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药学学报 2024年第7期 2108-2116页

作者：刘宇冲李虎峰李科秦雪梅杜昱光李震宇山西大学中医药现代研究中心山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室地产中药功效物质研究与利用山西省重点实验室中国科学院过程工程研究所

黄芪多糖是黄芪中免疫调节活性最强,含量最为丰富的物质,具有抗肿瘤、抗病毒、免疫促进等多种生物活性,临床应用广泛。前期研究发现黄芪多糖主要由2种不同相对分子质量多糖aps-Ⅰ(>2 000 kDa)、aps-ⅱ(10 kDa)组成, aps-ⅱ(10 kDa)为黄... 详细信息

黄芪多糖是黄芪中免疫调节活性最强,含量最为丰富的物质,具有抗肿瘤、抗病毒、免疫促进等多种生物活性,临床应用广泛。前期研究发现黄芪多糖主要由2种不同相对分子质量多糖aps-Ⅰ(>2 000 kDa)、aps-ⅱ(10 kDa)组成, aps-ⅱ(10 kDa)为黄芪多糖中活性最强组分,并采用α-1,4-葡聚糖内切酶将aps-ⅱ降解为寡糖,通过体外免疫活性筛选发现2～9糖整体免疫活性较低,而10～14糖具有较强的免疫活性,且活性优于未降解的aps-ⅱ。为了探究aps-ⅱ降解寡糖发挥免疫活性的关键结构,本文采用MALDI-TOF-MS生物质谱以及高分辨质谱仪器ESIQ Exactive-MS对aps酶解寡糖进行解析,通过对比发现10～14糖中存在1→4和1→6两种连接方式共存的支链结构,推测1→4和1→6两种连接方式共存的支链结构为aps-ⅱ发挥免疫活性的关键结构,为黄芪多糖和寡糖的构效关系研究奠定理论基础。

关键词： aps-ⅱ 酶解连接方式结构解析高分辨质谱

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黄芪活性多糖aps-ⅱ及其α-1,4葡聚糖内切酶降解寡糖的结构解析

黄芪活性多糖APS-Ⅱ及其α-1,4葡聚糖内切酶降解寡糖的结构解析

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作者：李虎峰山西大学

学位级别：硕士

选题依据:黄芪多糖是黄芪中免疫调节活性最强,含量最为丰富的物质之一,还具有抗肿瘤,抗糖尿病等多种生物活性。已证明黄芪多糖组分aps-ⅱ是黄芪发挥免疫活性的主要物质基础。然而由于多糖分子量大,结构难于测定,限制了黄芪多糖构效关系... 详细信息

