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过表达AT2R对LPS诱导的aml12细胞炎症反应的影响

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安徽医科大学学报 2023年第10期58卷 1712-1718页

作者：许昌勇张世浩魏伟安徽医科大学临床药理研究所抗炎免疫药物教育部重点实验室抗炎免疫药物安徽省协同创新中心合肥230032

目的探究过表达血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠肝细胞(aml12细胞)炎症反应的影响。方法以乳鼠组织器官为样本,通过PCR扩增出含有EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点的AT2R目的基因片段,通过酶切、连接得到最终产物,挑选出的... 详细信息

目的探究过表达血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠肝细胞(aml12细胞)炎症反应的影响。方法以乳鼠组织器官为样本,通过PCR扩增出含有EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点的AT2R目的基因片段,通过酶切、连接得到最终产物,挑选出的阳性克隆经测序鉴定;将pCMV-Flag-N-AT2R质粒转染至HEK 293T细胞,24 h后采用Western blot法检测Flag蛋白的表达;通过Western blot和激光共聚焦显微镜观察aml12细胞上的AT2R表达;对aml12细胞进行不同的处理,分为对照组、LPS处理组、pCMV-Flag-N-AT2R组和pCMV-Flag-N-AT2R+LPS组,通过CCK-8检测细胞活力;Western blot检测PCNA蛋白,观察细胞增殖;qPCR检测细胞炎性因子水平;Western blot检测细胞核中转录因子NF-кB(p65)表达水平。结果EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定以及测序结果表明pCMV-Flag-N-AT2R质粒构建成功,Western blot法的检测结果表明AT2R蛋白成功表达;激光共聚焦观察到aml12细胞上有AT2R受体,AT2R重组质粒可以在aml12上表达;与对照组比较,LPS处理的aml12细胞中细胞的活力和增殖能力减弱,而白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平升高,核转录因子NF-кB(p65)表达水平升高;与LPS组比较,pCMV-Flag-N-AT2R和LPS联合处理的aml12细胞中细胞的活力和增殖能力增强,而IL-6和TNF-α水平降低,核转录因子NF-кB(p65)表达水平降低。结论成功构建了AT2R过表达质粒,并在aml12细胞上成功表达,且AT2R可以抑制LPS诱导的aml12细胞的炎症反应。

关键词：血管紧张素Ⅱ2型受体白细胞介素-6 肿瘤坏死因子-α 脂多糖 aml12 质粒构建

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姜半夏配方颗粒与饮片煎剂对小鼠aml12肝细胞毒性的比较研究

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浙江中医杂志 2020年第11期55卷 834-835页

作者：韩月丹毛培江业康金捷黄晶晶栾会玲金祖汉王志安杭州市第一人民医院浙江杭州310006 浙江省中药研究所有限公司浙江杭州310023

目的:比较相同生药量浓度下姜半夏配方颗粒与饮片煎剂对小鼠aml12肝细胞毒性的差异。方法:以不同浓度姜半夏配方颗粒与同批次原料饮片煎剂作用于小鼠aml12肝细胞,MTT法检测细胞活性;Hoechest33258荧光染色法检测细胞核形态并半定量统计... 详细信息

目的:比较相同生药量浓度下姜半夏配方颗粒与饮片煎剂对小鼠aml12肝细胞毒性的差异。方法:以不同浓度姜半夏配方颗粒与同批次原料饮片煎剂作用于小鼠aml12肝细胞,MTT法检测细胞活性;Hoechest33258荧光染色法检测细胞核形态并半定量统计分析,比较两者毒性差异。结果:小鼠aml12肝细胞在姜半夏饮片煎剂的干预下,较配方颗粒组有显著性差异;Hoechst33258荧光染色下可见细胞核固缩碎裂等,相同浓度下饮片煎剂组荧光强度强于配方颗粒组(Paml12肝细胞有一定的毒性,且在相同浓度下,姜半夏配方颗粒对细胞的毒性较其饮片煎剂小。

