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植物病理学报 2019年第5期49卷 621-631页

作者：梁丽琴杜海燕段江燕谢丙炎山西师范大学生命科学学院临汾041000 中国农业科学院蔬菜花卉研究所农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室北京100081

argonaute蛋白(AGO)介导的沉默复合体在RNA干扰(RNAi)中起着至关重要的作用。为了探究AGO1在尖孢镰刀菌RNAi中的作用机制,本文以粘团专化型尖孢镰刀菌生理1号小种FOX-A8野生型和其AGO1缺失突变体(FOX-A8-△Ago1)的菌丝和孢子为材料,分... 详细信息

argonaute蛋白(AGO)介导的沉默复合体在RNA干扰(RNAi)中起着至关重要的作用。为了探究AGO1在尖孢镰刀菌RNAi中的作用机制,本文以粘团专化型尖孢镰刀菌生理1号小种FOX-A8野生型和其AGO1缺失突变体(FOX-A8-△Ago1)的菌丝和孢子为材料,分别进行了RNA提取、Illumina Hi Seq 2000高通量转录组测序、差异表达基因(DEGs)的显著富集分析;选择菌丝和孢子中的DEGs进行实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证。GO通路注释结果显示,相对于野生型菌株,AGO1缺失突变体菌丝中的醇脱氢酶(NADP^+)、孢子中的CAMK/CAMKL/CHK 1蛋白激酶均显著上调;KEGG通路注释结果显示,相对于野生型菌株,AGO1缺失突变体菌丝中与MAPK信号通路相关的基因、孢子中与PLD信号通路相关的基因均显著下调;另外,相对于野生型菌株,编码AGO2的基因下调,但是下调不显著。qRT-PCR检测DEGs的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性。

关键词：转录组分析尖孢镰刀菌 argonaute1

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飞蝗argonaute1的分子特性及生物学功能

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中国农业科学 2016年第18期49卷 3569-3577页

作者：王艳丽杨美玲宋天琪马恩波张建珍山西大学应用生物学研究所山西大学生命科学学院中国科学院动物研究所

【目的】MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约22 nt的非编码RNA,通过转录后调控的方式在多种生命活动中发挥重要功能。argonaute1(AGO1)蛋白作为miRNA沉默复合物(miRNA silencing complex RISC)的重要组成部分,在miRNA调控通路中起着关键作... 详细信息

【目的】MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约22 nt的非编码RNA,通过转录后调控的方式在多种生命活动中发挥重要功能。argonaute1(AGO1)蛋白作为miRNA沉默复合物(miRNA silencing complex RISC)的重要组成部分,在miRNA调控通路中起着关键作用。论文旨在研究AGO1的生物学功能及其对飞蝗(Locusta moratoria)生长发育的影响,为探索昆虫miRNA的生物合成和农业害虫的有效控制提供理论依据。【方法】采用生物信息学方法在飞蝗转录组数据库中获得Lm AGO1 c DNA序列;使用在线蛋白翻译软件(Ex PASy)对Lm AGO1进行蛋白翻译,利用SMART分析Lm AGO1蛋白的功能结构域;选取家蚕(Bombyx mori)、果蝇(Drosophila melanogaster)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)等模式昆虫的同源序列与Lm AGO1氨基酸序列进行聚类分析,采用Phyml软件构建昆虫AGO蛋白的系统发育树;为了进一步研究Lm AGO1在飞蝗生长发育过程中的作用,使用T7 RiboMAXTMExpress RNAi System体外合成Lm AGO1的ds RNA,在飞蝗4龄第2天和5龄第2天若虫期连续两次注射ds RNA进行干扰,同时注射ds GFP作为对照。分别收集注射ds RNA后48 h和72 h的整虫样品提取RNA,反转录为c DNA。通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测Lm AGO1在不同时间点的干扰效率并观察虫体的发育表型。同时,为了检测Lm AGO1沉默是否会影响miRNA的生物合成,采用RT-q PCR对飞蝗体内5个高丰度miRNA表达进行定量分析。【结果】Lm AGO1蛋白含845个氨基酸,具有典型的AGO蛋白家族保守结构域,即位于213—348位点的PAZ结构域和502—804位点的PIWI结构域。聚类分析表明,Lm AGO1蛋白与其他昆虫的AGO1蛋白聚为一类。通过AGO1氨基酸序列同源比对结果显示Lm AGO1与模式昆虫果蝇、家蚕AGO1的氨基酸序列一致度高达82.2%和86.9%。RNAi结果表明,虫体注射ds Lm AGO1 48 h和72 h后,与对照组相比,Lm AGO1表达量均显著降低,干扰效率分别为88.1%和93.0%;进一步观察试虫生长发育的表型特征,与对照组相比,飞蝗4龄期注射dsL m AGO1后其生长发育并没有出现明显异常,待蜕皮发育至下一龄期(即5龄期)时,出现大量死亡,死亡率为89.3%;荧光定量PCR结果显示注射ds Lm AGO148 h后,飞蝗体内miRNA-252和miRNA-8的表达显著下降,干扰72 h后miRNA-7、let 7、miRNA-252、miRNA-8的表达均显著下降。【结论】飞蝗AGO1除参与RSIC的形成以外,还可能参与miRNA的剪切加工过程进而调控飞蝗的正常发育。