选题依据:黄芪多糖是黄芪中免疫调节活性最强,含量最为丰富的物质之一,还具有抗肿瘤,抗糖尿病等多种生物活性。已证明黄芪多糖组分aps-ⅱ是黄芪发挥免疫活性的主要物质基础。然而由于多糖分子量大,结构难于测定,限制了黄芪多糖构效关系的深入研究。效仿蛋白质结构研究方式,采用自下而上,将多糖降解为寡糖,结合质谱技术,是目前研究多糖结构的重要途径之一。前期课题组采用α-1,4-葡聚糖内切酶将aps-ⅱ降解为寡糖,将不同聚合度寡糖制备为四个组分1～3糖、3～6糖、7～14糖和10～18糖,通过体外免疫活性筛选发现7～18糖具有较强的免疫活性。对四个组分寡糖进行单糖组成、连接位点以及高分辨质谱负离子解析,发现2～9糖均为α-1→4连接的线性葡聚糖,并得出aps-ⅱ酶解寡糖的活性与C-2和C-6支化程度密切相关的结论。但前期研究中10糖以上以及糖链分支结构不明确,缺少糖链序列结构信息以及存在的同分异构体的寡糖结构也未能得到解析。全甲基化不仅可以提高糖链在MS检测中的灵敏度,还可以简化糖链分子在MS/MS和MSn中的裂解过程,裂解更具有规律性,适用于糖链序列结构解析。同时全甲基化可以降低糖链极性,使得全甲基化糖链在RP-HPLC反相柱中更容易得到分离,有利于aps-ⅱ酶解寡糖中同分异构体的分离分析。因此本研究将基于非衍生化和衍生化(全甲基化)两种方式结合高分辨质谱(正离子)对aps-ⅱ酶解寡糖进行结构解析和验证。研究结果为获取丰富精确的黄芪寡糖结构信息以及为阐明黄芪多糖免疫促进活性的构效关系奠定基础。目的:利用离子色谱,气质(GC-MS)甲基化分析、核磁共振波谱(NMR)对aps-ⅱ单糖组成,连接方式进行分析,对α-1→4连接葡聚糖2～8糖标品进行非衍生化和全甲基化高分辨质谱裂解规律研究。采用MALDI-TOF-MS对aps-ⅱ酶解寡糖进行分子量表征并结合高分辨质谱对非衍生化和全甲基化酶解寡糖结构进行解析和验证,找出同分异构体寡糖,明确支链结构信息。研究方法:1.通过DEAE-52对免疫活性组分aps-ⅱ进行分离纯化,结合离子色谱对aps-ⅱ中中性和酸性多糖组分进行单糖组成分析,同时采用GC-MS以及NMR对aps-ⅱ中糖残基连接方式,异头碳构型进行分析。2.对免疫活性组分aps-ⅱ进行酶降解,采用MALDI-TOF-MS和ESI-Q Exactive-MS高分辨质谱(正离子)对α-1→4连接葡聚糖标品2～8进行裂解规律研究以及对aps-ⅱ酶解后寡糖进行分子量表征和结构序列解析。3.对α-1→4连接葡聚糖标品2～8和aps-ⅱ酶解后的寡糖进行衍生化(全甲基化),通过采用MALDI-TOF-MS和ESI-Q Exactive-MS高分辨质谱(正离子)对全甲基化α-1→4葡聚糖标品2～8裂解规律进行研究,以及对aps-ⅱ酶解后全甲基化的寡糖进行结构解析,包括酶解寡糖同分异构体的解析。研究结果:1.本研究采用离子色谱对aps-ⅱ单糖组成进行分析,得出水洗组分,0.2 mol·L-1NaCl组分,0.5 mol·L-1NaCl组分和1.0 mol·L-1NaCl组分四个组分单糖组成及摩尔比,表明aps-ⅱ存在部分酸性糖链,含量占比为10%。水洗组分为中性多糖,主要以葡萄糖为主;在NaCl洗脱组分中首次发现了木糖、甘露糖,盐酸氨基半乳糖、盐酸氨基葡萄糖等单糖种类。对不同浓度NaCl洗脱组分中单糖绝对含量分析得出,推测鼠李糖与半乳糖醛酸存在同一酸性糖链中,阿拉伯糖与半乳糖存在同一酸性糖链中,木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸存在同一酸性糖链中,为aps-ⅱ酸性糖链的结构解析提供单糖组成基础。同时采用GC-MS和NMR对aps-ⅱ单糖连接方式进行分析,得出aps-ⅱ中主要存在糖残基连接方式为→4)-(α-D-Glcp-(1→,→6)-α-D-Glcp-(1→,同时存在→4,6)-α-D-Glcp-(1→,→2,4)-α-D-Glcp-(1→等分支位点。1→4 和 1→6 的连接方式与2,6位的分支结构可能是aps-II发挥免疫促进活性的关键结构。2.本研究主要采用MALDI-TOF-MS对1-4连接葡聚糖2～8糖标品进行分子量分析,得到分子离子峰,并通过ESI-Q Exactive-MS高分辨质谱技术对相应分子离子峰进行二级碎片提取,分析1→4连接葡聚糖2～8裂解规律,1→4连接主要发生0,2An跨环断裂,产生质量数为60中性丢失。寡糖分子离子加和物主要为Na+,钠化低聚糖可以观察到3个主要的解离通道,即糖苷键断链、跨环解离(CnH2nOn低聚物中性丢失)和脱水,脱水反应和交叉环解离主要发生在还原端的异头碳上,即跨环断链主要产生A型离子;从跨环解离中性丢失m=18和90表明存在1→3连接;中性丢失m=18和60表明存在1→4连接;中性丢失m=18、60和120表明存在1→6连接。通过内切α-1,4-葡聚糖内切酶对黄芪多糖aps-ⅱ降解,采用MALDI-TOF-MS

关键词： aps-ⅱ 酶解结构解析全甲基化高分辨质谱

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黄芪活性多糖aps-ⅱ的酸降解及其降解寡糖的结构和免疫活性研究

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药学学报 2021年第8期56卷 2266-2275页

作者：石丽霞李科焦思明崔连杰秦雪梅杜昱光李震宇李晓霞山西大学中医药现代研究中心山西太原030006 山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室山西太原030006 地产中药功效物质研究与利用山西省重点实验室山西太原030006 中国科学院过程工程研究所北京100190 山西省果业工作总站山西太原030001

课题组前期研究发现黄芪免疫活性多糖aps-ⅱ具有较强的免疫活性,鉴于其分子量较大且结构复杂,本文旨在建立aps-ⅱ酸降解的最优方法,对降解产物进行结构初探与分离制备以后,通过体外免疫细胞实验筛选免疫活性最强的寡糖活性中心。本研究... 详细信息

