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不同TNM分期结直肠癌患者血清MMP7、ape1及CA-242表达差异及其与预后的相关性研究

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临床和实验医学杂志 2024年第1期23卷 65-69页

作者：王志尚薛兰辉王佳延安大学附属医院肿瘤科陕西延安716000

目的分析不同TNM分期结直肠癌患者血清基质金属蛋白酶7(MMP7)、脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1(ape1)、糖类抗原242(CA-242)表达差异及其与预后的相关性。方法回顾性选取2018年4月至2022年4月延安大学附属医院收治的100例结直肠癌患者作为研... 详细信息

目的分析不同TNM分期结直肠癌患者血清基质金属蛋白酶7(MMP7)、脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1(ape1)、糖类抗原242(CA-242)表达差异及其与预后的相关性。方法回顾性选取2018年4月至2022年4月延安大学附属医院收治的100例结直肠癌患者作为研究对象,根据TNM分期将患者分为Ⅰ~Ⅱ期组(n=42)、Ⅲ~Ⅳ期组(n=58);另将同期收治的50例结直肠良性增生患者纳入对照组。随访1年记录结直肠癌患者的生存率,将存活患者纳入预后良好组(n=83),另将死亡患者纳入预后不良组(n=17)。检测所有患者的血清MMP7、ape1、CA-242水平。建立多因素Logistic模型分析TNM分期结直肠癌预后的影响因素,并分析血清MMP7、ape1、CA-242与不同TNM分期结直肠癌患者预后的相关性(双变量Spearman相关性法检验)及其预后预测价值。结果Ⅰ~Ⅱ期患者血清MMP7、ape1、CA-242水平分别为(32.54±3.65)μg/L、(0.39±0.04)ng/mL、(22.54±3.54)U/mL,Ⅲ~Ⅳ期患者血清MMP7、ape1、CA-242水平分别为(42.84±3.84)μg/L、(0.54±0.05)ng/mL、(42.16±4.35)U/mL,均高于对照组[(20.65±2.45)μg/L、(0.21±0.02)ng/mL、(8.24±1.12)U/mL],差异均有统计学意义(Pape1、CA-242水平分别为(41.58±3.58)μg/L、(0.52±0.04)ng/mL、(40.25±4.12)U/mL,均高于预后良好组[(33.24±3.41)μg/L、(0.41±0.04)ng/mL、(23.46±3.61)U/mL],差异均有统计学意义(Pape1、CA-242均为影响结直肠癌预后的独立危险因素(Pape1、CA-242与Ⅰ~Ⅱ期、Ⅲ~Ⅳ期预后不良均呈正相关(Pape1、CA-242与MMP7+ape1+CA-242肺癌化疗预后预测中的曲线下面积均大于0.75。结论血清MMP7、ape1及CA-242在结直肠癌中均呈高表达,且与病情进展及其预后存在一定关联,可为治疗方案的指导和预后的预测提供科学的参考依据。

关键词：结直肠癌 TNM分期 MMP7 ape1 CA-242 预后

Clinical Significance of Apurinic/Apyrimidinic Endodeoxyribonuclease 1 and MicroRNA Axis in Hepatocellular Carcinoma

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Journal of Clinical and Translational Hepatology 2023年第6期11卷 1291-1307页

作者： Giovanna Mangiapane Devis Pascut Emiliano Dalla Giulia Antoniali Monica Degrassi Lory Saveria Crocè Veronica De Sanctis Silvano Piazza Giulia Canarutto Claudio Tiribelli Gianluca Tell Laboratory of Molecular Biology and DNA Repair Department of MedicineUniversity of UdineUdineItaly Fondazione Italiana Fegato-ONLUS Liver Cancer UnitTriesteItaly Department of Medical Sciences University of TriesteTriesteItaly Clinica Patologie Fegato Azienda Sanitaria Universitaria Giuliano Isontina(ASUGI)TriesteItaly NGS Core Facility Department CIBIOUniversity of TrentoTrentoItaly Computational Biology International Centre for Genetic Engineering and BiotechnologyICGEBTriesteItaly