关键词：飞蝗 miRNA argonaute1 RNA干扰生物学功能

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胡杨argonaute1基因克隆与亚细胞定位

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河南科技大学学报（自然科学版） 2018年第5期39卷 68-73页

作者：李红英杨雪王少博河南科技大学林学院河南洛阳471023

以杨树基因组数据库为背景,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法,从胡杨中克隆得到了与拟南芥AGO1(At AGO1)基因同源的全长开放阅读框。测序结果表明:该基因开放阅读框为3 180 bp,编码由1 059个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质与At A... 详细信息

以杨树基因组数据库为背景,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法,从胡杨中克隆得到了与拟南芥AGO1(At AGO1)基因同源的全长开放阅读框。测序结果表明:该基因开放阅读框为3 180 bp,编码由1 059个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质与At AGO1氨基酸相似性为79.51%,命名为Pe AGO1。推导Pe AGO1等电点和分子质量分别为9.45和117 ku,不含信号肽序列,推测Pe AGO1不是分泌蛋白。系统进化分析表明:胡杨Pe AGO1蛋白在进化上与桃(Prunus persica)、葡萄(Vitis vinifera L.)、巨桉(Eucalyptus grandis Hill ex Maiden)等木本植物亲缘关系较近,与单子叶植物玉米(Zea mays L.)、水稻(Oryza sativa)等亲缘关系较远。构建细胞定位检测载体35S∷GFP-Pe AGO1,采用原生质体转化法将其瞬时表达于84K杨树叶片中。激光共聚焦显微镜观察结果表明:Pe AGO1蛋白定位于细胞核中。

