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anoctamin家族中钙激活氯离子通道调节剂筛选及应用研究进展

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中国药理学与毒理学杂志 2024年第6期38卷 445-454页

作者：吴明达洪啟元兰月娇姚岚习诗婷刘雪莹高俊涛郑锴郝峰吉林医药学院检验学院吉林吉林132013 吉林医药学院公共卫生学院吉林吉林132013 吉林省人民医院吉林长春130021 北华大学医学技术学院吉林吉林132013 吉林医药学院基础医学院吉林吉林132013

钙激活氯离子通道(CaCC)是一类能通过胞内钙离子激活转运氯离子的通道蛋白,其主要在神经元和肌细胞中参与调节膜电位、细胞内钙平衡和细胞兴奋性等重要的生理作用。anoctamin(ano)家族中ano1是最经典的CaCC,ano1的靶向调节剂对癌症、囊... 详细信息

钙激活氯离子通道(CaCC)是一类能通过胞内钙离子激活转运氯离子的通道蛋白,其主要在神经元和肌细胞中参与调节膜电位、细胞内钙平衡和细胞兴奋性等重要的生理作用。anoctamin(ano)家族中ano1是最经典的CaCC,ano1的靶向调节剂对癌症、囊性纤维化、高血压、腹泻和哮喘等疾病具有潜在治疗作用。自2008年ano1首次被发现后,先后出现了多种CaCC特异性调节剂的筛选方法,主要包括基于荧光蛋白的高通量初级筛选、电生理膜片钳技术和虚拟筛选,进而发现了多种药理学作用不同的小分子调节剂。本文综述了目前较为主流的筛选方法的原理和优缺点,并对迄今发现的ano1特异性调节剂的化学结构和潜在的应用进展进行综述。

关键词：钙激活氯离子通道 anoctamin ano1 ano2 高通量筛选特异性调节剂

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ano1介导肿瘤恶性生物学行为的机制探讨

现代肿瘤医学 2024年第3期32卷 561-565页

作者：郑晓恬高凤彤石权叶红莲白立川潘晓丽中国医科大学盛京医院神经功能科辽宁沈阳110000 中国医科大学药学院离子通道研究室辽宁沈阳110000

ano1又称为TMEM16A,其作为钙激活的电压依赖性氯通道的分子基础之一,广泛分布于体内多种组织器官,介导了支气管腺体分泌、痛觉、肠道慢波形成等多种生理功能;同时ano1参与了多种病理过程的发生、发展,如恶性肿瘤、炎症等。多项报导证实... 详细信息

ano1又称为TMEM16A,其作为钙激活的电压依赖性氯通道的分子基础之一,广泛分布于体内多种组织器官,介导了支气管腺体分泌、痛觉、肠道慢波形成等多种生理功能;同时ano1参与了多种病理过程的发生、发展,如恶性肿瘤、炎症等。多项报导证实了恶性肿瘤发病过程中通过多种信号通路引起ano1的高表达,继而高表达的ano1激活不同的下游信号通路提高了肿瘤细胞的恶性生物学行为。本文主要探讨恶性肿瘤中高表达的ano1提高肿瘤细胞恶性生物学行为的可能机制。

关键词： ano1 增殖迁移浸润信号通路

The Ca^(2+)-activated chloride channel ano1/TMEM16A:An emerging therapeutic target for epithelium-originated diseases?

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2021年第6期11卷 1412-1433页

作者： Yani Liu Zongtao Liu KeWei Wang Department of Pharmacology School of PharmacyQingdao University Medical CollegeQingdao 266073China Institute of Innovative Drugs Qingdao UniversityQingdao 266021China Department of Clinical Laboratory Qingdao Third People's HospitalQingdao 266041China

anoctamin 1(ano1) or TMEM16 A gene encodes a member of Ca^(2+) activated Cl^(-) channels(CaCCs) that are critical for physiological functions,such as epithelial secretion,smooth muscle contraction and sensory signal transduction.The attraction and interest in ano1/TMEM16 A arise from a decade long investigations that abnormal expression or dysfunction of ano1 is involved in many pathological phenotypes and diseases,including asthma,neuropathic pain,hypertension and cancer.However,the lack of specific modulators of ano1 has impeded the efforts to validate ano1 as a therapeutic target.This review focuses on the recent progress made in understanding of the pathophysiological functions of CaCC ano1 and the current modulators used as pharmacological tools,hopefully illustrating a broad spectrum of ano1 channelopathy and a path forward for this target validation.