关键词：姜半夏配方颗粒饮片煎剂毒性 aml12 肝细胞小鼠

桂籽提取物对LPS诱导的aml12细胞的保护作用及机制研究

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湖北科技学院学报（医学版） 2023年第5期37卷 369-373页

作者：黄婷要辉张雨晨吴宇培王琢文王洁琼杨洪飞葛婷婷闵清湖北科技学院医学部药学院湖北咸宁437100 鄂南特色中药湖北省工程研究中心

目的研究桂籽提取物(OFSN)正丁醇部位对脂多糖(LPS)诱导的小鼠正常肝细胞(aml12)的保护作用及其机制。方法体外培养aml12,CCK-8法测定不同浓度与时间下OFSN对aml12活性的影响,不同浓度的OFSN及Aspirin干预后对LPS诱导aml12活性的影响,... 详细信息

目的研究桂籽提取物(OFSN)正丁醇部位对脂多糖(LPS)诱导的小鼠正常肝细胞(aml12)的保护作用及其机制。方法体外培养aml12,CCK-8法测定不同浓度与时间下OFSN对aml12活性的影响,不同浓度的OFSN及Aspirin干预后对LPS诱导aml12活性的影响,筛选出合适的OFSN给药浓度及时间。将细胞分为Control组、LPS组(1μg/mL)、Asipirin组(900μg/mL)、OFSN低、中、高剂量组(100、200、400μg/mL)。利用荧光探针试剂盒检测活性氧(ROS)生成,Western blot法检测各组细胞TLR4/NF-κB p65信号通路蛋白的表达。结果与Control组相比,经LPS诱导后的细胞存活率下降,TLR4/NF-κB p65通路蛋白表达增加,细胞内ROS生成增加。与LPS组相比,经过OFSN及Aspirin干预后细胞活力升高(Paml12损伤具有一定的保护作用,其作用机制可能与下调TLR4/NF-κB p65信号通路蛋白表达,减少ROS的生成,同时减少COX-2的表达,从而减少炎症小体NLRP3及炎症因子IL-6的释放相关。

关键词：桂籽提取物脂多糖 aml12 ROS TLR4/NF-κB p65

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Murine hepatocellular carcinoma derived stem cells reveal epithelial-to-mesenchymal plasticity

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World Journal of Stem Cells 2017年第9期9卷 159-168页

作者： Aparna Jayachandran Ritu Shrestha Bijay Dhungel I-Tao Huang Marianna Yumi Kawashima Vasconcelos Brian J Morrison Charmaine A Ramlogan-Steel Jason C Steel the University of Queensland School of Medicine and the Gallipoli Medical Research Institute Greenslopes Private Hospital Viral and Rickettsial Diseases Department Infectious Diseases DirectorateNaval Medical Research Center

AIM To establish a model to enrich and characterize stemlike cells from murine normal liver and hepatocellular carcinoma(HCC) cell lines and to further investigate stem-like cell association with epithelial-to-mesenchymal transition(EMT).METHODS In this study,we utilized a stem cell conditioned serumfree medium to enrich stem-like cells from mouse HCC and normal liver cell lines,Hepa 1-6 and aml12,*** isolated the 3-dimensional spheres and assessed their stemness characteristics by evaluating theRNA levels of stemness genes and a cell surface stem cell marker by quantitative reverse transcriptase-PCR(q RTPCR).Next,we examined the relationship between stem cells and EMT using q *** Three-dimensional spheres were enriched by culturing murine HCC and normal hepatocyte cell lines in stem cell conditioned serum-free medium supplemented with epidermal growth factor,basic fibroblast growth factor and heparin *** 3-dimensional spheres had enhanced stemness markers such as Klf4 and Bmi1 and hepatic cancer stem cell(CSC) marker Cd44 compared to parental cells grown as adherent *** report that epithelial markers E-cadherin and ZO-1 were downregulated,while mesenchymal markers Vimentin and Fibronectin were upregulated in 3-dimensional *** 3-dimensional spheres also exhibited changes in expression of Snai,Zeb and Twist family of EMT transcription *** Our novel method successfully enriched stem-like cells which possessed an EMT *** isolation and characterization of murine hepatic CSCs could establish a precise target for the development of more effective therapies for HCC.

