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中国生物化学与分子生物学报 2014年第4期30卷 383-389页

作者：肖亚飞吴更微生物代谢国家重点实验室上海交通大学生命科学技术学院上海200240

Amer1(APC membrane recruitment protein 1)又称为WTX(Wilms’tumor X),是首个发现位于X染色体上的抑癌基因.由于其定位的特殊性,Amer1近年来成为研究的热点之一.研究表明,Amer1作为骨架蛋白在细胞内与多种蛋白(APC,β-catenin,Axin等... 详细信息

Amer1(APC membrane recruitment protein 1)又称为WTX(Wilms’tumor X),是首个发现位于X染色体上的抑癌基因.由于其定位的特殊性,Amer1近年来成为研究的热点之一.研究表明,Amer1作为骨架蛋白在细胞内与多种蛋白(APC,β-catenin,Axin等)直接结合,在Wnt信号通路中发挥着重要功能.据报道Amer1/WTX含有3个肿瘤抑制蛋白质APC(adenomatous polyposis coli,APC)的结合位点,对于APC在细胞膜上的定位过程中发挥着重要的作用.但是,通过序列比对发现,Amer1可能存在第4个被忽略的APC的结合位点,定位于A1和A2之间.为了验证该片段能否与APC结合,分别构建了GST-Amer1(365-375)和His-APC(407-775)两种重组蛋白.通过GSTpull down,证明了这两个片段存在相互作用,并进一步通过ITC(isothermal titration calorimetry)实验测定了两者结合的亲和力.本研究结果不仅在体外证实了Amer1第4个APC结合位点的存在,也为APC和Amer1/WTX复合物的结构和功能的研究打下了良好的基础.

关键词： Amer1 WTX APC蛋白 arm结构域 GST-pull down ITC

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arm结构的缺失对SPAG6在哺乳细胞中定位的影响

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中国男科学杂志 2015年第1期29卷 3-8页

作者：汪智琼张玲石玉琴李红飞张志兵武汉科技大学医学院公共卫生学院武汉430065 华中科技大学同济医学院附属同济医院 Virginia Commonwealth University Richmond VA

目的：本研究构建精子相关抗原6（SPAG6）基因全长及6个不同长短arm序列的真核表达载体pEGFP-N2-SPAG6-△arm，并使其在CHO细胞中表达，观察全长及6个arm结构缺失后对真核细胞CHO细胞中SPAG6蛋白定位的影响。方法利用NCBI数据库，寻找小... 详细信息

目的：本研究构建精子相关抗原6（SPAG6）基因全长及6个不同长短arm序列的真核表达载体pEGFP-N2-SPAG6-△arm，并使其在CHO细胞中表达，观察全长及6个arm结构缺失后对真核细胞CHO细胞中SPAG6蛋白定位的影响。方法利用NCBI数据库，寻找小鼠SPAG6蛋白的保守功能区，分析全长蛋白序列，检索出SPAG6有7个arm区域。利用PCR技术扩增出6个缺失不同arm结构的SPAG6 cDNA，测序后亚克隆至携带绿色荧光蛋白基因的pEGFP-N2真核表达载体中，对阳性克隆进行酶切和测序鉴定，将构建的重组质粒转染到CHO细胞中，分别提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察7个不同SPAG6/GFP融合蛋白在CHO细胞内的定位。结果酶切和测序鉴定表明，全长及6个缺失不同长短arm结构的真核表达质粒构建成功，转染实验发现重组质粒均能够在CHO细胞中表达，但仅全长表达产物定位于微管，缺失任何一个arm区域都可影响在细胞中的微管定位。结论SPAG6在哺乳动物细胞内的正确定位依赖于全长。该研究为进一步研究SPAG6蛋白的结构与功能奠定基础。

关键词：精子相关抗原6基因 arm结构域不育男性

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探讨arm结构的缺失对SPAG6在真核细胞中定位的影响

探讨ARM结构的缺失对SPAG6在真核细胞中定位的影响

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作者：汪智琼武汉科技大学

学位级别：硕士

目的：构建SPAG6基因全长及六个不同长短arm序列的真核表达载体pEGFP-N2-SPAG6-△arm，探讨融合蛋白在细胞内表达及定位。观察全长及六个arm结构缺失后对真核细胞CHO细胞中SPAG6蛋白定位的影响。方法：1.利用NCBI数据库，寻找小鼠SPAG... 详细信息

目的：构建SPAG6基因全长及六个不同长短arm序列的真核表达载体pEGFP-N2-SPAG6-△arm，探讨融合蛋白在细胞内表达及定位。观察全长及六个arm结构缺失后对真核细胞CHO细胞中SPAG6蛋白定位的影响。方法：1.利用NCBI数据库，寻找小鼠SPAG6蛋白的保守功能区，分析全长蛋白序列，检索出SPAG6有七个arm区域;2.以健康成年雄性小鼠的睾丸组织为来源，建立小鼠睾丸cDNA文库;3.以小鼠睾丸cDNA文库为模板，PCR扩增SPAG6全长及六个不同长短arm结构的编码序列;4. TA克隆后测序;5.构建携带不同长短arm序列的真核表达载体pEGFP-N2-SPAG6-△arm，对阳性克隆进行酶切和测序鉴定，将构建的重组质粒转染到CHO细胞中;6.分别提取细胞蛋白进行Western blot检测，利用共聚焦激光扫描显微镜观察七个不同SPAG6/GFP融合蛋白在CHO细胞内的定位。结果：酶切和测序鉴定表明，全长及六个缺失不同长短arm结构的真核表达质粒构建成功，转染实验发现重组质粒均能够在CHO细胞中表达，但仅全长表达产物定位于微管，缺失任何一个arm区域都可影响在细胞中的微管定位。结论：SPAG6在真核细胞内的正确定位依赖于全长。该研究为进一步研究SPAG6蛋白的结构与功能奠定基础。

关键词：男性不育 SPAG6 arm结构域蛋白定位

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