Background and Aims:Identification of prognostic factors for hepatocellular carcinoma(HCC)opens new perspectives for therapy.Circulating and cellular onco-miRNAs are noncoding RNAs which can control the expression of genes involved in oncogenesis through post-transcriptional mechanisms.These microRNAs(miRNAs)are considered novel prognostic and predictive factors in HCC.The apurinic/apyrimidinic endodeoxyribonuclease 1(ape1)contributes to the quality control and processing of specific onco-miRNAs and is a negative prognostic factor in several tumors.The present work aims to:a)define ape1 prognostic value in HCC;b)identify miRNAs regulated by ape1 and their relative target genes and c)study their prognostic value.Methods:We used The Cancer Genome Atlas(commonly known as TCGA)data analysis to evaluate the expression of ape1 in HCC.To identify differentially-expressed miRNAs(DEmiRNAs)upon ape1 depletion through specific small interfering RNA,we used NGS and nanostring approaches in the JHH-6 HCC tumor cell line.Bioinformatics analyses were performed to identify signaling pathways involving ape1-regulated miRNAs.Microarray analysis was performed to identify miRNAs correlating with serum ape1 expression.Results:ape1 is considerably overexpressed in HCC tissues compared to normal liver,according to the TCGA-liver HCC(known as LIHC)dataset.Enrichment analyses showed that ape1-regulated miRNAs are implicated in signaling and metabolic pathways linked to cell proliferation,transformation,and angiogenesis,identifying Cyclin Dependent Kinase 6 and Lysosomal Associated Membrane Protein 2 as targets.miR-33a-5p,miR-769,and miR-877 are related to lower overall survival in HCC patients.Through array profiling,we identified eight circulating DE-miRNAs associated with ape1 overexpression.A training phase identified positive association between sape1 and miR-3180-3p and miR-769.Conclusions:ape1 regulates specific miRNAs having prognostic value in HCC.

关键词： ape1 miRNAs Prognostic factors Hepatocellular carcinoma

A simple and sensitive assay for apurinic/apyrimidinic endonuclease 1activity based on host-guest interaction of β-cyclodextrin polymer and pyrene

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Chinese Chemical Letters 2018年第6期29卷 973-976页

作者： Maogui Zhou Shiya Qin Zhenzhen Feng Chunxia Song Hua Zhang Wenshan Li Qing Wang Jianbo Liu Jin Huang Xiaohai Yang Kemin Wang State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics College of Chemistry and Chemical Engineering Key Laboratory for Bio-Nanotechnology and Molecular Engineering of Hunan Province Hunan University School of Science Anhui Agricultural University

Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1（ape1） plays an important role in protecting the fidelity of genetic material and is also a promising biomarker of cancers. Herein, a simple and sensitive fluorescent method for ape1 activity detection was designed based on host-guest interaction between β-cyclodextrin polymer（β-CDP） and pyrene. In this method, pyrene-labelled DNA probes（AP-S1 S2） and β-CDP functioned as fluorescent signal producer and enhancer, respectively. When ape1 was absent, pyrene on the AP-S1 S2 could not enter the cavity of β-CDP because of steric hindrance, leading to a weak fluorescence intensity/anisotropy. When ape1 was present, it would recognize and cleave AP site in APS1 S2, thus producing a dissociated pyrene-labelled oligonucleotide segment. Pyrene labelled at the 50 end of oligonucleotide segment could be easily trapped into the cavity of β-CDP via host-guest interaction, leading to a significant enhancement of fluorescence intensity/anisotropy. This assay offered a dynamic range of 0.05 U/m L–5 U/m L and an estimated detection limit of 0.05 U/m L. Furthermore,assessment of ape1 activity in He La cell extracts was successfully implemented, which hold the potential for ape1-related cancer diagnosis and biological researches.

