检索结果-南通市图书馆

作者：王峣中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

研究背景与目的:尤文肉瘤（ES,Ewing Sarcoma）常被认为是间充质干细胞起源的原发性骨与软组织恶性肿瘤,是儿童与青少年中第二常见的骨源性恶性肿瘤,发病率仅次于骨肉瘤,约每150万人1例。尤文肉瘤可发病于身体任何部位,80%发生于骨,最... 详细信息

研究背景与目的:尤文肉瘤（ES,Ewing Sarcoma）常被认为是间充质干细胞起源的原发性骨与软组织恶性肿瘤,是儿童与青少年中第二常见的骨源性恶性肿瘤,发病率仅次于骨肉瘤,约每150万人1例。尤文肉瘤可发病于身体任何部位,80%发生于骨,最常见于骨盆和长骨近端;骨外尤文肉瘤更多出现在成人群体,主要发病部位位于椎旁和胸椎软组织。尤文肉瘤的治疗包括手术、局部放疗和化疗等多学科综合治疗,随着治疗水平的不断进步,针对早期、局限性的尤文肉瘤治疗逐渐成熟,患者的5年生存率保持在70%以上,然而,约百分之20%-30%的患者在确诊时伴有远处转移,这类患者的5年生存率不足30%,传统的治疗方式很难在转移患者中取得理想效果。探索尤文肉瘤发生发展的潜在分子机制,识别有效的靶向治疗和预后预测的生物标志物,会为克服当前的临床困难提供更多机会。在肿瘤的发生进展中,肿瘤细胞生长和生存所依赖的微环境起着至关重要的作用。肿瘤部分由一个复杂的肿瘤微环境（TME,Tumor micro-environment）构成,不仅包括肿瘤细胞,还包括驻留的成纤维细胞（肿瘤相关成纤维细胞;CAFs,Cancer-associated Fibroblasts）和巨噬细胞,远处募集的免疫浸润细胞如髓系细胞和淋巴细胞、骨髓来源的细胞（BMDCs,Bone Marrow-derived Cells）如内皮祖细胞和造血祖细胞等。这些细胞可以分泌产生各种细胞因子、趋化因子、生长因子和新生血管,调节肿瘤的发生发展。因此,通过分析肿瘤微环境的异质性和复杂性,可以识别不同肿瘤的免疫特性,提高对免疫治疗反应的指导和预测能力,并有利于寻找新的治疗靶点。本课题拟从肿瘤微环境为切入点,分析评估尤文肉瘤的免疫特性,探索调控尤文肉瘤发生进展的肿瘤微环境相关基因及潜在机制,为尤文肉瘤的诊断与治疗提供新的理论依据。第一部分基于尤文肉瘤肿瘤微环境特征的预后分析与基因筛选研究方法:我们通过整合分析基因表达综合数据库（GEO,Gene Expression Omnibus）中的相关尤文肉瘤m RNA基因芯片数据,利用ESTIMATE算法（Estimation of STromal and Immune cells in MAlignant Tumour tissues using Expression data）对芯片样本进行肿瘤纯度、基质细胞存在水平和免疫细胞浸润水平进行评分。结合计算得出的基质评分和免疫评分,我们进而以加权基因共表达网络分析算法（WGCNA,Weighted correlation network analysis）探索与尤文肉瘤肿瘤微环境（ES-TME）相关的基因集,我们对基因集中的基因进行了单因素Cox生存分析和Lasso回归分析,筛选与预后相关的候选基因并构建预后模型（ES Score）来评估其对ES的临床评估效果。我们利用国际肿瘤基因组协作组数据库（ICGC,International Cancer Genome Consortium）中尤文肉瘤的测序数据检验预后模型的效益和候选基因的可靠性以得出影响预后的关键ES-TME基因。最后我们基于美国肿瘤患者数据库（TCGA,The Cancer Genome Atlas）检测该关键基因在泛癌中的表达情况,初步评价其在恶性肿瘤中的作用,并分析验证其潜在的免疫调节功能。研究结果:通过生物信息学分析,我们发现通过ESTIMATE算法赋值的免疫评分和基质评分都作为预后危险因素,与肿瘤纯度显著负相关。基于免疫微环境评分进行预后相关分析的进一步筛选,得出arap3、PODXL、CCL18和CTSC为尤文肉瘤预后相关的ES-TME候选基因并构建预后模型。模型评价和生存分析提示arap3在GEO基因芯片和ICGC测序数据中均作为关键的不良预后因子影响患者的总体生存率（OS,Overall Survival）和无事件生存率（EFS,Event-free Survival）。结合文献检索,我们认为arap3可能在尤文肉瘤的发生发展中具有重要的调控作用。TCGA泛癌表达谱分析提示,arap3在不同肿瘤中的表达具有差异性,在乳腺癌、宫颈癌、肺癌等肿瘤中显著低表达;在胆管癌、前列腺癌、胰腺癌等肿瘤中显著高表达,提示arap3在不同肿瘤中的作用和表型可能具有较大异质性。免疫相关分析表明arap3参与到诸多免疫活动,可能是潜在的免疫调节靶点。结论:尤文肉瘤的免疫微环境在疾病的进展与预后中起重要调节作用,通过对尤文肉瘤基因芯片数据的免疫和基质评分及预后相关分析,发现arap3可以作为尤文肉瘤潜在的作用靶点。第二部分arap3对尤文肉瘤恶性生物学行为的作用研究方法:收集尤文肉瘤细胞系和临床患者的组织标本,利用qRT-PCR、Western Blot和IHC染色技术明确arap3的表达谱。进一步利用RNA干扰技术（RNAi,RNA interference）在尤文肉

