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作者：江梦南吉林大学

学位级别：硕士

转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一种细胞因子超家族,具有促使细胞生长和转化的功能。TGF-β在人体中扮演着肿瘤促进因子的角色,可加速组织纤维化和细胞外基质沉积的进程,对人体的免疫系统造成破坏,刺激血管生... 详细信息

转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一种细胞因子超家族,具有促使细胞生长和转化的功能。TGF-β在人体中扮演着肿瘤促进因子的角色,可加速组织纤维化和细胞外基质沉积的进程,对人体的免疫系统造成破坏,刺激血管生成,促进上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。因此,能切断TGF-β的信号传导通路的抑制剂在肿瘤诊疗和抗纤维化诊疗等多个领域中具有广泛的应用前景。alk5是TGF-β的蛋白受体,由于alk5在TGF-β的信号传导途径中起着关键的作用,在癌症治疗和抗组织纤维化过程中,它被看作是医治这些疾病的关键靶点。p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)和alk5的蛋白序列具有高度同源性,所以对alk5具有抑制活性的小分子在抑制alk5的时候也可能会对p38 MAPK产生一定程度的抑制作用。但是,这些抑制剂对p38 MAPK抑制作用究竟是会发挥出双靶点的抑制作用,还是会导致该类药物的毒副作用,目前尚未见文献报道。因此找到选择性强的alk5抑制剂十分重要。近年来一系列的alk5小分子抑制剂已经问世,然而这些小分子抑制剂与蛋白相互作用的机制尚未阐明。本文通过二维定量构效关系(2D-quantitative structure-activity relationship,2D-QSAR)、分子对接(Molecular docking)、分子动力学模拟(Molecular dynamics simulation)和结合自由能计算等方法,研究了抑制剂与蛋白激酶alk5的相互作用机制。在定量构效模型研究中,本文使用相关系数r、外部验证相关系数r、抽一法交互验证系数q等预测2D-QSAR模型的拟合程度,预测能力和鲁棒性。经过计算,本文得到的两个定量构效模型的抽一法交叉验证系数q分别为0.571和0.629,外部验证相关系数r分别为0.703和0.764。这些系数的值证明本文预测得到的2D-QSAR模型是合理有效的。此外,在结合自由能计算中,通过分子力学/广义波恩表面积方法(Molecular Mechanics/Generalized Born Surface Area,MM/GBSA)计算得到的结合自由能的排序与实验结果是一致的。在对结合自由能的分析中,我们发现范德华能量项对小分子配体与蛋白的结合影响最为显著,并确定了氨基酸残基Val219、Lys232、Tyr282、His283、Leu340和Asp351能与抑制剂形成较强的相互作用。这些结果都为进一步设计活性和选择性更强的alk5抑制剂提供了理论基础。

关键词： alk5 小分子抑制剂二维定量构效关系分子动力学模拟分子力学/广义波恩表面积计算

X射线辐照后人血管内皮细胞alk5表达变化研究

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X射线辐照后人血管内皮细胞ALK5表达变化研究

作者：冯俊博新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:研究X射线辐照后24小时人血管内皮细胞激活素受体样激酶5（alk5）及其下游p-Smad2、p-Smad3表达情况、RepSox对alk5及其所在信号通路的抑制作用以及辐照后血管内皮细胞激活素受体样激酶1（alk1）的表达情况。方法:分为对照组（Cont... 详细信息

目的:研究X射线辐照后24小时人血管内皮细胞激活素受体样激酶5（alk5）及其下游p-Smad2、p-Smad3表达情况、RepSox对alk5及其所在信号通路的抑制作用以及辐照后血管内皮细胞激活素受体样激酶1（alk1）的表达情况。方法:分为对照组（Control）、辐照组（IR）和RepSox干预组（IR+RepSox）。使用X射线对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行照射,于辐照后24小时分别检测细胞增殖情况、细胞alk5、Smad2、Smad3、alk1 m RNA表达、alk5、p-Smad 2、p-Smad3蛋白表达以及使用RepSox进行干预后对上述指标的影响。结果:辐照后24小时辐照组血管内皮细胞数量低于对照组,alk5 m RNA和蛋白表达量较对照组分别上调了56.2%和113%;Smad2 m RNA表达量较对照组上调了86%,Smad3 m RNA表达量较对照组上调了79.5%;p-Smad2蛋白表达量较对照组上调了194%,p-Smad3蛋白表达量较对照组上调了194%。RepSox干预后,RepSox干预组（1μmol/L）细胞数量高于辐照组,RepSox干预组（1μmol/L）alk5 m RNA和蛋白表达量较辐照组分别下调了29.1%和35.6%;Smad2 m RNA表达量较辐照组下调了29.7%,Smad3 m RNA表达量较辐照组下调了17.1%;p-Smad 2蛋白表达量较辐照组下调了13.6%,p-Smad3蛋白表达量较辐照组下调了13.6%。alk1 m RNA表达量较对照组下调了32.7%。结论:辐照可以导致血管内皮细胞alk5及其下游基因表达上调,alk1表达量有可能下调,使用RepSox（1μmol/L）可以有效抑制alk5及其下游基因表达,降低辐照对血管内皮细胞的损伤。