关键词： ape1 Host-guest interaction Fluorescence β-Cyclodextrin polymer Pyrene

基于功能化芘类化合物构建电致化学发光生物传感器用于ape1活性检测的研究

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基于功能化芘类化合物构建电致化学发光生物传感器用于APE1活性检...

作者：柴朵朵西南大学

学位级别：硕士

电致化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)由于其结合了电化学分析技术和化学发光技术,同时具备了背景低、重现性好、动态范围宽、检测灵敏度高和可控性好等独特的优势,使其成为检测蛋白、酶、核酸等多种生物分子的有力分析工具。尽... 详细信息

电致化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)由于其结合了电化学分析技术和化学发光技术,同时具备了背景低、重现性好、动态范围宽、检测灵敏度高和可控性好等独特的优势,使其成为检测蛋白、酶、核酸等多种生物分子的有力分析工具。尽管如此,ECL技术在应用过程中还存在一些挑战和限制,其中主要包括以下两个方面:(1)如何开发具有良好分散性和稳定性的新型ECL有机纳米材料,以克服自由基不稳定而导致的低发光效率问题,从而进一步提高传感器的灵敏度;(2)如何在复杂生物体系中实现低丰度蛋白酶的高效转化和信号放大,以提高传感器的分析性能。基于此,本研究采用功能化的芘类化合物作为ECL发光体并结合改进的核酸扩增技术,构建高稳定性、高灵敏的ECL传感平台,实现了对脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(Apurinic/apyrimidinic endoonuclease 1,ape1)活性的超灵敏检测。具体而言,本论文的研究工作主要分为以下几个部分:1.Ag@Pyc纳米胶囊作为ECL发光体用于超灵敏测定ape1活性的研究多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)因具有高荧光量子产率、良好的光化学稳定性以及出色的光电性质,是一种极具应用潜力的ECL发光材料。然而,它们在水溶液中溶解度较低、自由基不稳定导致其在水相中的ECL信号较弱,这严重限制了其在ECL生物传感领域的进一步使用。为此,本研究合成了新型自促进的Ag功能化芘甲醛纳米胶囊(Ag@Pyc纳米胶囊)作为ECL发光体,以构建超灵敏的ECL生物传感器平台用于ape1活性的检测。其中,Ag@Pyc纳米胶囊具有良好的亲水性和稳定性,并且Ag纳米颗粒作为共反应促进剂附着在Pyc纳米胶囊表面,显著提高了单位时间内共反应试剂过硫酸根(SO)生成反应中间体硫酸盐自由基阴离子(SO)的数量,进而与发光体相互作用,以产生强烈的ECL信号。另一方面,借助ape1触发的3D DNA纳米机器,将低丰度靶标ape1转化为大量的模拟目标物(MTs),这些MTs与ape1活性呈正相关。因此该生物传感器实现了对ape1活性的灵敏检测,其线性范围为5×10～5×10 U/μL,检测限为1.36×10 U/μL。所构建的ECL三元体系为生物分子检测和疾病早期诊断提供了新的途径。2.基于Pyc@GO纳米片的ECL传感平台结合目标物触发可循环级联系统用于超灵敏检测ape1活性的研究大多数有机纳米晶体在水溶液中会发生由聚集引起的淬灭效应,这是因为平面结构的多环芳烃通常会π-π堆叠,导致严重的内滤效应和过多的非活性发光体,这限制了发光体的ECL效率。鉴于此,本文制备了芘甲醛@氧化石墨烯(Pyc@GO)纳米片作为高效的ECL发光体,建立了一种新型ECL生物传感平台用于ape1活性的超灵敏检测。值得注意的是,芘甲醛(Pyc)分子通过超分子作用π-π堆积在氧化石墨烯(GO)表面形成稳定的复合纳米片,使得Pyc分子更好的分散在GO表面,改善了Pyc分子自身的π-π堆叠。与紧密堆积的多环芳烃纳米晶相比,Pyc@GO显著降低了内滤效应和减少了非活性发光体,实现了强的ECL发射。另一方面,ape1作用后的发夹作为引发剂以激活可循环级联放大系统,通过催化发夹自组装(Catalytic hairpin assembly,CHA)与DNAzyme裂解的协同交叉催化,从而提高信号放大能力。因此,该ECL生物检测平台实现了对ape1活性的超灵敏检测,线性范围为10～10 U/m L,检测限为4.6×10 U/m L。因此,所开发的策略为ECL技术在生物分析中的应用提供了新的思路和方法。3.Pyc@γ-CD超分子微纳材料作为ECL发光体结合AND逻辑门系统实现对双重肿瘤标志物检测的研究邻位触及电路的信号传递主要依赖于蛋白结合引起的结构变化。然而,亲和探针的立足点通常以单链的形式暴露其中,其非特异性结合会导致出现假阳性结果。基于此,本研究设计了由双重目标物触发的发夹锁式邻位触及电路,结合芘甲醛@γ-环糊精(Pyc@γ-CD)超分子微纳材料作为ECL发光体,构建了基于双输入调节单输出ECL信号的“AND”逻辑门系统,用于双重肿瘤标志物的检测。良好的发夹锁有效抑制了电路的信号泄露,降低了背景信号,提高了对靶标检测的灵敏度和准确度。另一方面,得益于主客体识别效应,Pyc分子在特定的微/纳米空间中有序组装,使得所合成的Pyc@γ-CD超分子微纳材料有效地限制了发光分子的振动和旋转,抑制非辐射弛豫,实现显著增强的ECL响应。因此,所构建的ECL传感器为双重肿瘤标志物的高效灵敏检测提供了新的思路和方向,该策略有望在肿瘤细胞的筛选区分和准确诊断中发挥重要作用。

