检索结果-南通市图书馆

作者：周欣鸿右江民族医学院

学位级别：硕士

目的:本研究使用氯化锂-匹罗卡品诱导6周龄雄性C57BL/6J小鼠癫痫发作,检测小鼠癫痫持续状态(Status epilepticus,SE)后不同时期(0天、2周、6周)与相应正常对照组小鼠相比海马组织中线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ(Mitochondrial Complex... 详细信息

目的:本研究使用氯化锂-匹罗卡品诱导6周龄雄性C57BL/6J小鼠癫痫发作,检测小鼠癫痫持续状态(Status epilepticus,SE)后不同时期(0天、2周、6周)与相应正常对照组小鼠相比海马组织中线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ(Mitochondrial ComplexⅠ、Ⅲ、Ⅳ,ComplexⅠ、Ⅲ、Ⅳ)活性改变、ComplexⅠ、腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)浓度变化、线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm)损伤情况及腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine5’monophosphate(AMP)-activated protein,ampk)α不同亚基(ampkα、AMPKα1、ampkα2)蛋白水平表达变化,探讨在癫痫中AMPKα1对线粒体代谢功能影响的机制。采用苏木精-伊红染色(Hematoxylineosin staining,HE)染色方法,展示海马(Hippocampal,HP)CA1区、CA3区、DG区神经元细胞数量、形态变化,检测癫痫6周小鼠海马神经元细胞的变化。应用行为学相关实验检癫痫模型小鼠运动、社交及学习记忆能力。通过透射电镜技术,观察海马组织CA1区线粒体的超微结构变化。条件性过表达慢性癫痫模型小鼠,升高AMPKα1表达水平,观察慢性癫痫小鼠线粒体功能障碍及学习记忆能力减弱现象能否改善。方法:(1)54只健康6周龄雄性C57小鼠,按照SE后不同时期(0天、2周、6周)分为6组每组9只分别为正常对照组(0天、2周、6周)及癫痫模型组(0天、2周、6周),实验小鼠质量20g左右;(2)通过腹腔注射氯化锂-匹罗卡品(Lithium chloride–Pilocarpine,Li-Pilo)构建经典的颞叶癫痫SE模型,而正常对照组小鼠给予对应剂量氯化锂、地西泮注射,其余药品则被替换成相同体积的生理盐水。癫痫发作IV级或以上(持续30分钟)可纳入研究对象;(3)癫痫小鼠造模成功后,0天,2周和6周海马组织标本均在同一时间段采集后进行实验;(4)蛋白免疫印迹实验(Wetern-blot,WB)检测海马ampkα不同亚基的蛋白表达水平;(5)酶联免疫吸附实验(Elisa)实验检测小鼠海马组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性及ComplexⅠ、ATP浓度的变化趋势;(6)组织线粒体分离试剂盒提取纯化线粒体,线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测线粒体膜电位水平的变化趋势;(7)HE染色检测海马细胞形态及数量变化;(8)透射电镜实验线粒体超微结构变化;(9)使用SPSS26.0统计软件分析实验数据;(10)健康6周龄雄性小鼠(20g±1.5g)36只,分为正常对照组、癫痫模型组、AMPKα1条件性过表达组、AMPKα1条件性过表达癫痫模型组,腹腔注射氯化锂-匹罗卡品(,Li-Pilo)建立经典的颞叶癫痫SE模型,正常对照组生理盐水代替;(11)利用Flox(+/-)与Cre工具鼠交配繁育AMPKα1条件性过表达小鼠,小鼠出生后2周剪耳标记后剪尾(1cm左右);(12)试剂盒提取鼠尾组织中脱氧核糖核酸(Deoxyribo Nucle Acid,DNA),聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增,使用琼脂糖凝胶电泳实验进行初步基因型验证;(13)待基因小鼠6周龄时进行癫痫造模,造模成功6周后,行为学相关实验检测运动能力、认知功能、学习记忆能力、社交能力后断头取脑收集组织标本。(11)健康6周龄雄性小鼠(20g±1.5g)16只,分为正常对照组、癫痫6周模型组、正常对照组+A484954、癫痫6周模型组+A484954,腹腔注射氯化锂-匹罗卡品(Li-Pilo)建立经典的颞叶癫痫SE模型,正常对照组生理盐水代替;正常对照组和癫痫模型小鼠造模6周后给予腹腔注射A484954,疗程14天,其余各组注射相同浓度体积和疗程的5%DMSO。疗程结束,提取海马组织,通过蛋白免疫印迹实验检测AMPKα1表达变化。结果:(1)慢性癫痫小鼠海马组织ampkα不同亚基蛋白表达降低;(2)慢性癫痫小鼠海马组织线粒体功能损伤严重;(3)慢性癫痫小鼠海马组织线粒体超微结构损伤严重;(4)AMPKα1表达水平与线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性密切相关;(5)ampkα2表达水平与线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ活性密切相关与Ⅳ无关;(6)慢性癫痫小鼠海马组织脑细胞形态结构损伤严重、数量显著降低;(7)敲入AMPKα1基因治疗后慢性癫痫小鼠运动能力恢复正常;(8)AMPKα1条件性过表达慢性癫痫小鼠社交能力恢复正常;(9)AMPKα1条件性过表达后慢性癫痫小鼠认知功能恢复正常;(10)AMPKα1条件性过表达慢性癫痫小鼠学习与记忆能力改善。(10)注射真核细胞延伸因子2激酶(Eukaryotic elongati