关键词： Hepatocellular carcinoma Hepa 1-6 Cancer stem cells Cancer initiating cells Epithelial-to-mesenchymal transition Cellular plasticity Epithelial-to-mesenchymal transition transcription factors aml12

靶向沉默CaMKK-AMPK通路对NEFAs介导肝脂损伤的调控机制

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中国兽医学报 2021年第2期41卷 322-326页

作者：王爽任大禹张睿锴杨威张冰冰董志昊赵莹莹麻芯茹徐闯黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院黑龙江大庆163319

为探究Ca^(2+)/钙调素依赖性蛋白激酶(CaMKK)-AMP依赖蛋白激酶(AMPK)对非酯化脂肪酸(NEFAs)介导的aml12细胞肝脂损伤的调控机制,本试验通过添加高浓度的NEFAs刺激aml12细胞,RNA靶向沉默CaMKK,检测不同分组细胞内AMPK及固醇调节原件结合... 详细信息

为探究Ca^(2+)/钙调素依赖性蛋白激酶(CaMKK)-AMP依赖蛋白激酶(AMPK)对非酯化脂肪酸(NEFAs)介导的aml12细胞肝脂损伤的调控机制,本试验通过添加高浓度的NEFAs刺激aml12细胞,RNA靶向沉默CaMKK,检测不同分组细胞内AMPK及固醇调节原件结合蛋白(SREBP1)的蛋白表达水平以及利用流式细胞术检测活性氧(ROS)的产生水平,同时利用激光共聚焦检测细胞内脂滴变化情况。结果显示,siCaMKK+NEFAs组AMPK蛋白表达水平较空白对照组及NEFAs组均显著降低,而SREBP1蛋白表达水平、ROS水平及脂滴数量均显著高于其他各组。结果表明,CaMKK通过AMPK信号通路调控SREBP1及线粒体脂质氧化可调节NEFAs诱导的肝脂损伤过程。

关键词： aml12 非酯化脂肪酸(NEFAs) CaMKK ROS 脂质沉积

IL-1Ra保护ConA诱导肝细胞凋亡的分子机制研究

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IL-1Ra保护ConA诱导肝细胞凋亡的分子机制研究

作者：杨卓一上海交通大学

学位级别：硕士

背景和目的肝损伤是指肝脏受到毒性药物、病毒、自身免疫性缺陷等引起的肝细胞炎症或死亡的现象,其中肝细胞死亡的主要形式是细胞凋亡和细胞坏死。伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A,ConA）是一种多克隆有丝分裂原,可以直接诱导肝细胞凋亡... 详细信息