关键词：胡杨 argonaute1 基因克隆系统进化分析亚细胞定位

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利用亲和质谱筛选果蝇argonaute1相互作用蛋白

利用亲和质谱筛选果蝇Argonaute1相互作用蛋白

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作者：王凯云南大学

学位级别：硕士

RNAi(RNA interference,RNAi)是一种可以在转录后水平上导致基因沉默的技术,这种技术主要借助ds RNA(double-stranded RNA,ds RNA)来诱导产生基因沉默(Gene silencing)现象,在RNAi过程中,mi RNA(micro RNA,mi RNA)和AGO蛋白都起着非常重要的作用。mi RNA是一类长度约为22nt的小RNA,其广泛分布于生物体内,并且可以通过AGO蛋白来与目标m RNA(messenger RNA,m RNA)结合,从而调控目标m RNA的翻译。AGO蛋白是mi RNA诱导的基因沉默过程中的关键因子,其主要包括三个功能结构域:PAZ,MID和PWPI。其中PIWI结构域具有核酸内切酶的活性,PAZ结构域可以结合小RNA的3’端,而MID结构域可以结合小RNA的5’端。因此,AGO蛋白在RNAi过程中具有mi RNA招募以及m RNA切割的功能,AGO的这些功能直接影响了RNAi效果的产生,并对基因沉默起着关键性作用。介于AGO蛋白在基因沉默中的作用,希望通过以下实验能够筛选出与AGO1具有相互作用的蛋白。本文首先在果蝇S2细胞系中对Ago1基因进行敲低,并借助q RT-PCR检测Ago1基因的敲低效率,在取得明显敲低效率后提取S2细胞的总RNA,之后分离m RNA进行测序,对测序结果分析后发现了bantam和mi R-9b两个在果蝇细胞中丰度最高的mi RNA,之后构建用于验证Ago1与上述靶点关系的质粒。其次,在果蝇的S2细胞系中,构建了mi RNA的报告系统。随后,我们利用亲和质谱技术对果蝇AGO1的互作蛋白进行了筛选,并挑选了14个候选基因进行验证。我们在果蝇S2细胞中将候选基因进行敲低,并通过mi RNA的报告系统来分析上述候选基因对mi RNA-AGO1介导的基因沉默功能的影响。最后的报告系统实验结果显示:对14个候选基因的敲低,并不会对mi RNA-AGO1介导的基因沉默功能产生影响。

关键词： RNA干扰基因沉默 RISC复合物 argonaute1

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Dose-Dependent AGO1-Mediated Inhibition of the miRNA165/166 Pathway Modulates Stem Cell Maintenance in Arabidopsis Shoot Apical Meristem

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Plant Communications 2020年第1期1卷 179-189页

作者： Fei Du Wen Gong Sonia Bosca Matthew Tucker Herve Vaucheret Thomas Laux Signalling Research Centres BIOSS and CIBSS Faculty of BiologyUniversity of FreiburgSchanzlestrasse 179104 FreiburgGermany Institut Jean-Pierre Bourgin INRAAgroParisTechCNRSUniversite Paris-Saclay78000 VersaillesFrance Sino-German Joint Research Center on Agricultural Biology Shandong Agricultural UniversityTai’anShandongChina State Key Laboratory of Plant Genomics Institute of Genetics and Developmental BiologyChinese Academy of SciencesBeijing 100101China School of Agriculture Food and WineUniversity of AdelaideWaite CampusUrrbraeSAAustralia

Pluripotent stem cells localized in proliferating growth centers, the meristems, are the origin of life-long organ formation and growth in higher plants. In the shoot apical meristem of Arabidopsis thaliana, the closelyrelated argonaute proteins AGO1 and ZLL/AGO10 bind miR165/166 species to regulate mRNAs of HDZIP III transcription factors that are essential to maintaining stem cells. Several genetic studies showed thatAGO1 and ZLL/AGO10 act redundantly to maintain stem cells. By contrast, the reported biochemical datasuggested antagonistic functions: AGO1 utilizes miR165/166 to slice HD-ZIP III mRNAs, whereas ZLL/AGO10 promotes degradation of miR165/166 and thus stabilizes HD-ZIP III mRNAs. How these differentfunctions are balanced in stem cell regulation has remained enigmatic. Here, we show that autorepressionof AGO1 through miR168-mediated slicing of its own RNA is required to maintain the ability of AGO1 to suppress HD-ZIP III mRNAs. Increased AGO1 expression, either in the miR168a-2 mutant or by transgenicexpression, inhibits this ability despite the presence of high levels of miR165/166, effectively uncouplingHD-ZIP III and miR165/166 expression. AGO1 activity can be restored, however, by increasing the levelsof chaperones SQN and HSP90, which promote assembly of RNA-induced silencing complex (RISC). Thissuggests that cellular abundance of SQN and HSP chaperones limits AGO1-mediated RNA interferencein shoot meristem stem cell regulation. Localized misexpression of AGO1 indicates that the cells surrounding the shoot meristem primordium play a crucial role in stem cell development. Taken together, our studyprovides a framework that reconciles biochemical and genetic data, showing that restriction of AGO1 levelsby miR168-mediated autorepression is key to RISC homeostasis and the function of AGO1 in stem cellregulation.