关键词： AMPKα1 癫痫条件性过表达线粒体功能学习与记忆机制

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

褪黑素通过激活AMPKα1调控绵羊棕色脂肪前体细胞的分化

褪黑素通过激活AMPKα1调控绵羊棕色脂肪前体细胞的分化

引用

作者：高旭阳山西农业大学

学位级别：硕士

褪黑素(Melatonin)是一种在松果体中产生的激素,在昼夜节律的调节中起着关键作用。近年来研究表明,褪黑素参与体内诸多生理过程的调控。棕色脂肪组织(Brown Adipose Tissues,BAT)是哺乳动物体内的产热组织,活化后的BAT可有效提高哺乳动... 详细信息

褪黑素(Melatonin)是一种在松果体中产生的激素,在昼夜节律的调节中起着关键作用。近年来研究表明,褪黑素参与体内诸多生理过程的调控。棕色脂肪组织(Brown Adipose Tissues,BAT)是哺乳动物体内的产热组织,活化后的BAT可有效提高哺乳动物的能量代谢能力。BAT的产热主要通过解偶联蛋白-1(Uncoupling Protein 1,UCP-1)解偶联实现,该蛋白可将线粒体中的ATP能量解耦,产生热量,进而调节体温。研究表明,12小时内的初生羔羊通过BAT产生的热量是抵御环境冷刺激的关键,而BAT发育缺陷或产热能力低下是造成冬春季节初生羔羊高死亡率的主要原因。发育生物学研究表明,绵羊在胚胎发育后期即形成功能完整的BAT。阐明其发育机制,通过调控胚胎期BAT的发育、增强其产热功能对提高冬春季节羔羊成活率有重要意义。试验选取120天胎羊6只,分离出肾周棕色脂肪组织,并分离棕色脂肪前体细胞。研究了褪黑素(1 n M,10 n M)对棕色脂肪前体细胞体外增殖及分化的调控。试验采用Edu(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)染色观察褪黑素对绵羊棕色脂肪前体细胞DNA合成的影响,通过划痕试验检测其对绵羊棕色脂肪前体细胞迁移的影响,通过Western blotting检测了增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、周期蛋白依赖性激酶4(Cyclin-dependent kinases 4,CDK4)三个周期蛋白的表达。通过油红O染色检测褪黑素对绵羊棕色脂肪前体细胞脂滴沉积的影响,通过免疫荧光阐明不同浓度的褪黑素对UCPI蛋白表达的影响,通过q RT-PCR,Western blotting等检测褪黑素对分化过程中特异性基因和蛋白表达的影响。利用CRISPR/Cas9技术敲除AMPKα1基因,观察敲除AMPKα1后对分化的影响,以及褪黑素是否通过影响AMPKα1调控绵羊棕色脂肪前体细胞分化。全文结论如下:1、褪黑素抑制绵羊棕色脂肪前体细胞的体外增殖能力。1 n M及10 n M的褪黑激素可显著抑制绵羊棕色脂肪前体细胞的增殖能力,DNA的合成减缓。同时,PCNA(P1(P1),CDK4(P1、含有16位的PR结构域基因(PR domain containing 16,PRDM16)、过氧化物酶体增生物激活受体γ(Peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)等的表达增加(P1、PRDM16、PPARγ、细胞色素复合物(Cytochrome C)、细胞色素C氧化酶多肽7A(Cytochrome c oxidase polypeptide 7A,Cox7a)、细胞死亡激活剂(Cell death activator,Cidea)等产热基因上调(PAMPKα1)、乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-Co A Carboxylase,ACC)。棕色脂肪细胞中的p-AMPKα1、p-ACC蛋白表达显著升高(PAMPKα1调控前体细胞的分化能力。敲除绵羊棕色脂肪前体细胞的AMPKα1基因,检测到p-ACC,PRDM16,CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer-binding protein beta,C/EBPβ),细胞色素C氧化还原酶(Cytochrome c–oxidoreductase,Complex III),ATP合酶(ATP synthase,Complex V)蛋白表达降低(P1蛋白表达显著减少(PAMPKα1后,p-ampk,p-ACC,PRDM16,C/EBPβ,Complex III,Complex V蛋白含量显著增加(P1蛋白表达显著增加(PAMPKα1影响绵羊棕色脂肪前体细胞分化。敲除AMPKα1基因后,经过褪黑素处理,p-ampk,p-ACC,PRDM16,C/EBPβ,Complex III,Complex V蛋白表达不能恢复到正常水平(PAMPKα1基因,进而调控BAT特异性基因和产热基因的表达,调控产热。

