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als基因mRNA在白念珠菌不同生物状态的表达

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ALS基因mRNA在白念珠菌不同生物状态的表达

作者：武爽青岛大学

学位级别：硕士

目的通过对酵母状态和芽管状态的白念珠菌als基因mRNA表达水平的比较,以及对浮游状态和生物膜状态的白念珠菌als基因mRNA表达水平的比较,探讨白念珠菌als基因mRNA在白念珠菌芽管及生物膜形成中可能发挥的作用,为防治白念珠菌感染提供重... 详细信息

目的通过对酵母状态和芽管状态的白念珠菌als基因mRNA表达水平的比较,以及对浮游状态和生物膜状态的白念珠菌als基因mRNA表达水平的比较,探讨白念珠菌als基因mRNA在白念珠菌芽管及生物膜形成中可能发挥的作用,为防治白念珠菌感染提供重要的理论依据。方法选取4株标准株白念珠菌和11株临床株白念珠菌进行实验研究。白念珠菌酵母状态的培育和芽管状态的诱导以及浮游状态和生物膜状态白念珠菌的制备:GSB培养基,25℃振荡培养48h,收获酵母状态的白念珠菌;ph7.0的RPMI-1640液体培养基,37℃振荡培养3h,收获芽管状态的白念珠菌;体外在6孔细胞培养板上,RPMI-1640液体培养基,37℃静置培养48h,收获生物膜状态的白念珠菌。热酸性酚法抽取不同生长状态白念珠菌的总RNA,RNA的纯度经紫外分光光度计A260/A280比值估计,RT-PCR两步法逆转录als2基因mRNA、als3基因mRNA以及ACT1基因mRNA,cDNA扩增,扩增产物琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统拍照。利用Quantity One电泳分析软件对als2基因和als3基因的cDNA扩增条带进行分析,应用SPSS11.5医学统计软件包的计数资料配对样本差值均数的t检验对实验数据进行分析(以P＜0.05为显著性标准)。结果标准株白念珠菌芽管状态的als2基因mRNA(P=0.005,P＜0.01)和als3基因mRNA(P=0.0022,P＜0.01)相对表达水平均明显高于酵母状态,临床株白念珠菌芽管状态的als2基因mRNA(P=0.000,P＜0.01)和als3基因mRNA(P=0.000,P＜0.01)相对表达水平均明显高于酵母状态,其中标准株和临床株白念珠菌中多数菌株未检测als3基因mRNA的表达,个别菌株酵母状态als3基因mRNA仅检测到低水平的表达,;标准株白念珠菌生物膜状态的als2基因mRNA(P=0.0276.P＜0.05)和als3基因mRNA(P=0.0405,P＜0.05)相对表达水平均明显高于浮游状态;临床株白念珠菌生物膜状态的als2基因mRNA(P=0.0004,P＜0.01)和als3基因mRNA(P=0.0005,P＜0.01)相对表达水平均明显高于浮游状态。结论als2基因mRNA表达和als3基因mRNA表达可能在白念珠菌丛酵母相向菌丝相的转换过程中起重要作用。als2基因mRNA和als3基因mRNA的表达在体外白念珠菌生物膜形成中可能起着一定作用。

关键词：白念珠菌 als基因生物膜双相性 RT-PCR

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抗苄嘧磺隆慈姑als基因突变位点

江苏农业学报 2010年第1期26卷 222-224页

作者：吴明根郑承志李昕珈延边大学农学院吉林龙井133400

东北地区属于施用稻田化学除草比较早的地区之一,使用磺酰脲类除草剂已有20余年.研究结果证实,延边地区稻田发生抗苄嘧磺隆的雨久花、慈姑、扁秆蔍草,过去对SU除草剂极为过敏感的慈姑、雨久花大发生,其靶标酶-新型乙酰乳酸合成酶(als)... 详细信息

东北地区属于施用稻田化学除草比较早的地区之一,使用磺酰脲类除草剂已有20余年.研究结果证实,延边地区稻田发生抗苄嘧磺隆的雨久花、慈姑、扁秆蔍草,过去对SU除草剂极为过敏感的慈姑、雨久花大发生,其靶标酶-新型乙酰乳酸合成酶(als)对苄嘧磺隆、吡嘧磺隆的抗性系数增到几十倍~([1-3]).