关键词：芘甲醛 π-π堆叠 ape1 电致化学发光生物传感器信号放大

棉酚联合多西他赛、顺铂治疗ape1高表达晚期非小细胞肺癌的随机、双盲、安慰剂对照临床试验

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棉酚联合多西他赛、顺铂治疗APE1高表达晚期非小细胞肺癌的随机、...

作者：汪雨潇中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

研究背景:大多数非小细胞肺癌(Non-small cell Lung cancer,NSCLC)患者在诊断时已经是晚期,失去了手术切除的机会而选择化疗。化疗作为晚期NSCLC的主体治疗措施,长期以来疗效并未得到提高。含铂化疗方案是NSCLC治疗的一线方案,因此解决... 详细信息

研究背景:大多数非小细胞肺癌(Non-small cell Lung cancer,NSCLC)患者在诊断时已经是晚期,失去了手术切除的机会而选择化疗。化疗作为晚期NSCLC的主体治疗措施,长期以来疗效并未得到提高。含铂化疗方案是NSCLC治疗的一线方案,因此解决铂类药物抵抗可能是提高化疗疗效的关键。脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyimidinic endonuclease 1,ape1)的过度表达是晚期NSCLC铂类抵抗的重要原因。而棉酚作为ape1的抑制剂,与多西他赛和顺铂联合使用,被认为可以提高ape1高表达晚期NSCLC的化疗疗效。研究方法:62名患者被随机分为两组。实验组31名患者在化疗的第1天接受75mg/m2多西他赛和75mg/m2顺铂治疗,并在第1至14天每天服用20mg棉酚,21天为一个周期。对照组接受相同剂量的安慰剂加多西他赛和顺铂方案。研究主要终点是无疾病进展生存期(PFS);次要终点包括总生存期(OS)、疾病控制率(DCR)、客观缓解率(ORR)和毒性。研究结果:实验组和对照组之间的PFS和OS没有显著差异。实验组和对照组的中位PFS(m PFS)分别为7.43和4.9个月(HR=0.54;p=0.06),中位OS(m OS)分别为18.37和14.7个月(HR=0.68;p=0.27)。两组之间的客观缓解率和严重不良事件无显著差异。研究结论:虽然本试验的主要研究终点PFS在实验组与对照组间的比较统计学上没有显著性差异,但实验组的m PFS较对照组有明显延长的趋势。棉酚联合多西他赛和顺铂的方案具有良好的耐受性,未来将进行更大样本量的研究。