关键词：褪黑素绵羊棕色脂肪前体细胞 AMPKα1 UCP1 能量调节增殖分化

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

AMPKα1介导阿魏酸抗脂多糖诱导的肾脏损伤作用机制研究

AMPKα1介导阿魏酸抗脂多糖诱导的肾脏损伤作用机制研究

引用

作者：牛丽南昌大学

学位级别：硕士

研究背景与目的:探究阿魏酸（FA）通过上调AMPKα1,对抗脂多糖（LPS）诱导的肾小管上皮细胞（NRK-52E）损伤,抑制NRK-52E细胞凋亡。在动物水平,进一步验证FA通过上调AMPKα1产生良好的肾脏保护作用。方法:体外研究以NRK-52E细胞为实验对... 详细信息

研究背景与目的:探究阿魏酸（FA）通过上调AMPKα1,对抗脂多糖（LPS）诱导的肾小管上皮细胞（NRK-52E）损伤,抑制NRK-52E细胞凋亡。在动物水平,进一步验证FA通过上调AMPKα1产生良好的肾脏保护作用。方法:体外研究以NRK-52E细胞为实验对象,建立LPS损伤模型。酶标法检测细胞存活率、乳酸脱氢酶（LDH）的活性。酶联免疫吸附法测定炎症因子的产生。酶标法检测相关抗氧化酶的活性,以及氧化副产物丙二醛（MDA）的含量。流式细胞术、酶标法检测线粒体功能。流式细胞仪检测细胞凋亡水平、胞内活性氧（ROS）的生成。TUNEL法检测细胞凋亡水平。免疫印迹法检测AMPKα1、Bax、Bcl2、Cytc、Cleaved-caspase-3等相关蛋白的表达。体内研究以8-10周的C57/BL6j雄鼠为实验对象,腹腔注射LPS构建急性肾损伤模型。采用超声心动技术对小鼠肾脏体积、血流情况超声。小鼠眼眶取血,取血清暂放-80摄氏度冰箱保存。免疫印迹法检测AMPKα1蛋白的表达。酶联免疫吸附法检测血清中炎症因子的分泌水平。酶标法检测血清中肌酐、尿素氮的含量。酶标法测定肾脏组织匀浆caspase-3的活性。结果:体外研究结果显示,与LPS组相比,75μM FA预处理显著上调AMPKα1的表达,细胞存活率增加,LDH活性降低。细胞培养上清中TNF-α、IL-1β等炎症因子分泌减少。细胞内ROS生成减少,抗氧化酶活性升高,MDA含量降低。线粒体功能稳定,凋亡相关蛋白表达含量减少。在加入75μM FA+5μM Compound C预处理NRK-52E细胞后,显著抑制了FA对NRK-52E细胞的保护作用。体内研究结果显示,与LPS组相比,50mg/kg FA预处理显著上调肾脏组织中AMPKα1的表达,血清中炎症因子TNF-α、IL-1β表达含量明显降低,血清中肌酐、尿素氮水平显著降低。肾脏组织匀浆caspase-3活性明显下降,肾脏超声相关指数均较稳定。5mg/kg Compound C减弱了50mg/kg FA对小鼠肾脏的保护作用。结论:阿魏酸（FA）通过上调AMPKα1,减少炎症因子的产生,抑制活性氧（ROS）触发的氧化应激,改善线粒体功能,对抗LPS诱导的肾小管上皮细胞凋亡以及肾脏组织的损伤。