关键词： Arabidopsis argonaute1 ZWILLE(argonaute10) HD-ZIP III stem cell shoot meristem

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人参中与miRNA调控相关的蛋白AG01基因克隆与序列分析

人参中与miRNA调控相关的蛋白AG01基因克隆与序列分析

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作者：陈超山西师范大学

学位级别：硕士

本文采用RACE（rapid-amplification of cDNA ends） cDNA末端快速扩增技术对药用植物人参中与miRNA调控相关重要蛋白argonaute1（PgAGO1）的基因进行了克隆。从人参叶片中克隆PgAGO1的全长基因，并利用生物信息学方法进行分析。根据人... 详细信息

本文采用RACE（rapid-amplification of cDNA ends） cDNA末端快速扩增技术对药用植物人参中与miRNA调控相关重要蛋白argonaute1（PgAGO1）的基因进行了克隆。从人参叶片中克隆PgAGO1的全长基因，并利用生物信息学方法进行分析。根据人参EST序列设计基因特异性引物，采用RACE方法对PgAGO1的cDNA全长进行克隆，并对PgAGO1蛋白的结构、功能等进行初步分析;同时采用实时定量PCR检测PgAGO1基因在人参不同组织根、茎、叶、花和愈伤中表达水平。克隆的PgAGO1全长cDNA为3776bp，其中包括5’UTR204bp、3’UTR254bp，基因内部包含完整的开放阅读框，可编码1103个氨基酸，预测蛋白质分子量为122.22KDa，理论等电点pI9.71;系统进化树显示：AGO蛋白产生于单子叶和双子叶植物分化之前， PgAGO1与AtAGO1、AtAGO10，OsAGO1d、OsAGO1c、OsAGO1b、OsAGO1a、OsPNH1、OsAGO17等同属一个进化分支;实时定量PCR检测结果表明PgAGO1基因在人参花中的表达量最高，在根中最低。从人参叶片中克隆得到PgAGO1的全长cDNA，为进一步研究该基因在人参组织发育中的调节作用打下基础。

关键词：人参 MicroRNA RACE argonaute1 生物信息学

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拟南芥as2突变体增强子krt1的遗传分析及KRT1基因的克隆

拟南芥as2突变体增强子krt1的遗传分析及KRT1基因的克隆

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作者：张振桢上海交通大学

学位级别：硕士

植物叶片的极性发育对于其行使正常的功能是必需的。在叶片进行极性发育的过程中,主要存在着三个基本的发育轴向:近-远轴、基-顶轴、中-侧轴,其中以近-远轴的发育最为关键和突出。一系列“极性基因”参与调控了近-远轴的极性建成,其中... 详细信息

植物叶片的极性发育对于其行使正常的功能是必需的。在叶片进行极性发育的过程中,主要存在着三个基本的发育轴向:近-远轴、基-顶轴、中-侧轴,其中以近-远轴的发育最为关键和突出。一系列“极性基因”参与调控了近-远轴的极性建成,其中拟南芥的AS2基因会促进叶片的近轴面发育,在as2突变体中叶片的近轴面发育会受到一定程度的阻碍,这使得as2的叶片表现出远轴面化叶片的表型。为了进一步了解AS2基因调节叶片极性发育的分子机理,我们对as2突变体进行了EMS化学诱变,试图筛选能改变as2表型的突变体。在这篇文章中,我们分析了as2增强子krt1。krt1能增强as2叶片近轴面特征部分缺失的表型,使得as2 krt1双突变产生比as2表型更强的远轴面化叶片。KRT1编码着26S蛋白酶体上的RPN2a亚基,krt1突变可能影响了26S蛋白酶体对某些调控蛋白的降解,这说明叶片的极性发育受到了蛋白翻译后的调控。 krt1除了能增强as2之外,它还能增强一些其他极性发育存在缺陷的突变体,像ago1。AGO1是RNA干扰沉默复合体RISC中的重要组成部分,ago1突变可能通过干扰了miRNA165/166的分布而影响了叶片的极性发育。krt1对ago1-37表型的增强与在as2背景下

关键词：叶片极性 26S蛋白酶体 ASYMMETRIC LEAVES2 argonaute1 REVOLUTA

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