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苹果生长素响应因子Mdarf5的克隆与功能鉴定

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中国农业科学 2018年第7期51卷 1345-1352页

作者：安建平宋来庆赵玲玲由春香王小非郝玉金山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室烟台市农业科学研究院

【目的】分离苹果生长素响应因子Md arf5(Auxin Response Factor 5),分析其对生长素的响应,鉴定其在调节花青苷合成过程中的作用,揭示Md arf5的生物学功能,为进一步研究生长素对花青苷的调节提供理论依据。【方法】以‘嘎拉’苹果(Malus... 详细信息

【目的】分离苹果生长素响应因子Md arf5(Auxin Response Factor 5),分析其对生长素的响应,鉴定其在调节花青苷合成过程中的作用,揭示Md arf5的生物学功能,为进一步研究生长素对花青苷的调节提供理论依据。【方法】以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为材料,利用同源克隆技术,克隆得到一个arf(Auxin Response Factor)转录因子,并将其命名为Md arf5。利用MEGA5.0软件构建多物种间系统进化树。通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织花青苷积累的差异。利用烟草叶片瞬时转化试验,分析Md arf5对Md MYB1的转录调控。【结果】克隆获得苹果生长素响应因子Md arf5(序列号:MDP0000143749),该基因CDS为2 691 bp,编码含有896个氨基酸的蛋白。系统进化树分析表明,苹果Md arf5与梨Pb arf5同源性最高。基因表达分析显示,该基因响应生长素处理,并且与花青苷合成相关基因表现出相反的表达模式。在苹果愈伤组织中超表达Md arf5,其花青苷积累较野生型显著降低,表明Md arf5在调控花青苷积累过程中发挥重要作用。对苹果Md MYB1启动子序列进行分析,发现其序列包含一个Md arf5的结合位点。烟草瞬时表达试验显示,Md arf5能够抑制Md MYB1的表达。【结论】推测苹果Md arf5可能通过直接抑制Md MYB1的表达负调节花青苷的积累。

关键词：苹果生长素 arf转录因子花青苷

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黄芩arf基因家族生物信息学及表达分析

药学学报 2017年第11期52卷 1770-1776页

作者：陈媞颖刘娟袁媛周骏辉黄璐琦中国中医科学院中药资源中心北京100700

arf转录因子在植物的生长发育中具有重要意义,是生长素信号传导途径中的重要转录因子。该研究通过生物信息学方法,从黄芩转录组中获得9个具有全长的arf基因,分别对其核苷酸特性、蛋白质理化性质、亚细胞定位、二级结构、系统发育和基因... 详细信息

arf转录因子在植物的生长发育中具有重要意义,是生长素信号传导途径中的重要转录因子。该研究通过生物信息学方法,从黄芩转录组中获得9个具有全长的arf基因,分别对其核苷酸特性、蛋白质理化性质、亚细胞定位、二级结构、系统发育和基因表达情况进行分析。系统进化树结果显示,这9个黄芩的arf分别与拟南芥、烟草、水稻中的arf转录因子聚在一起。arf基因相对表达分析发现:100μmol·L^(-1)赤霉素处理后,arf1、arf3、arf4、arf8、arf20、arf24表达量升高,arf6、arf18表达量降低;arf基因在黄芩的花中具有较高的表达量;arf基因与黄芩中黄酮类合成及调控基因的表达具有一定的相关性。本研究为进一步探讨arf基因在黄芩中黄酮类成分积累的调控机制提供依据。

关键词：黄芩 arf转录因子生物信息学表达分析

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狗尾草arf基因家族的鉴定与表达分析

生物技术通报 2024年第11期40卷 227-235页

作者：王其昕张凌馨钟妮娜熊王丹青岛农业大学草业学院青岛266109 黄河三角洲草地资源与生态国家林业和草原局重点实验室青岛266109

【目的】生长素响应因子arf(auxin response factor)可以调控生长素响应基因的表达,在植物生长发育中发挥着重要作用。从狗尾草全基因组范围内鉴定出Svarf基因家族成员,分析相关基因表达特征,为后续深入研究其与狗尾草生长发育的关系提... 详细信息