关键词：阿魏酸 AMPKα1 肾脏脂多糖凋亡

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

原花青素预处理通过上调AMPKα1减轻阿霉素诱导的老年鼠心脏毒性

原花青素预处理通过上调AMPKα1减轻阿霉素诱导的老年鼠心脏毒性

引用

作者：樊启贵南昌大学

学位级别：硕士

目的:探究原花青素(PCs)通过上调AMPKα1和抑制细胞凋亡减轻阿霉素诱导的老年鼠心脏毒性。方法:体外研究以HL-1细胞为实验对象,D-半乳糖处理HL-1细胞48 h构建细胞衰老模型;Dox处理HL-1细胞24 h构建细胞损伤模型。β-半乳糖苷酶染色(SA-... 详细信息

目的:探究原花青素(PCs)通过上调AMPKα1和抑制细胞凋亡减轻阿霉素诱导的老年鼠心脏毒性。方法:体外研究以HL-1细胞为实验对象,D-半乳糖处理HL-1细胞48 h构建细胞衰老模型;Dox处理HL-1细胞24 h构建细胞损伤模型。β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)检测β-半乳糖苷酶活性和Western blot法检测衰老标志物p21和p53的表达以评价HL-1细胞衰老程度。酶标法测定细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)、抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性和及脂质氧化产物(MDA)的含量。流式细胞仪检测细胞凋亡水平、细胞内活性氧(ROS)以及线粒体ROS的生成、线粒体功能。TUNEL法检测细胞凋亡水平。Western blot法检测p-ampkα、AMPKα1、Bax、Bcl-2、Cyt c、Cleaved Caspase-3等相关蛋白的表达。体内研究以C57/BL6小鼠为实验对象,包括2-3月龄的年轻鼠和18-20月龄的老年鼠。选取18-20月龄的老年鼠,尾静脉注射p AD/Flag-AMPKα1腺病毒建立AMPKα1高表达老年鼠动物模型,感染两周后腹腔注射Dox构建损伤模型。采用超声心动技术和组织病理学分析检测小鼠心功能指标。Western blot法检测AMPKα1、Bax、Bcl-2蛋白的表达。酶标法检测血清中CK、LDH含量。结果:体外研究结果表明,PCs预处理D-gal诱导的模拟衰老HL-1细胞可显著上调AMPKα1的表达,调节氧化应激反应,稳定线粒体功能,调节凋亡相关蛋白表达,降低LDH活性,增加细胞存活率。在加入5μM ampk抑制剂Compound C预处理HL-1细胞后,PCs对拟衰老的HL-1细胞的保护作用被抑制。体内研究结果表明,PCs预处理可显著上调老年鼠心脏组织中AMPKα1的表达,调节氧化应激反应,降低血清中CK和LDH的含量,调节细胞凋亡相关蛋白表达,抑制细胞凋亡,从而改善心功能,减轻Dox诱导老年鼠心脏损伤。在经过p AD/Flag-AMPKα1腺病毒处理后,表现出与PCs相似的心脏保护作用。结论:经Dox处理后,老年鼠的心脏毒性更为严重,而PCs预处理可以通过上调AMPKα1,减少氧化应激并在应激条件保护线粒体功能以拮抗Dox损伤所致的心肌细胞凋亡,减轻Dox诱导的老年鼠心脏毒性。

关键词：老年鼠阿霉素原花青素 AMPKα1 凋亡

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

尾静脉注射AMPKα1高表达腺病毒对抑郁症模型大鼠线粒体损伤和代谢的调节作用

引用

中国免疫学杂志 2021年第2期37卷 129-133页

作者：闫海清张平(指导) 王桂华王昊亮郭振方宋景贵新乡医学院第一附属医院卫辉453100 新乡医学院第二附属医院新乡453002

目的:探究尾静脉注射腺苷酸活化蛋白激酶α1(AMPKα1)高表达腺病毒对抑郁症模型大鼠线粒体损伤和代谢的调节作用。方法:采用不可预见温和应激法建立大鼠抑郁症模型,尾静脉注射AMPKα1高表达腺病毒。Morris水迷宫实验评价大鼠记忆力,旷... 详细信息

