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鸡内源性反转录病毒通过Marco介导巨噬细胞抗ALV-J病毒天然免疫

鸡内源性反转录病毒通过Marco介导巨噬细胞抗ALV-J病毒天然免疫

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作者：陈绪靖扬州大学

学位级别：硕士

已有研究证实内源性反转录病毒不但参与早期胚胎发育和胚胎干细胞干性的调控[1],而且与抗病毒和抗肿瘤天然免疫作用相关[2,3]。为日后将其作为筛选禽白血病抗性鸡的标准奠定基础,本课题组前期已鉴定出鸡内源性反转录病毒alve1的全基因... 详细信息

已有研究证实内源性反转录病毒不但参与早期胚胎发育和胚胎干细胞干性的调控[1],而且与抗病毒和抗肿瘤天然免疫作用相关[2,3]。为日后将其作为筛选禽白血病抗性鸡的标准奠定基础,本课题组前期已鉴定出鸡内源性反转录病毒alve1的全基因组序列,并应用CRISPR/Cas9系统在alve1的启动子LTR区插入了一段SV40 polyA终止序列以终止鸡巨噬细胞HD11中的alve1表达[4],但是alve1与抗ALV-J病毒天然免疫之间的关系并未深入研究。本研究首先对终止表达鸡内源性反转录病毒alve1的HD11细胞采用RNA-seq和生物信息学分析方法筛选出差异表达的mRNA及相关信号通路,从中选出与炎症反应相关的差异基因 Marco(Macrophage receptor with collagenous structure),在 mRNA水平上研究env序列和Marco之间是否存在正、负调控关系。最后研究Marco基因是否具有抗病毒的能力,初步探究鸡内源性反转录病毒env序列是否能通过Marco基因介导巨噬细胞产生抗病毒天然免疫作用。主要研究方法与结果如下:1)alve1敲除对巨噬细胞基因表达谱的影响首先对HD11alve1-/-细胞和HD11alve1+/+对照组细胞进行了转录组高通量测序,以研究敲除alve1对鸡巨噬细胞基因表达谱的影响。结果显示,共有1537个差异表达的基因;GO分析发现差异基因主要富集于免疫系统进程、细胞发育过程、催化活性和信号转导活性等生物学过程;KEGG分析结果显示差异基因主要富集细胞因子-细胞因子受体相互作用、癌症中的转录失调、IL-17信号和类风湿性关节炎等通路;GSEA富集分析发现Marco基因可能是参与鸡内源性反转录病毒alve1引起炎症反应过程中的关键基因。2)env序列与Marco之间存在正向调控关系为探究env序列和Marco之间的调控关系。根据所需序列构建pcDNA3.1-env1-alve1、pcDNA3.1-env2-alve1 和 pcDNA3.1-Marco 真核过表达质粒及pCDH-env1-alve1和pCDH-env2-alve1慢病毒骨架质粒,再用HEK-293T细胞包装pLV-env1-alve1和pLV-env2-alve1慢病毒以及由公司针对env序列设计并合成siRNA,同时,应用CRISPR/Cas9系统定点突变Marco基因第一个外显子,成功得到了 HD11Marco-/-细胞株。结果显示,env过表达会显著上调Marco转录水平(penv干扰会显著下调Marco转录水平(penv转录水平(p1);Marco敲除会极显著下调env转录水平(p1),表明env序列与Marco之间存在正向调控关系。3)env序列通过Marco基因介导巨噬细胞产生抗病毒天然免疫作用为探究env序列是否通过Marco基因介导HD11细胞产生抗病毒天然免疫作用。先过表达ALV-J env基因不同结构域,通过RT-qPCR检测Marco转录水平;同时过表达Marco再感染ALV-J GY3毒株,通过RT-qPCR和Western Blot检测Marco过表达对ALV-J复制水平的影响,最后通过RT-qPCR检测Marco过表达对病毒dsRNA识别受体基因Tlr3和Ifih1及抗病毒天然免疫相关基因Il-1β和inos转录水平的影响。结果显示,过表达ALV-J env基因会极显著抑制Marco转录水平(p1);过表达Marco后感染ALV-J GY3毒株,Marco基因分别在转录和翻译的过程中均极显著抑制了ALV-J的复制(p1);过表达Marco不仅可以极显著上调Tlr3和Ifih1转录水平(p1),也可以极显著上调Il-1β和inos转录水平(p1)。表明Marco可能通过激活天然免疫基因表达的途径来实现抗病毒作用。综上所述,本研究发现env序列和Marco之间存在正向调控关系,且env序列能够通过Marco基因介导HD11细胞产生抗病毒天然免疫作用。这些结果不仅对研究禽内源性白血病病毒alve1激活天然免疫机制有了新启发,而且为今后进一步研究禽源Marco基因的功能及治疗禽白血病奠定基础。

关键词：内源性反转录病毒 alve1 env 巨噬细胞 Marco 抗病毒天然免疫

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