【目的】生长素响应因子arf(auxin response factor)可以调控生长素响应基因的表达,在植物生长发育中发挥着重要作用。从狗尾草全基因组范围内鉴定出Svarf基因家族成员,分析相关基因表达特征,为后续深入研究其与狗尾草生长发育的关系提供支撑。【方法】利用生物信息学方法从狗尾草基因组中鉴定了arf转录因子成员,分析其系统进化、染色体定位和基因结构等情况。利用RT-qPCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)分析该家族成员在生长素类除草剂2,4-D异辛酯处理后的表达响应情况。【结果】共鉴定到24个狗尾草Svarf基因家族成员,可分成4个亚家族,同一亚家族Svarf基因的结构相似且基因表达模式相近。不同Svarf基因的表达模式存在差异,且有组织特异性,III亚家族的Svarf基因在根茎分蘖处的表达量均较高。2,4-D异辛酯处理后,有9个Svarf基因的相对表达量发生显著变化,其中Svarf5、Svarf6、Svarf9、Svarf10、Svarf17和Svarf18表达量显著上调,Svarf14、Svarf22和Svarf24表达量显著下调。【结论】狗尾草Svarf基因家族有24个成员。生长素类除草剂影响Svarf基因的表达,暗示Svarf基因在抑制狗尾草植株分蘖中发挥重要作用。

关键词： arf转录因子狗尾草系统进化结构特征表达分析分蘖 2,4-D异辛酯

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桑树arf基因家族的鉴定与表达分析

蚕业科学 2023年第3期49卷 193-200页

作者：刘江黄盖群代洁曾益春危玲姚永权佟万红唐清霞郑继川李永远莫西刘刚四川省农业科学院蚕业研究所四川南充637000

生长素响应因子(auxin response factor,arf)是真核生物中普遍存在的转录因子之一,主要调控生长素应答基因的表达,与植物的生长发育和信号转导等多个生理过程密切相关。从桑树基因组数据库中共鉴定了16个arf基因家族成员。理化性质分析... 详细信息

生长素响应因子(auxin response factor,arf)是真核生物中普遍存在的转录因子之一,主要调控生长素应答基因的表达,与植物的生长发育和信号转导等多个生理过程密切相关。从桑树基因组数据库中共鉴定了16个arf基因家族成员。理化性质分析表明桑树arf蛋白的氨基酸个数为606~1144,分子质量为67.35~127.75 kD,等电点为4.86~8.37,大部分表现为酸性且都为亲水蛋白。根据系统发育及蛋白质结构分析,可将桑树arf成员分为4个亚家族,同一亚族中的成员具有相同保守基序及类似基因结构,arf蛋白至少具备B3、Auxin_resp、AUX_IAA等结构域中的一种;表达模式分析表明,arf基因在桑树的根、桑皮、叶、芽、花等组织中的时空表达存在显著差异,在芽中呈现较高的表达,这可能与桑树芽器官的细胞分化程度大密切相关;Mnarf9、Mnarf10、Mnarf11、Mnarf12、Mnarf15和Mnarf16等6个基因在桑芽不同发育阶段的转录水平呈逐渐下调趋势,表明这些基因可能在桑芽前期的生长发育和细胞分化等生理反应中发挥作用。上述结果为后续桑树arf家族基因的功能和进化分析以及桑树分子育种及良种选育等研究工作提供了一定的理论基础。

关键词：桑树 arf转录因子生物信息学基因表达

ZmIAA29调控玉米生育期的分子机制研究

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ZmIAA29调控玉米生育期的分子机制研究

作者：党昆泰河南农业大学

学位级别：硕士

玉米是我国产量最高,种植面积最广的粮食作物。在黄淮海粮食产区,粮食生产采用特有的小麦-玉米轮作一年两熟耕作制度。在保证产量稳定的条件下,玉米的提早成熟会加快玉米脱水,有利于玉米机械化收获的开展。玉米生长期的缩短对于小麦播... 详细信息