目的:探究尾静脉注射腺苷酸活化蛋白激酶α1(AMPKα1)高表达腺病毒对抑郁症模型大鼠线粒体损伤和代谢的调节作用。方法:采用不可预见温和应激法建立大鼠抑郁症模型,尾静脉注射AMPKα1高表达腺病毒。Morris水迷宫实验评价大鼠记忆力,旷场实验评价大鼠自主探究行为,HE染色观察大鼠海马和前额叶皮质区病理改变情况,Western blot检测AMPKα1、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、PGC-1α和GLUT4蛋白表达,试剂盒检测SOD、MDA和LDH含量,RT-PCR检测AMPKα1、PGC-1α和GLUT4 mRNA表达。结果:与CUMS+Ad-NC组相比,CUMS+Ad-AMPKα1组大鼠AMPKα1 mRNA和蛋白表达显著上调,逃避潜伏期时间显著缩短,目标象限记忆时间显著延长,水平活动次数和垂直站立次数显著增加,脑损伤显著减轻,Bcl-2蛋白表达显著上调,Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著下调,SOD含量显著增多,LDH和MDA含量显著减少,PGC-1α和GLUT4表达显著上调。结论:尾静脉注射AMPKα1高表达腺病毒可改善抑郁症模型大鼠学习记忆能力、自主探究行为和糖代谢,缓解脑损伤、线粒体损伤和氧化应激,从而缓解抑郁症。

关键词： AMPKα1 抑郁症线粒体损伤代谢

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

miRNA-148b靶向AMPKα1通过氧化应激介导高糖诱导的人肾小管上皮细胞凋亡

引用

中华肾脏病杂志 2019年第1期35卷 43-47页

作者：杨莹范秋灵李露露汪旭文思徐莉中国医科大学附属第一医院肾内科沈阳110001 中国医科大学附属第一医院消化内科沈阳110001 中国医科大学附属第一医院检验科沈阳110001

目的探讨微小RNA-148b(miRNA-148b)在高糖诱导肾小管损伤中表达变化及其作用机制。方法体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2细胞),分为正常糖组、甘露醇高渗对照组、高糖组,培养48 h后,实时定量PCR法检测miRNA-148b表达;采用2′,7′-二氯二... 详细信息

目的探讨微小RNA-148b(miRNA-148b)在高糖诱导肾小管损伤中表达变化及其作用机制。方法体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2细胞),分为正常糖组、甘露醇高渗对照组、高糖组,培养48 h后,实时定量PCR法检测miRNA-148b表达;采用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)在荧光显微镜下检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western印迹检测HK-2细胞腺苷单磷酸活化蛋白激酶α1(AMPKα1)、NOX2、NOX4、Bcl-2、cleaved-caspase3的蛋白表达。结果培养48 h后,与正常糖组相比,高糖组、高渗组HK-2细胞内miRNA-148b表达上调(P1),ROS产生增多(P1),NOX2、NOX4蛋白表达增多(均P1),AMPKα1蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达减少(均P1),线粒体凋亡通路相关蛋白cleaved-caspase3蛋白表达增加(P1),差异均有统计学意义。结论高糖上调体外培养HK-2细胞miRNA-148b的表达,靶向抑制AMPKα1的表达,促进NOX2、NOX4表达,活性氧产生增多,活化线粒体凋亡途径,激活caspase酶,诱导HK-2细胞凋亡。高糖的肾小管毒性部分是渗透压的影响。miRNA-148b可能参与了糖尿病肾病病理损伤的发生,有望成为糖尿病肾病新的治疗靶点。

关键词：糖尿病肾病氧化应激肾小管上皮细胞 miRNA-148b AMPKα1

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

PRKAA1/AMPKα1在消化系肿瘤中的研究进展

引用

中国肿瘤外科杂志 2022年第6期14卷 615-620页

作者：雍桃刘杰魏秋亚樊勇兰州大学第二医院普通外科四病区甘肃兰州730030

AMP依赖的蛋白激酶(ampk)是一种细胞能量状态的感受器,其调控异常与肿瘤的发生发展密切相关。PRKAA1是ampk的催化亚基-α亚基,其磷酸化在ampk活化过程中起重要作用。恶性肿瘤的发生发展离不开细胞能量,ampk随着细胞内特定的能量条件变化... 详细信息

AMP依赖的蛋白激酶(ampk)是一种细胞能量状态的感受器,其调控异常与肿瘤的发生发展密切相关。PRKAA1是ampk的催化亚基-α亚基,其磷酸化在ampk活化过程中起重要作用。恶性肿瘤的发生发展离不开细胞能量,ampk随着细胞内特定的能量条件变化,发挥着抑肿瘤或促肿瘤的双重作用。该文将重点讨论PRKAA1基因在肿瘤进展中的功能及其在消化道肿瘤作用机制中的研究进展,探究其在不同消化系统恶性肿瘤调控网络中的地位和作用,为消化系统肿瘤的诊断和治疗提供新的思路。