关键词： Ca^(2+)-activated Cl^(-)channels(CaCCs) ano1 TMEM16A CaCCinh-A01 T16Ainh-A01 Drug target Cancer Cystic fibrosis

Identification of Herbal Compound Imperatorin with Adverse Effects on ano1 and CFTR Chloride Channels

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Chemical Research in Chinese Universities 2011年第3期27卷 461-463页

作者： HAO Feng YI Fei ZHANG Di N1NG Yan SU Wei-heng FENG Xue-chao YANG Hong MA Tong-hui Membrane Channel Research Laboratory Northeast Normal University Changchun 130024 P. R. China School of Life Sciences Liaoning Normal University Dalian 116029 P. R. China

Calcium-activated chloride channels（CaCCs） are the crucial regulators of transepithelial fluid secretion, smooth muscle contraction and sensory transduction. Recently, compelling evidence has indicated that TMEM16A（ano1 or anoctamin-1） is a bona fide calcium-acvtivated chloride channel. A few small molecule CaCCs regulators are available for functional and therapeutic studies. We screened 126 natural compounds from Chinese herbs. Screening was performed with an iodide influx assay in Fischer rat thyroid epithelial cells to coexpress ano1 and an iodide-sensitive fluorescent indicator（EYFP-H148Q/I152L）. Imperatorin, a coumarin compound, was identified to inhibit ano1-mediated chloride transport activated by multiple calcium-elevating agonists. The inhibitory effect is dose-dependent with IC50～14.63 μmol/L. Interestingly, imperatorin activated CFTR chloride channel with EC50～35.52 μmol/L. The adverse effects of imperatorin on CaCC and CFTR chloride channels will make it useful in pharmacological dissection of chloride transport in airway and intestinal epithelium. Further studies are required to evaluate the therapeutic effects of imperatorin on hypertension, asthma and certain tumors.

关键词： Calcium-acvtivated chloride channel（CaCC） ano1 Imperatorin Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator（CFTR）

ano1参与内皮素-1诱导的血管平滑肌细胞增殖功能的研究

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ANO1参与内皮素-1诱导的血管平滑肌细胞增殖功能的研究

作者：吴雪青岛大学

学位级别：硕士

研究目的:原发性高血压(或高血压病)是最常见的心血管疾病,其发病机制复杂。长期的高血压会导致血管重构,后者在高血压发生发展以及靶器官损伤中发挥关键作用。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)功能异常是血管重构... 详细信息