关键词：棉酚非小细胞肺癌 ape1 多西他赛顺铂

SOX2调控ape1参与非小细胞肺癌顺铂耐药的机制研究

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SOX2调控APE1参与非小细胞肺癌顺铂耐药的机制研究

作者：陈泰聿成都医学院

学位级别：硕士

研究背景与目的:以顺铂为基础的化疗在非小细胞肺癌的治疗中仍占有重要地位,而广泛发生的顺铂耐药事件是困扰临床治疗的难点。SOX2作为转录因子,参与到多种肿瘤包括肺癌的发生发展中。前期研究显示SOX2参与到顺铂耐药事件中,但其具体机... 详细信息

研究背景与目的:以顺铂为基础的化疗在非小细胞肺癌的治疗中仍占有重要地位,而广泛发生的顺铂耐药事件是困扰临床治疗的难点。SOX2作为转录因子,参与到多种肿瘤包括肺癌的发生发展中。前期研究显示SOX2参与到顺铂耐药事件中,但其具体机制不详。本研究着眼于SOX2在非小细胞肺癌顺铂耐药细胞A549/CDDP中的表达及其生物作用,并探索可能的调控信号,以期为逆转顺铂耐药提供新靶点。材料与方法:（1）通过体外实验评估了敲低或过表达SOX2对细胞生长、活力、增殖和凋亡的影响。（2）采用蛋白质印迹法（WB）、实时定量PCR（qPCR）、免疫组织化学（IHC）和荧光素酶报告实验探究其潜在机制。（3）Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验被用于评估SOX2表达与患者生存之间的关系。结果:（1）与亲代A549细胞相比,A549/CDDP细胞具有更强的细胞生长、活性和增殖能力,而凋亡更少。SOX2蛋白和mRNA在A549/CDDP细胞中的表达高于A549细胞。在A549/CDDP细胞中敲低SOX2可通过抑制克隆形成和细胞活性来诱导细胞凋亡,而过表达SOX2可增强细胞增殖并减轻凋亡。（2）Genomatix软件预测ape1启动子具有一些SOX2结合位点,而SOX2启动子没有ape1结合位点。进而,经双荧光素酶报告基因检测证实,在293T细胞,SOX2通过与ape1的启动子结合来调控ape1表达。敲低ape1可以逆转顺铂耐药,而在OE-SOX2共转染的情况下,又显著降低了细胞凋亡。（3）低表达SOX2或ape1的患者,较高表达SOX2或ape1的患者存活时间更长。结论:siSOX2通过调控ape1信号逆转顺铂耐药,为克服NSCLC顺铂耐药提供了新的靶点。

关键词：非小细胞肺癌化疗耐药 SOX2 ape1

构建DNA walker纳米器件用于超灵敏检测ape1酶的研究

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构建DNA walker纳米器件用于超灵敏检测APE1酶的研究

作者：王兴丛北京化工大学

学位级别：硕士

研究表明,ape1酶作为一种细胞内多功能酶,在肿瘤细胞中存在异常表达,其水平通常会升高,因此,ape1作为一种重要的肿瘤标志物,对于肿瘤的筛查与治疗至关重要。迄今为止,在已发表的研究中有许多检测方法,比如SERS传感检测、酶联免疫吸附测... 详细信息