关键词：辐照血管内皮细胞 alk1 alk5 RepSox

齐口裂腹鱼Gdf9、alk5和Bmpr2的克隆、表达及其功能的初步研究

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齐口裂腹鱼Gdf9、Alk5和Bmpr2的克隆、表达及其功能的初步研究

作者：张松培四川农业大学

学位级别：硕士

TGF-β超家族及其受体在性腺发育过程中发挥着重要作用。为研究生长分化因子9(Growth differentiation factor-9,gdf9)与其受体骨形成蛋白受体2(Bone morphogenetic protein receptor 2,bmpr2)和激活素受体样激酶5(activin receptor-like kinase 5,alk5)在齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)性腺发育过程中的作用,本文克隆了齐口裂腹鱼gdf9、alk5和bmpr2 cDNA全序列,且分析了其表达模式,同时探究了性腺发育过程中外源雌激素(E)刺激对其表达量的影响。主要结果如下:1.齐口裂腹鱼gdf9 cDNA全长1958bp,编码413个氨基酸。推导氨基酸序列具有典型的TGF-β结构域,分子量约47.6 k Da。系统进化分析结果表明,其与鲤、异育银鲫和斑马鱼的亲缘关系较近。表达模式分析显示,性腺中gdf9的表达显著高于其它组织;卵巢gdf9的表达呈现先上升后下降的趋势,并在皮质小泡期达到峰值;而其在精巢中的表达趋势为先下降后上升,在精子生成晚期达到最高。2.获得的齐口裂腹鱼bmpr2 cDNA全长为3704 bp,编码的1070个氨基酸分子量约116.4 k Da。其氨基酸序列包含6个糖基化位点和1个跨膜结构域。亲缘关系分析发现,齐口裂腹鱼bmpr2与斑马鱼最近。与其它组织相比,bmpr2在性腺中的表达量最高,且卵巢和精巢中的表达量均先升高后降低,在皮质小泡期和精子生成早期达到峰值。3.获得了全长1952bp的alk5 cDNA序列。推导编码氨基酸有501个,分子量约56.5 k Da,包括N-糖基化位点2个、跨膜结构域1个和典型的SGSGSG结构域1个。系统进化树结果显示,齐口裂腹鱼alk5与斑马鱼聚为一支。alk5在性腺中的表达量显著高于其它组织;卵巢alk5表达量先升高后降低,而精巢中的表达趋势相反。4.在性腺中均能检测到Gdf9、Bmpr2和alk5的表达。免疫组化结果显示,卵巢中的初级生长期卵母细胞、皮质小泡期和卵黄生成期卵母细胞细胞质以及颗粒细胞中均能检测到较强的Gdf9阳性信号。Bmpr2的阳性信号存在于卵母细胞细胞膜、细胞质和颗粒细胞。而alk5主要在卵母细胞膜、细胞质和颗粒细胞中表达。精巢中,Gdf9、Bmpr2和alk5信号均位于精原细胞、精母细胞、精子细胞和支持细胞中。5.不同浓度的E拌料投喂对齐口裂腹鱼幼鱼的存活无明显影响。随剂量增加和处理时间延长,性腺中gdf9、bmpr2和alk5的表达量均呈现升高的趋势,这表明其表达量对E刺激存在着时间和剂量依存效应。本研究发现,gdf9、bmpr2和alk5表达于齐口裂腹鱼不同发育时期的性腺,这表明gdf9、bmpr2和alk5通过自分泌或旁分泌方式参与了齐口裂腹鱼卵母细胞和精子细胞的发育。

关键词：齐口裂腹鱼 Gdf9 Bmpr2 alk5 定位表达模式

生长分化因子9及其信号通路蛋白（alk5、Smad2和Smad4）在成年鹌鹑和鸡睾丸中的表达与定位

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生长分化因子9及其信号通路蛋白（ALK5、Smad2和Smad4）在成年鹌...