关键词：慈姑 als基因抗药性突变

白念珠菌不同生物状态下als4、als9基因mRNA的表达

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白念珠菌不同生物状态下ALS4、ALS9基因mRNA的表达

作者：王丽欣青岛大学

学位级别：硕士

目的：通过对白念珠菌酵母状态和芽管状态,以及浮游状态和生物膜状态下als4、als9基因mRNA表达水平的比较,探讨这两种基因在白念珠菌表型转换及生物膜形成中可能发挥的作用,为进一步研究白念珠菌的发病机制提供理论依据。方法：选取3株... 详细信息

目的：通过对白念珠菌酵母状态和芽管状态,以及浮游状态和生物膜状态下als4、als9基因mRNA表达水平的比较,探讨这两种基因在白念珠菌表型转换及生物膜形成中可能发挥的作用,为进一步研究白念珠菌的发病机制提供理论依据。方法：选取3株标准株白念珠菌和10株临床株白念珠菌进行实验研究。白念珠菌酵母状态的培育和芽管状态的诱导以及浮游状态和生物膜状态的制备：GBS培养基,25℃振荡培养48h,收获酵母状态;pH7.0的RPMI-1640液体培养基,37℃震荡培养3h,收获芽管状态;体外6孔细胞培养板涂布小牛血清,RPMI-1640液体培养基,37℃静置培养48h,收获生物膜状态。液氮反复冻融加Trizol法提取不同生长状态白念珠菌的总RNA, RNA的纯度经紫外分光光度计A260/280比值估计,RT-PCR两步法扩增als4、als9基因mRNA,及内对照ACT1基因mRNA,扩增产物琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统拍照。采用QuantityOne电泳分析软件对电泳条带进行分析,应用SPSS医学统计软件包两样本均数配对资料的t检验对实验数据进行统计学处理(以Pals4基因mRNA(Pals9基因mRNA(Pals4基因mRNA(Pals9基因mRNA(Pals4基因mRNA(Pals9基因mRNA(Pals4基因mRNA(Pals9基因mRNA(Pals4基因和als9基因可能在白念珠菌的酵母相向菌丝相转换和体外生物膜形成中起重要作用。

关键词：白念珠菌 als基因生物膜 RT-PCR

als抑制剂对固氮鱼腥藻的致毒效应与靶标酶als基因的表达及功能分析

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ALS抑制剂对固氮鱼腥藻的致毒效应与靶标酶ALS基因的表达及功能分...

作者：郑培忠上海交通大学

学位级别：硕士

本研究选择我国分布广、资源量大的有益固氮蓝藻藻种——固氮鱼腥藻(Anabaena azotica)和用量最大的磺酰脲类als抑制剂——苄嘧磺隆为研究对象，运用藻类生态毒理学、分子生物学、生物信息学以及计算机模拟等技术，开展了als抑制剂对固... 详细信息