玉米是我国产量最高,种植面积最广的粮食作物。在黄淮海粮食产区,粮食生产采用特有的小麦-玉米轮作一年两熟耕作制度。在保证产量稳定的条件下,玉米的提早成熟会加快玉米脱水,有利于玉米机械化收获的开展。玉米生长期的缩短对于小麦播种时间的选择、生长时间的延长、以及产量的提高有着重要的意义。因此,进行玉米生育期的研究对于改良玉米品种生育期优化作物种植模式有着极其重要的意义。根据前期转录因子GWAS获得的一个与玉米生育期相关的转录因子编码基因ZmIAA29,本研究以ZmIAA29为目的基因,构建并转化获得了玉米自交系KN5585为背景的过表达玉米转基因材料。通过多年多点的种植鉴定和表型观测,结合相关验证试验,获得了以下结论。***29过表达材料相对于对照生育期明显提前,抽雄期、散粉期和吐丝期平均提前2～3天。ZmIAA29过表达材料的单穗产量与对照相比并未降低,穗行数和行粒数显著多于对照,籽粒大小明显小于对照,而穗粒数平均增加了68.45粒。通过体式显微镜观察生长26天的ZmIAA29过表达和对照材料顶端分生组织,发现过表达材料顶端分生组织的发育阶段早于对照。2.在玉米ZmIAA29过表达材料(T2)生长至V6时期,取顶端分生组织,提取总RNA。通过quantitative real-time PCR(q RT-PCR)的方式,首先确定过表达材料中ZmIAA29的表达水平远远高于对照,即获得确切的过表达材料。对ZmIAA29过表达材料的顶端分生组织总RNA进行转录组测序,以padj值≤0.05、|logFC|≥1作为差异基因筛选的阈值,获得4725个差异表达基因,其中2200个基因在过表达材料中上调表达,2525个基因下调表达。GO富集分析,发现差异基因主要富集于成熟m RNA的生成、花器官数量和结构的发育、细胞的发育过程等。KEGG分析发现,这些差异表达基因主要涉及的调控通路有:植物的昼夜节律、蛋白家族的信号传导和细胞过程、氨基酸的代谢过程、碳水化合物的代谢过程、以及其他代谢过程。3.由于Aux/IAA家族的蛋白常通过与arf家族蛋白结合生成Aux/IAA-arf复合物发挥转录调控作用,故筛选并验证了与ZmIAA29互作的arf转录因子。采用酵母双杂交点对点互作的方式,筛选到ZmIAA29与Zm arf2、Zm arf7、Zm arf15、Zm arf19、Zm arf25存在互作。进一步使用BILUC试验(Bimolecular Luciferase,双分子萤光素酶)进行细胞内互作验证,确定了ZmIAA29与Zm arf2、Zm arf7、Zm arf25存在互作。4.结合已有的Zm arf7、Zm arf25转录因子DAP-seq数据,与本研究获得的转录组数据进行联合分析,发现相关差异表达基因主要涉及植物激素信号转换、环境信息处理、信号传导、代谢等过程。筛选到Zm HB53、Zm MADS6、Zm MYB43、Zm MYB93、Zm CCD7等与玉米开花时间、结实以及激素信号响应密切相关的基因,这些基因也许是受IAA29-arf蛋白质复合物影响的关键下游基因。

关键词：玉米生育期 IAA29 arf转录因子蛋白互作

月季生长素相关基因Rharf6和RhIAA4的克隆和功能分析

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月季生长素相关基因RhARF6和RhIAA4的克隆和功能分析

作者：焦明丽河南农业大学

学位级别：硕士

切花月季(Rosa hybrida)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)植物,颜色丰富,花型优美,芳香馥郁,一年能够多次复花,是中国十大传统名花之一。切花月季是现代月季里适宜做切花生产的一类月季的统称,包括杂种香水月季(HT),聚花月季类(FL)及壮... 详细信息