研究目的:原发性高血压(或高血压病)是最常见的心血管疾病,其发病机制复杂。长期的高血压会导致血管重构,后者在高血压发生发展以及靶器官损伤中发挥关键作用。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)功能异常是血管重构的关键机制。内皮素-1(endothelin-1,ET-1)是一种主要由内皮细胞合成和分泌的肽类物质,具有很强的缩血管作用和促细胞增殖作用,在高血压的血管重构中有重要作用。TMEM16A或anoctamin-1(简称ano1)是2008年发现的钙激活氯通道,广泛分布于各种血管组织,可通过调控血管收缩参与血压的调节。此外,在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)发现:VSMCs上ano1呈高表达并促进高血压形成,但是迄今为止,VSMCs上ano1高表达的机制不明。我们前期研究已经发现血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)能显著上调VSMCs ano1表达,而ET-1和Ang II都是血浆中最重要的血管活性物质,二者都可诱导钙激活的氯电流。我们推测,ET-1也可能上调VSMCs的ano1表达。因此,本研究利用正常大鼠原代培养的VSMCs,首先观察了ET-1对ano1表达的影响及其受体机制,其次应用ano1抑制剂T16Ainh-A01(A01),探讨了ano1在ET-1诱导的VSMCs增殖中的作用及其可能机制。研究内容:1.观察ET-1对VSMCs上ano1表达的影响及其受体机制。2.分别以LY294002(PI3K抑制剂)和PD98059(MEK抑制剂)进行预处理,观察AKT和ERK信号通路对ET-1诱导的ano1高表达的影响。3.利用MTT法和PCNA蛋白检测,观察ano1抑制剂A01对ET-1诱导的细胞增殖的影响。4.观察ano1抑制剂A01对ET-1诱导的细胞周期调控蛋白(CDK4、Cyclin D1、p21)和细胞表型蛋白(α-SMA、OPN)表达的影响。研究方法:正常Wistar大鼠麻醉后快速分离胸主动脉,以组织贴块法进行VSMCs的原代培养。采用MTT法检测细胞存活率,利用Western blot法进行相关蛋白水平检测。研究结果:1.本实验观察了ET-1对ano1蛋白表达的影响。结果显示:以0.1、1、10、100、1000 nmol/L ET-1处理细胞24 h后,ano1表达水平为(1.02±0.05)、(1.25±0.06)、(0.94±0.06)、(0.89±0.04)和(1.00±0.05),以1 nmol/L ET-1上调ano1的作用最显著(Pano1表达水平为(0.88±0.06)、(0.90±0.09)、(1.05±0.09)、(1.26±0.04)和(1.13±0.06),其中ET-1作用24 h时ano1水平达到峰值(Pano1表达。后续实验中,选用1 nmol/L ET-1处理细胞24 h。2.为探讨ET-1上调ano1的受体机制,ET-1处理前加入1μmol/L ZD4054(ETA受体阻断剂)以观察其阻断作用。结果显示:与对照组(0.82±0.03)相比,ET-1组ano1表达水平显著升高(0.96±0.04,Pano1蛋白表达明显下降(0.80±0.04,Pano1蛋白表达。3.为验证ET-1可能通过PI3K/AKT途径上调ano1表达,以10μmol/L LY294002(LY,PI3K抑制剂)进行预处理,同时检测AKT和ano1表达水平的变化。AKT结果:与对照组(1.06±0.02)相比,ET-1处理后,p-AKT/AKT蛋白水平升高至(1.24±0.06,Pano1结果:与对照组(0.92±0.08)相比,ET-1处理后,ano1蛋白水平升高至(1.26±0.03,Pano1蛋白水平下降至(0.76±0.08,Pano1蛋白可能是通过激活PI3K/AKT途径实现的。4.为验证ET-1还可能通过MEK/ERK途径上调ano1表达,以20μmol/L PD98059(PD,MEK抑制剂)进行预处理,同时观察ERK和ano1表达水平。ERK结果:与对照组(0.90±0.06)相比,ET-1处理后,p-ERK/ERK蛋白水平升高至(1.11±0.05,P<0.05);加入PD作用后,与ET组相比,p-ERK/ERK蛋白水平下降至(

关键词： ano1 内皮素-1 血管平滑肌细胞细胞增殖表型转换

钙激活氯通道ano1调控菌群胆汁酸代谢在小鼠结肠炎中的作用

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钙激活氯通道ANO1调控菌群胆汁酸代谢在小鼠结肠炎中的作用

作者：杨阅闻大连医科大学

学位级别：硕士

研究背景炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是一种慢性的免疫介导的肠道疾病,临床分型包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）。患者主要症状为腹泻、腹痛、血便、体重减轻,长期炎症... 详细信息