本研究选择我国分布广、资源量大的有益固氮蓝藻藻种——固氮鱼腥藻(Anabaena azotica)和用量最大的磺酰脲类als抑制剂——苄嘧磺隆为研究对象，运用藻类生态毒理学、分子生物学、生物信息学以及计算机模拟等技术，开展了als抑制剂对固氮鱼腥藻的致毒效应与靶标酶als基因的表达及功能分析，获得了以下研究成果： 1.苄嘧磺隆对固氮鱼腥藻的毒性研究通过不同剂量苄嘧磺隆对藻体生长效应、光合色素(叶绿素、藻胆素和类胡萝卜素)以及蛋白质的影响，建立苄嘧磺隆与藻类生长的剂量——效应关系，研究发现： 1)有机溶剂丙酮对固氮鱼腥藻168h的NOEC值为0.1%;溶剂对藻体色素的组成成分没有影响，对干重影响表现出来的规律与对生长速率的影响一致。 2)苄嘧磺隆对藻体生长效应、蛋白质含量以及光合色素影响显著，总体上呈现出低剂量刺激、高剂量抑制的Hormesis效应作用模式。 3)光照变化对藻体生长影响显著，对其生长速率、细胞数、干重和蛋白质的改变明显。随着时间的延伸，光照与抑制剂苄嘧磺隆对藻体生长的交互作用影响显著。苄嘧磺隆对有益固氮鱼腥藻在一般使用浓度下存在致毒效应，而且这种致毒效应会随着光照的增强而增大。 2. A. azotica als基因的克隆、表达研究建立了A. azotica als基因的PCR扩增体系，以pMD18-T simple载体和DH5α宿主菌对A. azotica als基因进行了克隆和测序分析;同时以pET28(a)+载体和BL21(DE3)对A. azotica als进行外源表达，构建表达载体pET-als，建立了A. azoticaals酶外源表达体系。 1)A. azotica als基因核苷酸序列全长1644bp，编码547个氨基酸残基，分子量为59.292kDa。 2)通过IPTG诱导使目的蛋白A. azotica als得到了大量表达。通过不同浓度和时间的诱导优化表达条件，确定IPTG浓度为0.6mmol/L、诱导时间为5h时表达效果最好。 3)以镍柱亲和层析进行重组蛋白包涵体的纯化，推断咪唑浓度在100mmol/L时洗脱纯化效果最佳。 4)外源表达的固氮鱼腥藻als酶表现了较高的比活力，进一步证实了本体系外源表达A. azoticaals酶的可行性。 3. A. azotica als酶蛋白生物信息学研究 A. azotica als基因序列与鱼腥藻PCC7120相似性达96.89%，氨基酸序列相似性达89.54%。A. azotica als基因具有完整的开放阅读框，其编码蛋白等电点为6.02，具有若干明显的疏水性区域，二级结构中α-螺旋占38.8%、β-折叠占43.5%、β-转角占10.4%，无规则卷曲则仅占7.68%，因氨基酸组成的差异，其二级结构与鱼腥藻PCC7120有些稍微的不同。通过Blastp分析、Mega4.0进行了A. azotica als的系统发育分析;通过蛋白结构功能域预测发现，A. azotica als属于硫胺素二磷酸依赖酶家族。通过SWISS-Model同源模建可见，A. azotica als蛋白三维结构与其它als晶体结构相似，每个单体由3个结构域组成，分别为α结构域(163)，β结构域(18825)和γ结构域(33826)。经质量评估、Procheck等检测，模型合理可信。 4. A. azotica als活性部位及突变体研究研究探索了als活性部位的分子对接方法模型，推导出A.azotica als的活性部位和关键氨基酸残基，在预测出的11个pocket中，pocket7是A. azotica als的活性部位，而该部位的A381、G433、G434、D459、G461、G463、L464、Y530等氨基酸残基在A. azoticaals催化过程中起着重要作用。推断出A. azotica als具有非单体存在的四级结构，推测F276、S277、K279为A. azotica als的抗性关键位点，并通过PCR定点突变成功构建了突变基因，获得了大量扩增和表达。本研究揭示了als抑制剂的作用机理和致毒机制，丰富了蓝藻基因工程的研究体系，搭建了A. azotica als研究的框架结构，填补了该领域的研究空白，不仅具有重要的学术价值，而且为新型除草剂的构效关系研究拓展了新的空间，为有益固氮蓝藻抗性种质资源的培育应用以及除草剂的使用提供了科学依据，具有重要的应用价值，对促进现代绿色生态农业的发展具有重要意义。