切花月季(Rosa hybrida)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)植物,颜色丰富,花型优美,芳香馥郁,一年能够多次复花,是中国十大传统名花之一。切花月季是现代月季里适宜做切花生产的一类月季的统称,包括杂种香水月季(HT),聚花月季类(FL)及壮花月季(GR)等类型,与菊花,香石竹和唐菖蒲并成为世界四大切花品种之一,种植范围广,经济效益高。切花月季周年生产过程中出现的弯梗现象(Bent peduncle phenomenon,BPP)造成的花梗弯曲和花器官畸形,影响了商品月季的品质和经济价值,因此研究弯梗现象的形成机制对于解决切花月季周年生产出现的问题意义重大。目前已经明确弯梗现象的形成原因可能是短暂的IAA不对称分布,生长素水平方向的不对称分布引起了花梗的两侧不对称生长,但是具体调控IAA极性运输的分子机制有待深入研究。本研究以切花月季‘卡罗拉’为材料,测定了正常月季和弯梗月季中花器官各部分以及花梗各部分的IAA激素含量。观察了正常月季和弯梗月季不同发育时期花梗处的IAA荧光定量。通过转录组筛选出两个与生长素相关的基因Rharf6和RhIAA4,对其进行生物信息学分析和表达量分析,克隆基因后通过异源转化验证功能,并且使用酵母双杂交筛选其互作蛋白,以期明确生长素相关基因Rharf6和RhIAA4在参与月季花梗部形态建成的调控机制。主要研究结果如下:(1)通过对弯梗月季和正常月季的不同部位进行IAA激素含量的测定,我们发现花梗部位的IAA含量高于花器官的其他部位。在花梗处,BU(弯梗背侧)的激素含量高于BD(弯梗向侧),两者的激素含量均高于正常植株。月季弯梗植株的两侧IAA含量存在差异,且高于正常植株花梗处的含量。IAA免疫荧光定位的结果显示,正常植株中IAA的分布较为均匀,而弯梗月季的IAA大量聚集在花梗向侧增加的块状组织部分。(2)Rharf6和RhIAA4的基因鉴定和表达分析:基于差异部位的转录组测序结果进行分析,得到Rharf6和RhIAA4两个生长素相关基因。在月季‘卡罗拉’中提取RNA反转录作为模板,克隆得到两个基因。Rharf6的ORF长度为2680bp,编码892个氨基酸;RhIAA4的CDS区长600bp,编码199个氨基酸。Rharf6含有B3-DNA binging domine结合域、Auxin response factor生长素元件和植物生长素原初响应基因Aux/IAA元件;RhIAA4包含完整的AUX/IAA family结构域。在花发育阶段,Rharf6和RhIAA4的表达呈现波动性。Rharf6在花芽发育的S1-S2阶段,弯梗植株中的表达量高于正常植株,在S3-S5阶段则相反,并且在正常植株的S4阶段表达达到最高,在弯梗植株的S2阶段表达最高;而RhIAA4在发芽发育的各个阶段中,正常植株的表达量均高于弯梗植株。在花梗的不同部位,Rharf6基因在NP(正常花瓣)处表达量最高,而RhIAA4基因在BS(下落萼片)处表达量最高,两者在N(正常花梗)处的表达量最低。(3)Rharf6和RhIAA4的功能分析:亚细胞定位显示Rharf6和RhIAA4均定位在细胞核上,通过异源转化烟草和拟南芥,得到过表达转基因株系并对表型进行观察。Rharf6-OE的转基因烟草花朵与对照植株相比均出现颜色变浅,花冠出现不同程度的折叠,也出现了花瓣分化为不规则的8枚,比对照植株增加了3枚,花瓣瓣尖更加圆滑,其余部位无较大明显的区别,表明Rharf6可能参与了花青素调控和花瓣原基的形成的过程。RhIAA4-OE的转基因烟草也出现了花色变浅,株高比对照烟草高的现象;RhIAA4-OE的转基因拟南芥较对照植株相比,均出现了不同程度的弯曲,莲座叶变大,角果变大,果荚更加饱满,表明RhIAA4参与花青素调控、株型调控、莲座叶和角果的生长发育的一系列过程。(4)Rharf6和RhIAA4的互作蛋白筛选:实验表明p GBKT7-Rharf6存在自激活现象,p GBKT7-RhIAA4不存在自激活现象。网络蛋白互作预测Rharf6和RhIAA4存在关系,点对点验证证明其互作。使用Mating法对两个基因分别进行酵母双杂交筛库,Rharf6筛选到RhMYB1、RhMYB44、RhPCL和RhEF1a这4个互作蛋白,RhIAA4筛选到Rharf6-like为互作蛋白,对筛选出的蛋白进行生物信息学分析并且点对点使用验证互作。综上所述,月季弯梗部位的IAA激素含量存在分布不均匀,Rharf6和RhIAA4作为生长素相关基因在弯梗的各部分存在特异性表达,异源转化模式植物发现Rharf6参与花器官发育,花青素调控等方面,RhIAA4参与花青素调控、株型调控、莲座叶和角果的生长发育的一系列过程,通过酵母双杂交确认Rh