研究表明,ape1酶作为一种细胞内多功能酶,在肿瘤细胞中存在异常表达,其水平通常会升高,因此,ape1作为一种重要的肿瘤标志物,对于肿瘤的筛查与治疗至关重要。迄今为止,在已发表的研究中有许多检测方法,比如SERS传感检测、酶联免疫吸附测定,但是对ape1的检测手段还不够丰富,已经实现的检测范围及检测限远远达不到更理想的要求,因此,对ape1的进一步探索研究至关重要。DNA walker是一种DNA分子机器,其中的组成核酸可以沿着预定的轨道进行移动,DNA walker的渐进运动提供了执行多项任务和信号放大的可能性,为分子运输、生物传感和生物合成提供了有价值的平台,目前已有很多利用DNA walker良好的信号放大能力构建生物传感器的报道。本论文致力于而开发新的DNA walker行走启动模式并同靶标检测结合,此外考虑引入细胞里内源性物质提供持续行走的驱动,希望为基于DNA walker纳米器件的生物传感成像等应用提供新的设计思路和策略。基于DNA walker的信号放大能力结合电化学/荧光等高灵敏度检测手段,我们以ape1酶作为walker启动的触发开关,成功实现了对靶标ape1酶的超灵敏检测分析,并且实现了对Hela与L929细胞裂解液中ape1的区分。具体来说,本文主要涉及了两个工作,主要内容如下:(1)基于双足DNA walker的电化学生物传感器用于ape1酶的超灵敏检测在第二章的工作中,首先,我们选择构建单链双足DNA walker,基于双足walker具有更高的稳定性与行走效率,以实现比单足walker更高效的行走和信号放大。此外,由于电化学检测方法更灵敏、成本更低、信号响应好,选择利用电化学作为分析检测手段。为了进一步提高电化学信号的电流响应,我们在DNA walker行走后叠加了杂交链式反应(HCR),将walker器件与HCR结合设计了双重信号放大策略,利用HCR产物链的特点,吸附更多的MB电化学信号分子,获得更强的信号响应。主要设计原理为:金电极表面修饰发夹DNA-H1,双足walker识别靶标ape1后被释放,进一步打开H1并利用H2发生链置换反应。产生的H1/H2双链可以引发H3、H4的HCR反应以生成长的双链DNA结构,亚甲基蓝分子(MB)通过静电吸附与ss DNA结合,或通过π-π叠加作用与双链DNA结合,以产生强烈的电化学信号。最终我们实现了不同靶标浓度的检测,并且发现ape1酶浓度在0.001 U/ml到1 U/ml的范围内有良好的线性关系,检测限为0.001 U/ml。整个过程简单易行、响应迅速、灵敏度高、检测限低,并对肿瘤细胞和正常细胞的裂解液进行了检测,成功的实现了对肿瘤细胞内ape1的高灵敏度检测分析。(2)基于AuNPs构造三维多足DNA walker用于ape1酶的荧光分析在前边的工作中,电化学分析检测法能够有效的对ape1进行超灵敏的体外检查,我们试图寻找能否使用荧光手段做出同样的检测范围,并能在之后实现体内检测。因此,在第三章的工作中,我们利用金纳米粒子(AuNPs)有良好的生物相容性并且具有荧光猝灭的作用,结合三维DNA walker的优点,构建了基于两种金球的DNA walker体系,其中一种AuNP-W充当多足DNA walker的作用,另一种金球AuNP-T充当轨道的作用。我们选择内源性ATP驱动DNA walker的持续行走,在整个体系中,ape1酶切启动walker行走,将DNA walker的信号放大作用与灵敏的荧光分析结合,可以实时的监控DNA walker运动后所产生的荧光变化。一系列的实验结果表明,随着ape1酶浓度的增加,荧光信号越高,且浓度与荧光值有良好的线性关系,其检测限为0.033 U/ml。最后,对细胞中提取的细胞裂解液进行了同样的分析,证实了其可以有效的区分癌细胞与正常细胞。总之,第三章的实验工作将ape1酶切启动、ATP驱动3D DNA walker持续行走与金纳米粒子自身能够猝灭荧光基团的特点结合,可以实现荧光实时定量,过程简单易行、响应迅速,成功的用于ape1的检测,并且为进一步探索细胞内成像ape1奠定了基础。