研究背景炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是一种慢性的免疫介导的肠道疾病,临床分型包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）。患者主要症状为腹泻、腹痛、血便、体重减轻,长期炎症可累及全身器官。中重度长期溃疡性结肠炎是结肠癌发生的高危因素之一。IBD发病机制复杂,与遗传和环境因素密切相关,肠道微生物与肠道免疫相互作用失调是IBD重要的发病机制之一。对临床受试者的大量研究表明,IBD患者和健康个体之间的肠道微生物群存在差异。IBD患者肠道微生物群的一致观察结果是微生物多样性降低,厚壁菌减少和变形杆菌增加。也有研究发现患者的拟杆菌、梭菌、瘤胃球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌和粪杆菌的水平降低,而大肠杆菌和梭杆菌的水平增加。钙激活氯通道ano1（anoctamin-1）,亦称TMEM16A或者DOG1,是一个由十个跨膜域组成的离子通道,广泛表达于多种细胞,包括上皮细胞、气道和血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、Cajal间质细胞等,并对乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食管癌、胃癌、结直肠癌等多种癌症的发生发展起到调控作用。作为氯离子通道,ano1主要生理作用是辅助调控气道或者消化道上皮细胞的黏液分泌。肠道上皮细胞分泌黏液,构建黏液屏障,对于肠道微生物定植、迁移以及迁徙至关重要,是防止病原微生物入侵的重要屏障。本研究拟探索ano1对肠道菌群的调控作用,以及其在IBD中的作用和相应机制。研究目的本研究拟构建小鼠结肠炎模型,模拟人类UC:1、探究ano1对小鼠肠道菌群的调控作用。2、探究ano1在小鼠结肠炎中的作用和机制。实验方法1.实验动物以及动物模型制备:野生型SPF级C57BL/6J小鼠（雄性,6-8W,18-22g）购自辽宁长生生物技术股份有限公司提供(许可证号:SCXK（辽）2020-0001)。运用Cre-loxp系统通过小鼠杂交方法构建ano1肠上皮特异性敲除小鼠(ano1或ano1敲除)。小鼠自由饮用七天2.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）制备结肠炎模型。检测疾病活动指数（disease activity index,DAI）,结肠长度,结肠组织学,肠道黏膜屏障来确定模型制备是否成功（伦理编号:AEE20045）。采用自由饮用混合抗生素（氨苄西林、硫酸新霉素、甲硝唑、万古霉素）法构建伪无菌小鼠。2.ano1对小鼠肠道菌群的影响采用16s RNA基因测序检测肠道菌群组成。基于荧光原位杂交（FISH）探索肠道菌群向上皮层侵袭情况。3.ano1对小鼠胆汁酸代谢的影响利用胆汁酸代谢组学检测小鼠结肠内容物的胆汁酸代谢变化。内容物收集:以CO处死小鼠后,离断自肛门至盲肠的全部肠段,纵向剪开,迅速取出内容物颗粒,液氮速冻。实验结果1.ano1敲除显著增加小鼠结肠炎严重程度:ano1模型组表现出更加严重的结肠炎症状,即DAI显著增加（Pano1敲除可显著增加小鼠对DSS诱导实验性结肠炎的易感性。2.ano1敲除影响杯状细胞分泌分化,损伤肠道屏障:ano1小鼠肠黏液层变薄（Pano1模型组黏液层厚度显著降低（Pano1敲除后,小鼠结肠黏蛋白MUC2分泌减少,杯状细胞分化成熟转录因子Hes1（pano1特异敲除不仅破坏杯状细胞分泌功能,也对其分化成熟起到抑制作用。3.ano1敲除导致肠道细菌紊乱,细菌向上皮细胞侵袭。相对于WT对照组小鼠,肠道微生物组Alpha多样性降低,Beta多样性降低（Pano1小鼠肠道菌群移植到伪无菌小鼠后,小鼠结肠炎严重程度显著增加。4.ano1敲除改变肠道菌群胆汁酸代谢,导致肠道炎症。胆汁酸代谢组学检测发现,ano1敲除小鼠总胆汁酸谱水平升高,牛磺结合类胆汁酸增加（Pano1特异性肠上皮敲除可增加小鼠结肠炎症状,破坏杯状细胞分泌功能,降低杯状细胞分化,导致肠道黏液屏障损伤,继而导致肠道菌群紊乱以及细菌向上皮层侵袭深度增加。ano1导致的肠道菌群紊乱可导致肠道菌群胆汁酸代谢失衡,诱发肠道炎症,加重小鼠结肠炎严重程度。本研究为揭示ano1在IBD疾病发生、发展过程中的作用提供科学基础和理论依据。