关键词：固氮鱼腥藻 als抑制剂 als基因毒性效应克隆与表达生物信息学

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乙酰乳酸合成酶及als基因研究概述

中国农学通报 2016年第26期32卷 37-42页

作者：任洪雷黑龙江省农业科学院玉米研究所哈尔滨150086

乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂以其独有的优点,20世纪90年代以来一直占领世界除草剂市场。抗草甘膦转基因作物的问世,草甘膦的销售量大幅增加,乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂销量不断减少。然而,大量抗草甘膦杂草的产生,使得人们期望培... 详细信息

乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂以其独有的优点,20世纪90年代以来一直占领世界除草剂市场。抗草甘膦转基因作物的问世,草甘膦的销售量大幅增加,乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂销量不断减少。然而,大量抗草甘膦杂草的产生,使得人们期望培育出抗不同类型除草剂转基因作物,抗als抑制剂类除草剂成为人们的首选。笔者概述了乙酰乳酸合成酶的结构、功能、除草剂作用机理、抗als基因的研究现状。期望对抗als抑制剂基因的筛选,利用提供参考。

关键词：抗除草剂乙酰乳酸合成酶 als基因

苦参碱对生物膜状态白色念珠菌als基因表达的影响

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临床口腔医学杂志 2017年第4期33卷 211-213页

作者：吴岚沈雪敏周曾同葛姝云周永梅上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔黏膜科上海市口腔医学研究所上海市口腔医学重点实验室上海200011

目的:研究不同浓度苦参碱对生物膜状态下的白色念珠菌als基因mRNA表达量的影响。方法:采用白色念珠菌标准菌株ATCC76615为研究对象,经载玻片法形成白色念珠菌生物膜。在经不同浓度苦参碱干预下,通过RT-PCR法检测生物膜状态白色念珠菌als... 详细信息

目的:研究不同浓度苦参碱对生物膜状态下的白色念珠菌als基因mRNA表达量的影响。方法:采用白色念珠菌标准菌株ATCC76615为研究对象,经载玻片法形成白色念珠菌生物膜。在经不同浓度苦参碱干预下,通过RT-PCR法检测生物膜状态白色念珠菌als1/als4基因mRNA表达量的变化。结果:不同浓度苦参碱干预下生物膜状态白色念珠菌黏附相关基因als1/als4 mRNA表达减弱。1~8 mg/m L苦参碱干预下als1/als4的mRNA表达相对量分别为0.96~0.34/0.93~0.28。结论:苦参碱可抑制白色念珠菌粘附相关基因als1/als4 mRNA水平的表达。

关键词：白色念珠菌生物膜黏附 als基因

寡聚核苷酸介导的基因突变技术创制抗除草剂烟草新种质

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广西植物 2022年第9期42卷 1551-1560页

作者：谢宇峰秦利军贵州大学农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/生命科学学院贵阳550025

为进一步优化烟草(Nicotiana tabacum)品种‘K326’的种质,该研究采用寡聚核苷酸介导的基因突变(oligonucleotide-mediated mutagenesis,OMM)技术,利用植物中支链氨基酸合成途径中第一个关键酶——乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase,als)突变后烟草对氯磺隆除草剂不敏感且产生抗性的特征,以及NCBI报道的als基因序列同源克隆了烟草品种‘K326’中的als基因,并根据als基因序列设计用于定点突变的RNA/DNA嵌合体,导入烟草品种‘K326’创制对氯磺隆除草剂具有抗性的烟草新种质。结果表明:(1)烟草品种‘K326’具有2条als基因,即als SuRA和als SuRB,大小分别为2004 bp和2010 bp。(2)根据2个基因的保守位点als SuRA 588脯氨酸位点和als SuRB 1719色氨酸位点设计用于als基因核苷酸第588位点的Chl-588嵌合体和第1719位点的Chl-1719嵌合体。(3)利用基因枪成功将这2个片段导入烟草愈伤组织,愈伤组织依次经抗性芽分化和生根,共获得氯磺隆抗性植株22株。(4)抗性植株als酶活性测定显示,8株抗性植株具有较强的活性,进一步对抗性植株中跨突变位点保守扩增、测序,最终确定有2株(f11和b18)分别在588、1719位点产生定点突变。综上认为,该研究在获得烟草品种‘K326’抗氯磺隆新种质同时,也为培育抗性烟草新种质提供了理想的亲本材料。