作者：高真真山西农业大学

学位级别：硕士

目的：作为TGFβ超家族一员的生长分化因子9(Growth Differentiation Factor9, GDF9),是第一个被鉴定的由卵母细胞分泌的生长因子。因其能够刺激卵母细胞周围体细胞的增殖、分化,调节卵泡发育过程中其他激素、细胞因子的表达与分泌以... 详细信息

目的：作为TGFβ超家族一员的生长分化因子9(Growth Differentiation Factor9, GDF9),是第一个被鉴定的由卵母细胞分泌的生长因子。因其能够刺激卵母细胞周围体细胞的增殖、分化,调节卵泡发育过程中其他激素、细胞因子的表达与分泌以及促进排卵前卵泡成熟等作用而备受关注。近年来有研究证明GDF9在小鼠、大鼠、人和牛的睾丸中也有表达;本研究组以前的研究结果显示GDF9在狗、猫和羊驼的睾丸中有表达;体外试验证明GDF9可以对睾丸曲精小管内唯一的体细胞——支持细胞进行调节。虽然根据以前的研究结果可以得知GDF9在哺乳动物睾丸中的表达具有普遍性,但是几乎没有关于GDF9在家禽动物睾丸中的表达和作用的报道。本项研究通过免疫印迹法和免疫组织化学法检测GDF9及其信号通路蛋白(alk5、Smad2和Smad4)在成年鹌鹑和鸡睾丸中的表达和定位,探索GDF9在动物睾丸中的表达和定位是否具有普遍性,及其在家禽动物和哺乳动物睾丸、卵巢中的作用方式是否具有一致性。方法： ①运用免疫印迹方法即Western blotting,研究GDF9及其信号通路蛋白(alk5、 Smad2和Smad4)在成年鹌鹑和鸡睾丸中是否有表达。 ②运用免疫组织化学方法,研究GDF9及其信号通路蛋白(alk5、Smad2和Smad4)在成年鹌鹑和鸡睾丸中的时空分布。结果： ①Western blotting实验结果显示,在成年鹌鹑和鸡的睾丸组织提取物中,存在分子量大小约为60kDa和21kDa并且可以与多克隆兔抗GDF9发生免疫阳性反应的蛋白条带。同时也存在分子量约为55kDa大小可以与多克隆兔抗alk5发生免疫阳性反应的蛋白条带。除此之外,还存在分子量大小约为52kDa和60kDa的蛋白条带,这两个条带分别可以与多克隆兔抗Smad2和多克隆兔抗Smad4发生免疫阳性反应。 ②免疫组织化学实验结果显示,GDF9阶段性的定位于成年鹌鹑睾丸生精上皮的精原细胞、精母细胞和圆形精细胞的胞质内,其中在精原细胞和精母细胞中的表达量高于在圆形精细胞中的表达量,在支持细胞内未观察到GDF9的阳性反应结果;GDF9的I型膜受体alk5在成年鹌鹑睾丸中的表达显示,alk5主要定位于精原细胞和精母细胞;作为GDF9的胞内受体转导者,Smad2主要在精原细胞和精母细胞胞质内表达;共转导者Smad4普遍高表达于成年鹌鹑的生殖细胞和支持细胞。 ③免疫组织化学实验结果显示,GDF9阶段性的定位在成年鸡睾丸生精上皮的精原细胞、精母细胞和圆形精细胞的胞质内,其中在精原细胞和精母细胞中的表达量高于在圆形精细胞中的表达量,在支持细胞内未观察到GDF9的阳性反应结果;GDF9的I型膜受体alk5在成年鸡睾丸中的表达显示,alk5主要定位于精原细胞和精母细胞;作为GDF9的胞内受体转导者,Smad2主要在精原细胞、精母细胞和圆形精细胞内表达,但是在精原细胞和精母细胞中的表达量高于在精原细胞内的表达量;共转导者Smad4普遍高表达于成年鸡的生殖细胞和支持细胞。结论：本项研究显示GDF9及其信号通路蛋白(alk、Smad2和Smad4)在成年鹌鹑和鸡睾丸中都有表达,且这四种蛋白在两种动物曲精小管内的细胞定位基本一致。通过这四种蛋白在成年鹌鹑和鸡睾丸中的表达特征和时空分布,提示在成年鹌鹑和鸡的睾丸中,GDF9由精原细胞、精母细胞和圆形精细胞分泌,通过自分泌或旁分泌方式对生精细胞的增殖和分化和支持细胞的功能起调节作用。