关键词：尤文肉瘤 arap3 肿瘤微环境巨噬细胞破骨细胞

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arap3-VAV2新结合方式鉴定与功能分析

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安徽医科大学学报 2019年第1期54卷 27-32页

作者：徐光生许文娟宋雪燕王峰松安徽医科大学生命科学学院生物学系合肥230032

目的探索腺苷二磷酸糖基化因子6的鸟苷三磷酸酶激活蛋白3(arap3)与VAV鸟苷交换因子2(VAV2)新的作用方式及可能的生理功能。方法通过构建VAV2和arap3的突变体,在人子宫颈癌细胞(HeLa细胞)中共转VAV2的野生型和APAP3的突变体或者在人胚胎... 详细信息

目的探索腺苷二磷酸糖基化因子6的鸟苷三磷酸酶激活蛋白3(arap3)与VAV鸟苷交换因子2(VAV2)新的作用方式及可能的生理功能。方法通过构建VAV2和arap3的突变体,在人子宫颈癌细胞(HeLa细胞)中共转VAV2的野生型和APAP3的突变体或者在人胚胎肾细胞(HEK-293T细胞)中共转arap3的野生型和VAV2的突变体,免疫共沉淀揭示二者的相互作用方式;在HeLa细胞中分别过表达VAV2和arap3野生型或突变体,荧光标记实验观察它们对纤维状肌动蛋白(F-actin)的调控作用。结果除了肉瘤基因同源2(SH2)结构域以外,VAV2的N端(1-660氨基酸)区域亦能介导其与arap3的相互作用,HeLa细胞中过表达VAV2和arap3均能影响细胞内F-actin的形成。结论 VAV2多个结构域均能介导其与arap3相互作用,两者之间的相互作用可能是促进大鼠肉瘤同源癌基因A(Rho A)活性的动态变化或循环,从而调节细胞内F-actin动态性以及肿瘤细胞的迁移和侵染能力。

关键词： arap3 VAV2 磷酸化 F-actin

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人源arap3的PH-ArfGAP，人源EFA6A的Sec7及E.coli T蛋白CM结构域的结构研究

人源Arap3的PH-ArfGAP，人源EFA6A的Sec7及E.coli T蛋白CM结构域...