背景和目的肝损伤是指肝脏受到毒性药物、病毒、自身免疫性缺陷等引起的肝细胞炎症或死亡的现象,其中肝细胞死亡的主要形式是细胞凋亡和细胞坏死。伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A,ConA）是一种多克隆有丝分裂原,可以直接诱导肝细胞凋亡。动物模型中已经证实白介素1受体拮抗剂（Interleukin-1 receptor antagonist,IL-1Ra）可以保护ConA诱导的肝损伤。磷酸化是研究最广泛,最受关注的翻译后修饰之一,它可以协调多种细胞功能,例如细胞生长、分化和凋亡,在肝细胞增殖、再生等方面也发挥着重要作用。纤维蛋白原样蛋白1（Fibrinogen like 1,FGL1）是纤维蛋白原家族中的一员,由肝细胞分泌。研究表明,FGL1通过促进受损的肝组织再生并下调促凋亡因子的表达参与肝细胞损伤的修复。本研究利用ConA诱导小鼠肝细胞aml12（Alpha mouse liver 12,aml12）细胞损伤建立磷酸化蛋白质组学模型,同时研究rhIL-1Ra对ConA诱导的肝细胞凋亡的保护作用及机制。方法采用磷酸化组学的方法,在ConA诱导aml12细胞损伤的情况下,定位定量相关磷酸化修饰蛋白的变化,并确定磷酸化修饰位点信息。构建ConA诱导的aml12细胞和HepG2细胞损伤模型;在不同浓度的ConA作用下,通过观察两种细胞的形态变化,检测细胞存活率及肝细胞的凋亡情况,考察rhIL-1Ra对ConA诱导的肝细胞凋亡的保护作用。采用双荧光酶报告基因法、实时荧光-聚合酶链反应（Real Time Polymerase Chain Reaction,RT PCR）法和western blot分别从转录水平、信使RNA（messenger RNA,mRNA）水平和蛋白水平检测rhIL-1Ra对aml12细胞内FGL1表达的影响;构建FGL1过表达质粒,瞬时转染进aml12细胞并在ConA诱导的损伤条件下检测FGL1过表达对肝细胞损伤的影响。结果本研究成功构建了ConA诱导aml12细胞损伤的磷酸化蛋白质组学模型,定量检测到82条磷酸化修饰肽段和77个磷酸化修饰蛋白。对它们进行了生物进程、分子功能、细胞成分的基因本体（Gene ontology,GO）分析以及蛋白互作关系网络构建,并得到了特定的磷酸化修饰位点信息。在ConA对aml12细胞和HepG2细胞的损伤模型中可以看出,ConA对这两个细胞都具有浓度依赖性的杀伤抑制作用。rhIL-1Ra能明显降低ConA诱导的肝损伤细胞的凋亡率,提高肝细胞的存活率,有效保护肝细胞损伤。RT PCR结果显示rhIL-1Ra可以提高FGL1 mRNA的水平;双荧光素酶报告基因结果表明rhIL-1Ra提高了aml12细胞中FGL1基因的转录水平。Western blot结果发现模型细胞中的FGL1表达量随着拮抗剂的浓度升高而升高。过表达的FGL1质粒也在损伤模型中对肝细胞起到了保护作用。研究结果表明rhIL-1Ra和FGL1均能保护ConA诱导的肝细胞损伤,并且rhIL-1Ra可以提高肝细胞中FGL1的水平。

关键词：肝细胞损伤模型磷酸化修饰 ConA FGL1 rhIL-1Ra aml12

雷帕霉素对细胞缝隙连接功能和连接蛋白表达的影响

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药学研究 2024年第2期43卷 111-114,158页

作者：魏尔婷赵青钟意汤南广东医科大学药学院广东东莞523808

目的观察雷帕霉素对人脐静脉内皮细胞HUVEC、大鼠肝细胞BRL-3A和小鼠肝细胞aml12细胞缝隙连接(GJ)功能及连接蛋白表达的影响。方法采用CCK-8测定不同浓度雷帕霉素分别作用HUVEC、BRL-3A和aml12后的细胞存活率,筛选雷帕霉素不影响3种... 详细信息

目的观察雷帕霉素对人脐静脉内皮细胞HUVEC、大鼠肝细胞BRL-3A和小鼠肝细胞aml12细胞缝隙连接(GJ)功能及连接蛋白表达的影响。方法采用CCK-8测定不同浓度雷帕霉素分别作用HUVEC、BRL-3A和aml12后的细胞存活率,筛选雷帕霉素不影响3种细胞生长的作用浓度;采用细胞接种荧光示踪法和Western blotting检测不同浓度雷帕霉素对HUVEC、BRL-3A、aml12的GJ功能及连接蛋白37(Cx37)和连接蛋白32(Cx32)的影响。结果 5、10、25、50 nmol·L^(-1)的雷帕霉素分别作用HUVEC、BRL-3A、aml12细胞2 h,对细胞生长无显著性影响。采用以上浓度的雷帕霉素分别处理细胞后,与对照组相比,可降低calcein在GJ间的荧光传递(Paml12细胞中的Cx32蛋白表达显著性下降(Paml12细胞后,对不同细胞GJ功能具有一定的抑制作用,并且可下调Cx37和Cx32的蛋白表达。

关键词：雷帕霉素细胞缝隙连接连接蛋白 HUVEC BRL-3A aml12

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