关键词： PRKAA1 AMPKα1 消化系肿瘤治疗预后

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

AMPKα1调控卵巢癌细胞DNA双链断裂修复的功能及机制研究

AMPKα1调控卵巢癌细胞DNA双链断裂修复的功能及机制研究

引用

作者：杨伟娜华中科技大学

学位级别：硕士

第一部分ampkα是否参与细胞内DNA双链断裂修复过程[目的]研究ampkα是否参与卵巢癌细胞DNA双链断裂修复。[方法]本部分实验分为以下5部分:1.X射线处理人卵巢癌细胞SK-OV-3和HO-8910以及人乳腺癌细胞诱导DNA双链断裂后,分离细胞染色质组... 详细信息

第一部分ampkα是否参与细胞内DNA双链断裂修复过程[目的]研究ampkα是否参与卵巢癌细胞DNA双链断裂修复。[方法]本部分实验分为以下5部分:1.X射线处理人卵巢癌细胞SK-OV-3和HO-8910以及人乳腺癌细胞诱导DNA双链断裂后,分离细胞染色质组分,利用蛋白免疫印迹方法检测诱导前后ampkα在染色质组分中的水平;2.构建GFP-AMPKα1,GFP-ampkα2及包含GFP-AMPKα1不同结构域质粒,并将其转染至人骨肉瘤细胞U2OS内。激光处理癌细胞后,观察GFP融合蛋白是否能被招募至激光诱导的DNA损伤位点处;3.将GFP-AMPKα1转染至人骨肉瘤细胞U2OS中,后分别使用ATM抑制剂KU-55933和PARP抑制剂ABT-888分别处理细胞,激光处理定点诱导DNA双链损伤,荧光显微镜下观察AMPKα1的招募情况;4.构建GFP-AMPKα1,Flag-SBP-AMPKα1,Flag-PARP1和HA-PARP1 4种质粒,分组转染至人胚胎肾细胞HEK293T细胞内,分别使用X射线和H2O2处理细胞造成DNA双链断裂后收集蛋白样品,免疫共沉淀实验检测DNA损伤后AMPKα1和PARP1之间的相互作用;5.使用不同浓度的博来霉素(BLM 0μM,2μM,4μM,6μM,8μM,10μM)处理人卵巢癌细胞SK-OV-3 2h诱导DNA损伤,48h后利用CCK8试剂盒检测SK-OV-3细胞存活率。取药物半致死浓度处理人卵巢癌细胞SK-OV-3 2h后换正常培养基让细胞修复,并在不同时间点收集蛋白样品,利用蛋白免疫印迹方法检测不同时间点ampkα蛋白和磷酸化水平。[结果]1.X射线处理不同癌细胞系后,蛋白印迹检测到ampkα在DNA双链断裂产生后在染色质组分中的水平增加;2.激光造成卵巢癌细胞DNA双链断裂后,观察到AMPKα1和ampkα2蛋白均能被招募至DNA损伤处,且AMPKα1的催化结构域主要介导了AMPKα1蛋白的募集;3.PARP抑制剂ABT-888处理引起AMPKα1蛋白在DNA断裂位点的招募受损,而ATM抑制剂KU-55933不影响这一过程;4.免疫共沉淀实验结果显示,DNA损伤可增加PARP1和AMPKα1之间的相互作用;5.根据CCK8细胞存活实验结果确定SK-OV-3细胞中BLM的半致死浓度为3.3μM。使用BLM4μM处理卵巢癌细胞2h后,免疫印迹检测到ampkα磷酸化水平显著升高。[结论]ampkα的两个亚型AMPKα1和ampkα2均能定位到DNA双链断裂位点处。PARP1处在AMPKα1上游,调控其被招募至DNA损伤位点,且AMPKα1 N端的催化结构域对此招募过程至关重要。ampkα的磷酸化形式可能参与调控DNA损伤应答修复。第二部分PRKAA1基因敲除对卵巢癌细胞DNA双链断裂修复功能的影响[目的]构建PRKAA1敲除细胞系,探索PRKAA1基因敲除对卵巢癌细胞DNA双链断裂修复的影响。[方法]本部分实验分为以下3部分:1.利用CRISPR-Cas9技术在在人卵巢癌细胞SK-OV-3和人宫颈癌细胞He La中分别敲除AMPKα1蛋白编码基因PRKAA1;2.BLM 4μM同时处理对照组和敲除组2h后更换培养基让细胞修复,在不同时间点收集蛋白样品,蛋白免疫印迹检测ATM和H2AX磷酸化水平,免疫荧光观察比较两组H2AX磷酸化水平差异;3.在敲除细胞内回转GFP-AMPKα1,BLM 4μM同时处理对照组,敲除组和敲除后恢复AMPKα1表达组2h后更换培养基让细胞修复,并在不同时间点收集蛋白样品,蛋白免疫印迹检测AMPKα1回转是否能挽救相关表型。[结果]1.利用蛋白免疫印迹方法明确敲除效果,在人卵巢癌细胞SK-OV-3和人宫颈癌细胞He La内分别成功敲除PRKAA1;2.蛋白免疫印迹结果显示,与对照组相比,敲除组ATM和H2AX磷酸化水平显著降低,说明ATM激酶激活过程受阻,DNA双链断裂修复能力降低。进一步,免疫荧光结果显示,DNA双链断裂后,敲除组H2AX磷酸化水平较野生组显著降低;3.与敲除细胞组相比,回转GFP-PRKAA1使癌细胞ATM磷酸化水平上升,DNA双链断裂修复能力提高。[结论]敲除PRKAA1致卵巢癌细胞DNA双链断裂修复能力受损,激酶ATM活化过程受阻,而恢复AMPKα1蛋白表达能挽救这一现象。第三部分AMPKα1参与DNA损伤修复的分子机制[目的]研究AMPKα1影响ATM激活的分子机制。[方法]本部分实验分为以下2部分:1.将GFP-N1,GFP-AMPKα1和GFP-AMPKα1分别转染至3皿HEK293T内,第三组使用10μM BLM处理3h造成细胞DNA双链断裂,第一组和第二组均使用等量DMSO处理3h作为对照,收集蛋白样品进行免疫共沉淀实验,后跑SDS-PAGE凝胶银染并利用质谱技术鉴定AMPKα1的相互作用蛋白;2.将Flag-AMPKα1和