关键词： IBD ano1 黏膜屏障菌群-胆汁酸代谢比较医学

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TMEM16A在肿瘤中的研究进展

华中科技大学学报（医学版） 2022年第6期51卷 879-883页

作者：谭佳杰张洪范月莹宋玲冯豆武汉大学人民医院药学部武汉430060

跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A,TMEM16A)是一种钙激活的氯离子通道(calcium-activated chloride channel,CaCC),它在肿瘤中广泛过表达,对肿瘤的发生发展有着重要的影响。在各种肿瘤中,TMEM16A的过表达不仅可以促进癌细胞的增... 详细信息

跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A,TMEM16A)是一种钙激活的氯离子通道(calcium-activated chloride channel,CaCC),它在肿瘤中广泛过表达,对肿瘤的发生发展有着重要的影响。在各种肿瘤中,TMEM16A的过表达不仅可以促进癌细胞的增殖、转移和侵袭,抑制肿瘤细胞的凋亡,影响肿瘤的生长,还与肿瘤的治疗耐药、复发和预后不良有关。因此,探索TMEM16A的体内表达情况与肿瘤各个方面的关系具有重要的意义,该综述旨在总结近十年来TMEM16A在肿瘤中的研究进展,为以后TMEM16A在肿瘤中的进一步研究提供新的思路。

关键词： TMEM16A 钙激活氯离子通道 ano1 抑制剂肿瘤

ano1稳定高表达对Hep-2细胞株生物学特性的影响

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南方医科大学学报 2014年第2期34卷 251-255页

作者：李雅冬张劲松杨凯张福军陈睿陈丹重庆医科大学附属第一医院颌面外科重庆400016

目的检测ano1高表达对Hep-2细胞株生物学特性的影响。方法利用ano1稳定高表达的Hep-2细胞株先后进行流式细胞仪,软琼脂细胞生长实验,体外划痕愈合实验,SiRNA实验,SiRNA沉默ano1的体外划痕愈合实验,DIDS阻断氯离子通道实验,以明确ano1高... 详细信息

目的检测ano1高表达对Hep-2细胞株生物学特性的影响。方法利用ano1稳定高表达的Hep-2细胞株先后进行流式细胞仪,软琼脂细胞生长实验,体外划痕愈合实验,SiRNA实验,SiRNA沉默ano1的体外划痕愈合实验,DIDS阻断氯离子通道实验,以明确ano1高表达对Hep-2细胞株生长、迁移及侵袭的影响。结果流式细胞仪检测细胞周期,结果显示实验组和空白组的G0/G1期比率差异无显著性(P>0.05);软琼脂细胞生长实验结果显示实验组和对照组差异无显著性(P>0.05);体外划痕愈合实验结果显示两者差异有显著性(Pano1高表达加快了Hep-2细胞的迁移速度;SiRNA沉默ano1的体外划痕愈合实验结果显示两者差异有显著性(Pano1可减缓Hep-2细胞的迁移速度。DIDS阻断氯离子通道实验结果显示两者差异有显著性(Pano1的氯离子通道活性,并且减缓Hep-2细胞的迁移速度,再一次证明ano1参与了Hep-2细胞的迁移活动。结论 ano1高表达并未改变癌细胞的增殖速度,但却大大增加了头颈鳞癌细胞的移动能力,有望成为治疗头颈鳞癌的新靶点。

关键词：头颈鳞癌 ano1 高表达氯离子通道生物学特性 Hep-2细胞 ano1

CLCN5、ano1基因甲基化与散发性结节性甲状腺肿关系的研究

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CLCN5、ANO1基因甲基化与散发性结节性甲状腺肿关系的研究