关键词：烟草 als基因除草剂抗性氯磺隆 OMM技术

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看麦娘对甲基二磺隆靶标抗性的快速检测

农药学学报 2018年第2期20卷 178-184页

作者：郭文磊白霜池艳艳冯莉王金信山东农业大学植物保护学院山东泰安271018 广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

甲基二磺隆是防除小麦田看麦娘Alopecurus aequalis等禾本科杂草的主要除草剂品种之一,但目前中国山东、江苏及安徽等地已有部分看麦娘种群对其产生了抗性。als基因197位点突变是看麦娘对甲基二磺隆产生抗性的重要机理,根据突变型和野... 详细信息

甲基二磺隆是防除小麦田看麦娘Alopecurus aequalis等禾本科杂草的主要除草剂品种之一,但目前中国山东、江苏及安徽等地已有部分看麦娘种群对其产生了抗性。als基因197位点突变是看麦娘对甲基二磺隆产生抗性的重要机理,根据突变型和野生型看麦娘在197位点处碱基序列的不同,本研究设计出了一种衍生性酶切扩增多态性序列（d CAPS）分子标记方法,可用于197位点突变的快速检测。通过在引物D197F序列的3′端引入一个错配碱基,扩增所得不同种群看麦娘的als片段经限制性内切酶Bam H I酶切后表现出多态性：野生敏感型分别产生了200和36 bp的2个条带;纯合突变型因无法被切开,只有236 bp的一个条带;而杂合突变型则同时产生了上述3个条带。该d CAPS检测结果准确、可靠,与经典的整株水平测定结果一致,并且可同时检测197位点上任一形式的突变。研究结果可为看麦娘等禾本科杂草对甲基二磺隆靶标抗性的快速检测提供理论依据。

关键词：看麦娘甲基二磺隆靶标抗性 als基因突变 dCAPS

基于Pro-197-Ser突变的抗双氟磺草胺荠菜的快速检测

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杂草学报 2021年第2期39卷 14-19页

作者：李琦于金萍郭文磊刘亦学张惟天津市农业科学院植物保护研究所天津300381 广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室广东广州510640

双氟磺草胺是防除小麦田荠菜(Capsella bursa-pastoris)等阔叶杂草的主要除草剂品种之一,目前在我国河南、河北、天津等地已有荠菜种群对其产生了抗药性。乙酰乳酸合成酶(als)基因第197位位点核苷酸突变是荠菜对双氟磺草胺产生抗药性的... 详细信息

双氟磺草胺是防除小麦田荠菜(Capsella bursa-pastoris)等阔叶杂草的主要除草剂品种之一,目前在我国河南、河北、天津等地已有荠菜种群对其产生了抗药性。乙酰乳酸合成酶(als)基因第197位位点核苷酸突变是荠菜对双氟磺草胺产生抗药性的主要原因,通过在引物D197F序列的3′端引入错配碱基,设计出一种衍生性酶切扩增多态性序列(dCAPS)分子标记方法,可用于第197位位点核苷酸突变的快速检测。抗药性及敏感荠菜的als基因扩增片段经限制性内切酶AvaⅡ酶切后表现出多态性,敏感荠菜产生了31、192 bp等2个片段;抗药性荠菜产生了31、192、223 bp等3个片段。该方法检测结果准确、可靠,与整株水平测定结果一致,并适用于第197位位点的任意氨基酸取代。这种dCAPS分子标记方法可对田间当季杂草进行检测,可为荠菜种群抗药性的快速检测与监测提供理论支持。

关键词：荠菜双氟磺草胺靶标抗药性 als基因 dCAPS