关键词： AMPKα1 ampkα2 DNA损伤 PARP1 人卵巢癌细胞 CRISPR-Cas9 ATM H2AX DNA双链断裂修复 Artemis RAD50

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

AMPKα1介导阿魏酸抗NRK-52E细胞缺氧/复氧损伤作用机制研究

AMPKα1介导阿魏酸抗NRK-52E细胞缺氧/复氧损伤作用机制研究

引用

作者：陈天鹏南昌大学

学位级别：硕士

研究背景与目的:缺氧/复氧（A/R）损伤引起肾小管上皮细胞（NRK-52E）功能障碍,可能与产生过量的活性氧（ROS）物质有关,并且最终导致细胞凋亡。阿魏酸（FA）是一种酚酸类化合物,在果蔬中含量非常丰富,其具有强大的清除自由基和激活细... 详细信息

研究背景与目的:缺氧/复氧（A/R）损伤引起肾小管上皮细胞（NRK-52E）功能障碍,可能与产生过量的活性氧（ROS）物质有关,并且最终导致细胞凋亡。阿魏酸（FA）是一种酚酸类化合物,在果蔬中含量非常丰富,其具有强大的清除自由基和激活细胞保护系统的功能从而增强细胞抵抗应激反应。但是,FA是否可以保护NRK-52E细胞抵抗A/R损伤及其保护机制尚不清楚。在这项研究中,我们探讨FA预处理NRK-52E细胞是否有抵抗A/R损伤作用;将ampk抑制剂（Compound C）和FA联合预处理NRK-52E细胞,进一步探究FA预处理抵抗A/R损伤机制是否与上调AMPKα1介导细胞抗凋亡通路有关。方法:本实验以NRK-52E细胞为研究对象,建立急性A/R损伤模型。将NRK-52E细胞随机分为4组,每组重复3次:（1）正常对照组（Control）;（2）A/R组;（3）75μM FA+A/R组;（4）75μM FA+5μM Compound C+A/R组。通过CCK-8法检测细胞存活率,分光光度法检测乳酸脱氢酶（LDH）活性确定FA最佳保护浓度;随后通过分光光度法检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量以及线粒体通透性转换孔（m PTP）开放程度和AMP/ATP比值;通过荧光标记流式细胞法检测细胞内ROS水平、线粒体膜电位（MMP）和细胞凋亡水平;Western blotting法检测AMPKα1、p-ampk、Bcl2、Bax、Cleaved-caspase3及线粒体/胞浆中Cytchrome c的表达;TUNEL法检测细胞凋亡。结果:与A/R组相比,细胞存活率和LDH结果显示75μM FA预处理NRK-52E细胞保护效果最佳;与A/R组相比,75μM FA预处理NRK-52E细胞上调AMPKα1,p-ampk的表达,降低AMP/ATP的比值;75μM FA预处理明显抑制细胞内ROS产生,稳定MMP,从而抑制m PTP的开放,阻止Cyt c从线粒体释放到细胞质中,降低Cleaved-caspase3的水平,并最终降低A/R诱导的NRK-52E细胞凋亡。然而,在加入了75μM FA+5μM Compound C预处理NRK-52E的细胞,由于Compound C抑制AMPKα1的表达和激活,从而显著抑制了FA对NRK-52E细胞的保护作用。结论:FA预处理可以通过上调AMPKα1保护NRK-52E细胞抵抗缺氧/复氧损伤,并且可能成为治疗肾脏缺血再灌注损伤的潜在药物。