关键词：月季 arf转录因子 AUX/IAA 生长素不均匀分布弯梗

miR160及其靶基因Csarf18调控西红花苷生物合成分子机制研究

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miR160及其靶基因CsARF18调控西红花苷生物合成分子机制研究

作者：朱晓蕾浙江农林大学

学位级别：硕士

西红花亦称番红花、藏红花,是鸢尾科植物番红花(Crocus sativus L.)的干燥柱头,广泛应用于医药、食品调味和着色等领域,是新“浙八味”之一,为浙江省重点发展的中药材品种。西红花因其具有活血的功效,主要用于治疗心郁气结等症。现代药... 详细信息

西红花亦称番红花、藏红花,是鸢尾科植物番红花(Crocus sativus L.)的干燥柱头,广泛应用于医药、食品调味和着色等领域,是新“浙八味”之一,为浙江省重点发展的中药材品种。西红花因其具有活血的功效,主要用于治疗心郁气结等症。现代药理研究表明,西红花对心血管疾病、神经系统疾病等都有显著疗效。但由于其三倍体不育特性及入药部位的特殊性,导致价格昂贵且资源长期短缺。同时,长期无性繁殖及不合理的留种,使其种性退化,抗性下降,导致药材品质不稳定。西红花苷、西红花苦素等物质是西红花主要化学成分,是发挥药效的物质基础,通常也以西红花苷等物质含量评价西红花的品质。研究表明,不同产地所产的西红花的西红花苷含量存在较大差异,造成西红花药材质量的良莠不齐。因此,阐明西红花苷类物质的生物合成调控机制,对于提高西红花药材品质极为重要。前期研究发现Me JA诱导可促进西红花苷等的生物合成,且多个arf转录因子表达发生显著变化。鉴于arf介导了多种信号,涉及植物生长和次生代谢的调控,本研究对西红花arf家族进行筛选和克隆分析,并对其表达模式和调控西红花苷生物合成功能进行研究。为进一步揭示arf调控西红花苷生物合成调控网络,分别对Me JA处理后0 h、0.5 h、6 h西红花miRNA进行测序分析,鉴定西红花中保守的miRNA和预测新的miRNA,并且筛选响应JA信号的miRNA。并通过降解组筛选靶向arf转录因子家族的miRNA。主要研究结果如下:1.对西红花arf转录因子家族进行筛选分析,经序列注释、去冗余和多序列比对一共筛选到34条Csarf蛋白,命名为Csarf1～Csarf34。34条Csarf蛋白都具有arf转录因子的特征结构域B3和Auxin＿resp。理化性质分析大多数Csarf蛋白为不稳定性亲水蛋白,通过保守基序与系统发育分析发现Csarf被分为4个亚家族,Class I为转录激活分支,Class II则为转录抑制分支,可利用亲缘关系预测未知蛋白的功能。外源Me JA处理对大多数Csarf的表达具有显著促进作用,且表达量随时间推移表现为不同程度上调,表明大多数Csarfs正响应了JA信号。将34条arf与类胡萝卜素代谢途径酶基因表达进行相关性分析,发现大多数Csarf与西红花苷代谢途径的酶基因具有高度相关性,其中Csarf18与西红花苷合成的相关度最高,一共与36个关键酶基因呈现中高度相关,与ZDS4、ALDH7、β-GS1、BCH4、ALDH4、CCD4-2呈现高度正相关,但是Csarf18与β-GS10、ALDH11、β-GS6为高度负相关因此我们选择将Csarf18作为研究对象,揭示其在西红花苷合成过程中的作用,并开展克隆分析,并通过在线软件分析理化性质、预测二三级结构。