关键词： DNA walker ape1 生物传感器电化学分析荧光检测

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1荧光探针的制备及其肿瘤诊断研究

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脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1荧光探针的制备及其肿瘤诊断研究

作者：任美北京化工大学

学位级别：硕士

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(ape1)是一种表达于不同亚细胞间的蛋白酶,在不同的生理功能中发挥着重要作用。ape1的异常表达和亚细胞功能障碍与多种肿瘤疾病的发生有关,所以ape1可作为一种肿瘤标志物诊断癌症,因此开发快速、灵敏的ape1检... 详细信息

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(ape1)是一种表达于不同亚细胞间的蛋白酶,在不同的生理功能中发挥着重要作用。ape1的异常表达和亚细胞功能障碍与多种肿瘤疾病的发生有关,所以ape1可作为一种肿瘤标志物诊断癌症,因此开发快速、灵敏的ape1检测方法变得尤为重要。本论文利用精氨酸与双链DNA(ds DNA)修饰的聚酰胺-酰负载苝酰亚胺衍生物四氯苝酐染料(TA),构建了一种快速、灵敏检测ape1的纳米荧光探针(TA@PR-ds DNA),并将其应用于体外检测。具体的研究内容和结果如下:1、水溶性TA纳米荧光染料的制备。为了提高检测速度,首先将精氨酸(R)修饰至聚酰胺-胺(PAMAM)表面(PR),得到精氨酸修饰的聚酰胺-胺(PR)。通过调整精氨酸和PAMAM的摩尔比,得到三种不同接枝率的PR聚合物,分别为13%(PR13)、33%(PR33)、68%(PR68),选用这三种聚合物分别包裹TA染料,通过优化PR与TA的浓度,得到粒径约为74 nm的TA@PR13,68 nm的TA@PR33,98 nm的TA@PR68,且粒子的稳定性良好。通过PR包裹TA改善了染料间π-π堆积作用,提高了其在水相中的分散性和荧光强度,同时三种纳米荧光染料具有良好的光稳定性,且荧光发射波长在600 nm左右,能够避免细胞内自发荧光等背景信号的干扰。2、TA@PR的特异性ds DNA修饰。在细胞水平,TA@PR68具有良好的生物相容性和较快的细胞摄取速度,能够实现ape1的快速检测,所以选用TA@PR68进行带有AP位点和淬灭基团BHQ2的ds DNA修饰得到TA@PR-ds DNA。调整TA@PR和ds DNA浓度,优化制备的TA@PR-ds DNA粒径约为122 nm,单分散性良好,表面电位约为7.23 m V。3、ape1的体外检测。TA@PR-ds DNA具有高的灵敏度,ape1检测范围1.2-25 U m L,检测限为1.1 U m L。综上所述,我们构建了一种快速、特异性检测ape1的纳米荧光探针,具有良好的生物相容性和快速的细胞摄取能力。它能够实现多种癌细胞ape1的快速、灵敏地检测,为肿瘤的初期诊断开辟了新的思路和途径。

关键词： ape1 PAMAM 精氨酸苝酰亚胺荧光检测

酶介导的DNA Walker生物传感器用于癌细胞标志物的检测

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酶介导的DNA Walker生物传感器用于癌细胞标志物的检测

作者：孟金亭北京化工大学

学位级别：硕士

生物传感器可以结合生物传感元件和化学物理传感器,将对生物分子的识别事件转化为可输出的信号实现对一些癌细胞标志物的检测。由于不借助信号放大技术,传统的生物传感器在实现体内体外癌细胞标志物的微量与灵敏检测方面存在很大的局限... 详细信息