关键词：阿魏酸缺氧/复氧损伤 AMPKα1 细胞凋亡

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

Irisin通过AMPKα1调控小鼠脂肪细胞棕色化

Irisin通过AMPKα1调控小鼠脂肪细胞棕色化

引用

作者：李经纬山西农业大学

学位级别：硕士

【目的】哺乳动物体内摄入过多的热量会以白色脂肪的形式存储起来。过多的能量摄入是引起肥胖最主要的原因,肥胖是目前国际上最多发的代谢性疾病之一,由肥胖引起的II型糖尿病、心血管疾病等的发病率也逐年升高,因此肥胖是威胁人类健康... 详细信息

【目的】哺乳动物体内摄入过多的热量会以白色脂肪的形式存储起来。过多的能量摄入是引起肥胖最主要的原因,肥胖是目前国际上最多发的代谢性疾病之一,由肥胖引起的II型糖尿病、心血管疾病等的发病率也逐年升高,因此肥胖是威胁人类健康的一大隐患,如何健康有效的限制体内过多的白色脂肪从而治疗肥胖是当下研究的热点。另外在养猪业中过多的白色脂肪组织也严重影响着猪肉品质和经济效益。有研究证明动物体内的白色脂肪在一些特定的条件下(运动,寒冷等)有向棕色脂肪转化的良性趋势。鸢尾素(Irisin)是由骨骼肌分泌的一种小分子蛋白,对脂肪细胞的棕色化有着极其重要的作用,但其促进棕色化的信号通路还有待进一步的研究。本研究旨在探讨Irisin促进白色脂肪棕色化的信号通路。【方法】通过体外培养3T3-L1细胞以及小鼠原代脂肪细胞,采用鸡尾酒法使其分化成熟,之后转染AMPKα1-siRNA并添加20nmol/L Irisin蛋白处理,使用油红O染色鉴定脂肪细胞,采用RT-PCR、Western Blotting检测棕色脂肪标记基因解偶联蛋白-1(UCP1),过氧化物酶-γ共激活因子1α(PGC-1α),同时使用光密度分析对脂肪细胞中的脂滴进行分析。【结果】(1)qRT-PCR结果显示转染AMPKα1-siRNA后脂肪细胞AMPKα1mRNA相对表达量明显低于对照组;qRT-PCR结果显示两种脂肪细胞模型中转染组中PGC-1α和UCP1mRNA相对表达量明显低于对照组;Western Blotting结果显示两种脂肪细胞模型中转染组中PGC-1α和UCP1蛋白相对表达量明显低于对照组。(2)油红O染色结果显示两种脂肪细胞模型中脂滴均被染色;光密度分析结果显示转染AMPKα1-siRNA后脂肪细胞中添加组与非添加组OD值无明显差异。qRT-PCR结果显示显示两种脂肪细胞模型添加Irisin之后转染组PGC-1α和UCP1mRNA相对表达量明显低于非转染组;Western Blotting结果显示两种脂肪细胞模型添加Irisin之后转染组PGC-1α和UCP1蛋白相对表达量明显低于非转染组。【结论】AMPKα1蛋白在Irisin促进白色脂肪细胞棕色化中起了重要作用,为深一步研究Irisin促进白色脂肪棕色化的信号通路提供了依据。

关键词： Irisin AMPKα1 棕色化脂肪细胞

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

欢迎您,

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

欢迎您,

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：