作者：时琳琳青岛大学

学位级别：硕士

目的:研究散发性结节性甲状腺肿(sporadic nodular goiter)患者的甲状腺结节组织及结节旁正常甲状腺组织中CLCN5和ano1基因启动子区域甲基化状态差异,分析其与散发性结节性甲状腺肿发生、发展的关系。方法:1.选取40例于青岛大学附属烟... 详细信息

目的:研究散发性结节性甲状腺肿(sporadic nodular goiter)患者的甲状腺结节组织及结节旁正常甲状腺组织中CLCN5和ano1基因启动子区域甲基化状态差异,分析其与散发性结节性甲状腺肿发生、发展的关系。方法:1.选取40例于青岛大学附属烟台毓璜顶医院行甲状腺手术治疗的结节性甲状腺肿患者。对新鲜的甲状腺结节组织及结节旁正常甲状腺组织应用亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测上述组织中CLCN5及ano1基因启动子区甲基化(methylation)的情况,应用qRT-PCR、Western blot检测甲状腺结节及结节旁正常甲状腺组织中CLCN5、ano1 mRNA及其蛋白的表达情况。2.使用脂质体转染法将针对CLCN5、ano1基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和CLCN5、ano1的DNA质粒分别转染至人正常甲状腺细胞NTHY-ORI-3-1中,分别构建CLCN5、ano1基因低表达和过表达的人甲状腺细胞,应用Western blot检测构建的人甲状腺细胞中CLCN5、ano1蛋白表达情况。3.应用CCK-8分别检测ano1、CLCN5蛋白低表达和过表达的人甲状腺细胞增殖情况。结果:我们发现散发性结节性甲状腺肿患者的甲状腺结节组织中CLCN5基因启动子区甲基化水平明显高于结节旁正常甲状腺组织CLCN5基因启动子区甲基化水平(50.38±5.95%VS 24.59±5.21%),甲状腺结节组织中ano1基因启动子区甲基化水平明显高于结节旁正常甲状腺组织ano1基因启动子区甲基化水平(44.80±4.60%VS 27.37±4.60%),且两者差异均具有统计学意义(P1)。散发性结节性甲状腺肿患者的甲状腺结节组织中CLCN5 mRNA的表达量(2.625±0.525)明显高于结节旁正常甲状腺组织中CLCN5 mRNA的表达量(1±1.074),甲状腺结节组织中ano1 mRNA的表达量(2.885±0.71)明显高于结节旁正常甲状腺组织中ano1mRNA的表达量(1±0.102),两者差异均具有统计学意义(P1)。散发性结节性甲状腺肿患者的甲状腺结节组织与结节旁正常甲状腺组织相比CLCN5、ano1蛋白表达存在差异,两者差异均具有统计学意义(P1)。接下来,我们使用脂质体转染法将针对CLCN5、ano1基因的siRNA及CLCN5、ano1基因的DNA质粒转染至人正常甲状腺细胞NTHY-ORI-3-1中,分别构建了CLCN5、ano1基因低表达和过表达的甲状腺细胞,并通过Western blot实验证实了细胞转染成功。最后,我们使用CCK-8实验检测了甲状腺细胞在12h、24h、36h、48h的吸光度来反映细胞的增殖能力,发现与未经处理的正常甲状腺细胞相比,过表达ano1或CLCN5的甲状腺细胞的增殖能力升高,低表达ano1或CLCN5的甲状腺细胞的增殖能力降低。结论:我们的结果表明了散发性结节性甲状腺肿患者的甲状腺结节组织中CLCN5和ano1基因的启动子区甲基化、mRNA表达、蛋白表达水平均高于结节旁正常甲状腺组织,通过细胞实验证明了CLCN5、ano1蛋白的表达水平与甲状腺细胞增殖能力呈正相关。总之,我们的实验结果表明甲状腺细胞CLCN5、ano1基因启动子区甲基化可能参与结节性甲状腺肿发生、发展。

关键词：结节性甲状腺肿 CLCN5 ano1 DNA甲基化