课题组前期研究发现黄芪免疫活性多糖aps-ⅱ具有较强的免疫活性,鉴于其分子量较大且结构复杂,本文旨在建立aps-ⅱ酸降解的最优方法,对降解产物进行结构初探与分离制备以后,通过体外免疫细胞实验筛选免疫活性最强的寡糖活性中心。本研究以aps-ⅱ为研究对象,采用“自上而下”的研究策略,首先通过单因素试验和正交试验优化了aps-ⅱ酸降解的最佳条件,接着以最佳条件制备的黄芪寡糖通过亲水作用色谱-电喷雾电离源-高分辨飞行时间质谱进行结构解析,然后将黄芪寡糖通过纯化制备色谱仪分离制备不同聚合度的寡糖片段,最后利用体外免疫细胞从多角度筛选免疫活性中心片段。结果表明aps-ⅱ的最佳酸解条件为水解温度80℃,三氟乙酸浓度1.0 mol·L-1,水解时间1 h;该降解条件具有良好的重复性;降解产物黄芪寡糖含有主链1→4连接的六碳醛聚糖结构;6个寡糖片段的免疫活性筛选实验表明分子量较大的寡糖具有更强的免疫促进作用,推测黄芪寡糖的免疫活性中心位于聚合度DP9~DP19的糖链中。动物福利和实验过程均遵循山西大学动物伦理委员会的规定。该结果对其他中药寡糖的研究具有一定示范作用,为黄芪寡糖的结构表征及构效关系研究奠定基础,同时可以促进黄芪寡糖药物的开发。

关键词： aps-ⅱ 部分酸水解质谱解析分离制备免疫活性评价

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黄芪多糖中抗炎组分的结构及其活性的初步研究

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山西医科大学学报 2021年第10期52卷 1346-1356页

作者：范信晖李科杨一丹秦雪梅李震宇李雪琴山西大学中医药现代研究中心太原030006 山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室中国科学院过程工程研究所

目的从黄芪中分离得到两种多糖,分别对两种多糖的化学结构和抗炎活性进行分析。方法采用水提醇沉法提取黄芪总多糖(Astragalus polysaccharides,aps),膜分离法得到两种多糖aps-Ⅰ和aps-ⅱ。高效凝胶色谱法(HPGPC)测定aps-Ⅰ和aps-ⅱ的... 详细信息

目的从黄芪中分离得到两种多糖,分别对两种多糖的化学结构和抗炎活性进行分析。方法采用水提醇沉法提取黄芪总多糖(Astragalus polysaccharides,aps),膜分离法得到两种多糖aps-Ⅰ和aps-ⅱ。高效凝胶色谱法(HPGPC)测定aps-Ⅰ和aps-ⅱ的分子量,高效液相色谱法(HPLC-UV)测定两者的单糖组成,通过红外(IR)及甲基化分析对aps-Ⅰ和aps-ⅱ的结构进行表征。将巨噬细胞株RAW264.7培养于含不同浓度aps、aps-Ⅰ和aps-ⅱ的培养基,MTT法筛选合适的实验浓度,采用1μg/ml LPS诱导巨噬细胞株RAW264.7建立细胞炎症模型,应用不同浓度aps、aps-Ⅰ和aps-ⅱ处理被LPS诱导活化的巨噬细胞株RAW264.7,利用ELISA试剂盒测定各组细胞培养上清液一氧化碳(NO)、白细胞介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量。结果aps由aps-Ⅰ(大于2000 kD)和aps-ⅱ(10 kD)组成;两者均由鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)和半乳糖醛酸(GalA)5种单糖组成,aps-Ⅰ中Rha,Gal A,Glu,Gal,Ara的比例为0.1∶0.39∶17.2∶13.4∶1;在aps-ⅱ中为0.14∶0.14∶24.04∶9.6∶1;红外光谱显示aps-Ⅰ以β型糖苷键为主;aps-ⅱ同时包含α型糖苷键和β型糖苷键;甲基化分析显示两者单糖残基的主要连接方式不同,分别为:→4)-D-Glu-(1→,→6)-D-Gal-(1→,→4)-L-Ara-(1→和→4)-D-Glu-(1→,→3,5)-D-Glu-(1→,→3,4)-D-Gal-(1→。MTT实验表明aps、aps-Ⅰ和aps-ⅱ在0-100μg/ml质量浓度范围内无细胞毒性。与空白对照相比,1μg/ml LPS可显著上调巨噬细胞株RAW264.7中NO、TNF-α和IL-10的表达(Paps、aps-Ⅰ和aps-ⅱ干预,可抑制促炎因子NO和TNF-α表达上调,促进抑炎因子IL-10表达上调(Paps-Ⅰ>aps>aps-ⅱ。结论aps-Ⅰ的体外抗炎活性优于aps-ⅱ,可作为潜在的抗炎药物进行开发。

关键词：黄芪多糖分离纯化结构表征 aps-Ⅰ aps-ⅱ 抗炎活性

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