生物传感器可以结合生物传感元件和化学物理传感器,将对生物分子的识别事件转化为可输出的信号实现对一些癌细胞标志物的检测。由于不借助信号放大技术,传统的生物传感器在实现体内体外癌细胞标志物的微量与灵敏检测方面存在很大的局限性,因此借助一些非酶介导或酶介导的信号放大技术可以在一定的反应条件下实现对癌症标志物的扩增检测。DNA Walker是一种新型的人工动态DNA纳米器件,依靠DNA行走链沿特定的行走轨道在各种驱动力作为能量供应的情况下,持续运动来实现信号的不断扩增。基于DNA Walker丰富的种类及多样的驱动力,将其应用于生物传感器的设计也是极具潜力的。因此,本论文致力于借助核酸信号放大技术联合核酸酶驱动的DNA Walker纳米器件构建级联扩增信号放大体系,进而构造不同信号类型的生物传感器,具有优异的特异性识别和实际样品应用性,较低的检测限,可实现对癌细胞标志物的高灵敏检测分析。具体来讲,本研究主要包括以下两部分内容:(1)在第一部分工作中,我们主要构造了一种基于ape1酶介导的三足DNA Walker可再生生物传感器用于电化学检测mi RNA-155。在该工作中,我们选择了在癌细胞中过度表达的mi RNA-155作为待测靶标和后续DNA Walker的启动开关。靶标触发H1、H2和H3发夹之间的CHA反应形成三足DNA Walker,此过程不仅实现了对靶标的循环扩增,同时将DNA Walker的三个足整合在一个结构上,与单足DNA Walker相比有更大的行走速率和扩增速率。三足DNA Walker识别金电极表面的轨道链,再借助核酸酶ape1驱动三足DNA Walker的持续行走,酶切水解轨道链引起电极表面DNA链嵌入的MB信号分子数量改变,从而呈现出与靶标浓度相关的电化学信号变化。将CHA、ape1酶切驱动的DNA Walker行走串联起来构建级联扩增信号放大策略结合快速响应的电化学检测手段结合起来,实现了对mi RNA-155的高灵敏度检测,检测限低至10 p M,并且它在相对较宽的浓度范围呈现较好的线性关系。且表现出优异的特异性分析能力和抗交叉干扰能力,在10%和20%的血清样品中也表现出了良好的分析能力。本工作进一步通过合理设计链置换策略,不仅提高了检测体系的电信号响应,还实现了电极的多次循环再生,降低了检测成本。因此,该工作为电极再生提供了新思路,在癌细胞相关的多种标志物检测中有广泛的应用前景。(2)在第二部分工作中,我们建立了一个新型的细胞内源性双酶协同开启和驱动DNA Walker运动构建的双模生物传感器。为了实现这个目标,我们利用了Au NP优异的生物学兼容性、丰富的负载位点和荧光猝灭特性,并结合了DNA Walker的连续行走运动的信号扩增放大策略,建立了一个全新的纳米装置,以实现双模检测ape1酶的功能。靶标ape1酶启动DNA Walker与荧光轨道链的结合,选择内源性核酸酶FEN1作为驱动力,驱动DNA Walker在3D轨道上持续运动带来荧光信号的恢复,实现了荧光检测模块对ape1酶的灵敏检测,在0-500 U m L的浓度范围内,ape1酶含量越高,其荧光强度越强,且在浓度范围为0.01-10 U m L内呈现出良好的线性关系。此外,荧光检测模式的检测限低至0.01 U m L。级联上游DNA Walker信号放大策略和下游的HCR放大策略,再借助SWV这种电化学检测手段,在电化学检测模块进一步提高了对ape1酶检测的灵敏度,线性范围拓宽至0.01-50 U m L,检测限降低至0.002 U m L。并且双重检测模式均实现了对ape1酶的特异性检测,可以有效区分癌细胞与正常细胞中的ape1含量。综上所述,我们发现这种双模生物传感器拥有极高的敏感度、特异性和实际应用性,并且在生物学检测、疾病的早期诊断方面有着广阔的应用前景。

关键词：荧光生物传感器电化学生物传感器核酸酶 DNA Walker ape1 FEN1