒DNA损伤同源重组修复的作用机制

RIF1和ASF1A应答端粒DNA损伤同源重组修复的作用机制

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作者：王昱文天津医科大学

学位级别：硕士

目的:肿瘤细胞通过端粒酶或者端粒替代延长机制（Alternative Lengthening of Telomeres Pathway,ALT）克服末端复制问题,维持端粒长度,避免细胞衰老、凋亡。端粒酶抑制剂虽是理想的广谱靶向抗癌药物,但主要存在两个问题,一是10%5%的肿... 详细信息

目的:肿瘤细胞通过端粒酶或者端粒替代延长机制（Alternative Lengthening of Telomeres Pathway,ALT）克服末端复制问题,维持端粒长度,避免细胞衰老、凋亡。端粒酶抑制剂虽是理想的广谱靶向抗癌药物,但主要存在两个问题,一是10%5%的肿瘤细胞中因缺乏端粒酶活性,而对端粒酶抑制剂不敏感,二是端粒酶阳性肿瘤细胞对端粒酶抑制剂逐渐产生抗性,激活更不可控的ALT端粒长度维持机制。研究报道酵母Rif1通过调控端粒酶维持端粒长度稳定,在小鼠胚胎干细胞中RIF1是重要的端粒长度调控因子。胚胎干细胞（具有端粒酶活性）中RIF1缺失引起小鼠胚胎致死,说明RIF1在早期胚胎发育中具有重要功能,但RIF1对肿瘤细胞中端粒的作用研究较少。目前认为ALT是一种以端粒为模板,依赖于同源重组进行端粒DNA合成延伸的端粒维持机制,同源重组相关因子如RAD51、RAD52、BRCA1可能参与维持ALT机制。基因组中RIF1的作用是抑制BRCA1介导的同源重组修复,促进非同源末端连接修复。但目前对参与激活或维持ALT机制相关因子的研究并不明确,我们猜测RIF1可能参与抑制ALT机制。我们希望从研究ALT机制中抑制同源重组相关因子入手,寻找相关靶点从而抑制ALT阳性肿瘤中端粒过度延伸,抑制肿瘤生长,探索可以应用于临床的肿瘤分子标志物及药物靶点,针对性治疗产生端粒酶抗性肿瘤或ALT阳性肿瘤。方法:利用siRNA和shRNA分别获得瞬时和稳定敲低的RIF1、asf1a细胞系,以此细胞系研究RIF1和asf1a在端粒中的功能。采用免疫荧光-荧光原位杂交技术、细胞中期分裂相-荧光原位杂交技术和DNA印记杂交技术分别检测RIF1和asf1a对端粒DNA损伤、中期染色体端粒末端功能维持和端粒长度的影响,研究RIF1和asf1a对端粒功能的作用。采用过表达质粒载体构建技术、免疫沉淀与免疫共沉淀实验技术验证RIF1和asf1a之间的相互作用。利用蛋白质免疫印迹和Real-Time实时荧光定量PCR技术检测各细胞系中RIF1和asf1a蛋白、mRNA表达情况。通过检测端粒外染色质片段c-circle和免疫荧光-荧光原位杂交技术检测RIF1和asf1a在ALT中的作用。通过共免疫荧光技术和免疫荧光-荧光原位杂交技术分别检测RIF1、asf1a在细胞核的分布与端粒的定位数量。利用CRASPR/CAS9技术造成端粒特异性损伤,结合免疫荧光-荧光原位杂交技术研究RIF1和asf1a在端粒损伤修复中的功能。结果:（1）敲低RIF1有引起U2OS细胞中端粒损伤增加的趋势,但对染色体末端端粒信号增多或缺失以及端粒长度的影响不大。（2）RIF1和asf1a存在相互作用,端粒损伤后,相互作用降低。敲低asf1a引起U2OS细胞中端粒损伤增加。RIF1和asf1a蛋白、mRNA在各细胞系中表达量不同。（3）RIF1和asf1a影响ALT活性,均抑制c-circle形成;asf1a抑制APBs形成,但RIF1不影响APBs形成。（4）RIF1和asf1a散在分布于细胞核内。端粒损伤后,RIF1聚集到损伤位点和PML处进行修复,部分依赖于asf1a。结论:综上,本研究发现RIF1可能参与ALT阳性细胞U2OS中端粒的损伤修复,但对维持染色体末端端粒复制功能完整性、端粒基因组稳定性以及端粒长度稳态影响不大。结合前期质谱分析发现RIF1与asf1a强相关,证明RIF1和asf1a存在相互作用,这种相互作用可能是调控端粒损伤修复通路选择的关键。asf1a参与U2OS细胞中端粒的损伤修复,但对维持染色体末端端粒功能稳定和端粒长度的影响不大。RIF1和asf1a均参与调控ALT机制,可能抑制ALT阳性细胞中端粒DNA的合成。与asf1a缺失不同,RIF1缺失对APBs的形成不产生影响。尤其在端粒损伤修复中,RIF1可能发挥重要作用,并且部分依赖于asf1a。

关键词：端粒端粒替代延长机制端粒DNA损伤 RIF1 asf1a

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