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作者：谢长林安徽农业大学

学位级别：硕士

小GTP酶是一类单体的G蛋白，通过在活性态和非活性态之间的转换，参与细胞信号的调控。GTP酶激活蛋白(GTPase–activating proteins,GAPs)和GTP酶鸟苷酸交换因子(Guanine-nucleotide exchange factors,GEFs)共同参与调节这一转换，前者... 详细信息

小GTP酶是一类单体的G蛋白，通过在活性态和非活性态之间的转换，参与细胞信号的调控。GTP酶激活蛋白(GTPase–activating proteins,GAPs)和GTP酶鸟苷酸交换因子(Guanine-nucleotide exchange factors,GEFs)共同参与调节这一转换，前者促进小GTP酶水解，后者帮助小GTP酶结合GTP。harap3是具有ArfGAP和RhoGAP的双GAP活性的激活蛋白。harap3有9个结构域，包含1个SAM、5个PH、1个ArfGAP、1个RhoGAP和ANK重复结构域。它在细胞扁平伪足的形成，细胞的迁移，细胞骨架的重组和细胞质膜的运输过程中发挥着重要的作用。根据前期的研究成果:边界为329-641氨基酸残基的Tev-PH-ArfGAP结构域在大肠杆菌中高效表达，但无法得到适合核磁三共振实验的蛋白质样品。通过优化表达载体获得Thrombin-PH-ArfGAP融合蛋白，其酶切效率相较于前期Tev-PH-ArfGAP的10h酶切40%提高到4h酶切100%，且无需二次Ni-NTA柱纯化。PH-ArfGAP对于温度较为敏感，这些改善减少了核磁样品的纯化流程和时间，有利于提高其在收集核磁数据时的稳定性。随后的1H,15N HSQC实验表明重组表达的目的蛋白具有一定的二级结构。通过PH-ArfGAP和Arf6的核磁滴定实验结果显示在PH-ArfGAP的1H,15N HSQC谱图中，有部分交叉峰消失或移动，二者是否有相互作用还在进一步探索中。运用核磁三共振技术收集了有效的数据，PH-ArfGAP的主链化学位移认证工作已经完成。作为Arf6的GEF，hEFA6A蛋白对Arf6有高度的选择性和亲和性。它参与调节细胞内膜的循环，引起肌动蛋白细胞骨架的重组，调控树突棘的发育和巩固。hEFA6A全长1024个氨基酸，包括1个PH，1个Sec7，2个富含脯氨酸区域和一个无规则卷曲的区域，Sec7结构域起核心的GEF催化作用，PH结构域起定位于质膜的作用。本研究在大肠杆菌中原核表达Sec7(497-719)结构域，初次表达纯化，发现目的蛋白降解严重。通过分析Uniprot，Jpred，NCBI，Expript的比对和预测结果，选择7种不同边界的残基：Sec7(481-719)、Sec7(467-719)、Sec7(497-726)、Sec7(467-734)、Sec7(530-719)、Sec7(519-719)、Sec7(506-719)来探索结构域的稳定性。经过Ni-NTA柱和Superdex200柱纯化，SDS-PAGE电泳检测结果表明: Sec7(530-719)在室温下18d天后无明显的降解。随后的1H,15N HSQC实验表明重组表达的Sec7(530-719)具有一定的二级结构且溶液状态良好，为其后续的研究奠定了基础。越来越多的研究表明许多致病菌的病原性与生物体内莽草酸途径中分支酸变位酶(Chorismate mutase, CM)的存在有着密切的关系，因此CM成为了开发新型抗生素和抗菌药物的热门靶标酶。采用分子克隆的方法，在感受态细胞BL21-Gold(DE3)中重组表达E.coli T蛋白的CM（CMT）。通过Ni-NTA亲和层析柱、Superdex75凝胶过滤层析柱和MonoQ阳离子交换层析柱纯化后得到电泳纯的重组蛋白，质谱鉴定结果与原始序列基本吻合。经过蛋白质晶体试剂盒的初步筛选，30天后在30%PEG4000，100mM NaAc pH4.6，200mM NH4Ac条件中发现CMT晶体，但晶体无衍射能力，且通过传统的“网络法”优化无法得到高衍射能力的晶体。利用核磁共振技术，分析CMT的1H,15N HSQC谱图信息，发现当蛋白浓度在4mg/mL以下时蛋白均一性良好，但浓度上升到8mg/mL以上时蛋白出现严重的聚合;同时发现低浓度的Chaps对CMT的聚合有明显的改善。结合以上信息，指导设计CMT晶体的优化方案，获得了高衍射能力的CMT晶体，为CMT结构的解析奠定了坚实的基础。

关键词： arap3 PH-ArfGAP结构域 EFA6A Sec7结构域 T蛋白 CM结构域

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