亚细胞定位结果显示,Csarf18细胞核和细胞膜上均有表达。2.初步筛选到Cspro PSY1、Cspro ALDH5具有Aux REs,JASPAR在线网站预测到Cspro PSY1、Cspro ALDH5与Csarf18存在结合位点。利用酵母单杂交试验验证Csarf18与Cspro PSY1、Cspro ALDH5存在互作关系,酵母单杂交试验发现含有Csarf18转录因子的酵母菌在SD/-Trp/-Ura/X-β-gal能够长出蓝色酵母菌斑,而阴性对照和阳性对照则不能生长出酵母蓝色菌斑,说明Csarf18可以与Cspro PSY1、Cspro ALDH5进行结合;双荧光素酶报告实验结果显示,Cspro PSY1、Cspro ALDH5的荧光降低,Csarf18均显著抑制了Cspro PSY1、Cspro ALDH5启动下游LUC基因表达活性,结果说明Csarf18为转录抑制因子。验证与Csarf18相互作用的下游靶基因,进一步研究Csarf18的生物学功能和作用机制,能揭示arf转录因子调控西红花苷生物合成。3.为深入揭示arf18抑制因子介导JA信号对西红花苷生物合成调控机制,挖掘调控arf转录因子的miRNA,对Me JA处理后不同时间段的西红花miRNA组进行了测序分析。共鉴定出2 440条miRNA序列,包括已知miRNA序列1 795条和新预测的645条。最终生成的成熟miRNA序列长度范围在18～24 nt之间,miRNA大小的差异可能使它们在功能上不同,其中长度为21 nt的miRNA占比最多达到35.8%。miRNA剪切位点分布分析结果表明第十位碱基为A的miRNA比例最高达到38.30%。miRNA高通量测序可对Me JA处理前后的表达模式进行分析,鉴定出一共有105个差异表达的miRNA(DEMs,differentially expressed miRNAs)。通过降解组预测到1769个miRNA靶基因2 927个,对D

关键词：西红花西红花苷 arf转录因子 miRNA 代谢调控

杜鹃花arfs转录因子Rmarfgn的克隆和生物信息学分析

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种子科技 2017年第7期35卷 53-54页

作者：李菲贵州师范大学贵州贵阳550001

生长素是重要的植物激素,参与调控植物生长、发育和器官分化等几乎所有生理过程。生长素响应因子家族是生长素发挥调控功能的重要基因,在生长素信号传导过程中起重要的作用。从百里杜鹃景区广泛种植的高山杜鹃中克隆了一个arf类转录因... 详细信息

生长素是重要的植物激素,参与调控植物生长、发育和器官分化等几乎所有生理过程。生长素响应因子家族是生长素发挥调控功能的重要基因,在生长素信号传导过程中起重要的作用。从百里杜鹃景区广泛种植的高山杜鹃中克隆了一个arf类转录因子基因,命名为Rmarfgn。该基因编码蛋白含700个氨基酸,与水稻生长素早期响应基因Osarf1高度相似。通过调控Rmarfgn基因在杜鹃花内的表达,可以控制杜鹃花的花期和器官形态。该研究为杜鹃花的发育调控打下了基础。

关键词：杜鹃花花器官 arf转录因子

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桑树arf基因家族的鉴定与表达分析

桑树ARF基因家族的鉴定与表达分析