关键词：睾丸精子发生生长分化因子9 alk5 Smad2 Smad4 支持细胞

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alk5小分子抑制剂生物活性研究进展

中南药学 2023年第10期21卷 2698-2703页

作者：李倩倩薛晓文中国药科大学药学院南京211100 中国药科大学药物化学教研室南京211100

转化生长因子-β(TGF-β)是一种具有广泛生物活性的细胞因子,被激活后与TGF-β受体结合,通过TGF-β/Smad与非Smad信号通路介导诸多生物学效应。alk5为该受体家族研究最为广泛的亚型之一,近年来其生物活性研究也取得了一些进展。本文就A... 详细信息

转化生长因子-β(TGF-β)是一种具有广泛生物活性的细胞因子,被激活后与TGF-β受体结合,通过TGF-β/Smad与非Smad信号通路介导诸多生物学效应。alk5为该受体家族研究最为广泛的亚型之一,近年来其生物活性研究也取得了一些进展。本文就alk5抑制剂在抗肿瘤、抗纤维化、促进肠神经胶质细胞转化为神经元、血脑屏障保护以及降低眼压等生物活性方面的研究进展进行简要综述。

关键词：转化生长因子-β alk5 生物活性

alk5激活型突变体在肾癌细胞中的表达及功能

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现代肿瘤医学 2016年第8期24卷 1184-1187页

作者：李英杰肥城矿业中心医院肾内科山东泰安271606

目的:构建alk5激活型真核表达质粒Flag-alk5 T204D,证实融合蛋白在肾癌细胞内表达,并验证其对TGF-β信号通路的激活作用。方法:以野生型alk5质粒为模板,采用重叠延伸PCR方法进行定点突变;将构建的重组质粒测序并转染到肾癌细胞ACHN中,... 详细信息

目的:构建alk5激活型真核表达质粒Flag-alk5 T204D,证实融合蛋白在肾癌细胞内表达,并验证其对TGF-β信号通路的激活作用。方法:以野生型alk5质粒为模板,采用重叠延伸PCR方法进行定点突变;将构建的重组质粒测序并转染到肾癌细胞ACHN中,提取细胞蛋白进行Western blot检测;利用双荧光素酶报告基因分析,检测该突变体对TGF-β信号通路典型靶基因启动子的激活作用。结果:对alk5的表达序列进行定点突变,构建了alk5激活型真核表达质粒Flag-alk5 T204D;Western blot检测到融合蛋白的表达,分子量约为58k Da;Flag-alk5 T204D能够上调TGF-β信号通路典型靶基因启动子活性。结论:成功构建了Flag-alk5 T204D并验证了其对TGF-β信号通路的激活作用,为进一步研究alk5的生物学特性及其功能奠定了基础。

关键词： alk5 TGF-β 定点突变

1,3,5-三取代吡唑类alk5抑制剂的合成与生物评价研究

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中国药物化学杂志 2010年第4期20卷 241-251页

作者：李行舟王莉莉龙隆肖军海李松军事医学科学院毒物药物研究所北京100850

目的设计合成1,3,5-三取代吡唑类化合物,并研究其对alk5所介导的TGFβ信号通路的抑制活性,以期发现新型alk5抑制剂。方法先以取代的苯甲醛和4-乙酰苯甲腈为原料,合成取代的查儿酮,再与芳基肼或芳基肼盐酸盐反应生成1,3,5-三取代吡唑啉,... 详细信息

目的设计合成1,3,5-三取代吡唑类化合物,并研究其对alk5所介导的TGFβ信号通路的抑制活性,以期发现新型alk5抑制剂。方法先以取代的苯甲醛和4-乙酰苯甲腈为原料,合成取代的查儿酮,再与芳基肼或芳基肼盐酸盐反应生成1,3,5-三取代吡唑啉,然后氧化脱氢得到相应的1,3,5-三取代吡唑类化合物,最后对官能团做适当的变换,得到目标化合物;应用基于细胞的TGF-Smad2检测评价了化合物的alk5抑制活性。结果与结论合成29个未见报道的新目标化合物,其结构均经核磁共振谱与质谱确证,其中化合物6c显示有较好的alk5抑制活性。

关键词：化学合成激酶抑制剂 alk5 1,3,5-三取代吡唑

咪唑[2,1-b][1,3,4]噻二唑类alk5抑制剂3D-QSAR研究

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广州化工 2015年第23期43卷 120-124页

作者：黄晓艳西北农林科技大学理学院陕西杨凌712100

TGF-β信号的转导与纤维化疾病的发生及癌细胞的侵入和转移高度相关,而TGF-β信号通路中的重要节点alk5是治疗这些疾病的理想靶标。本文针对31个新型咪唑[2,1-b][1,3,4]噻二唑类alk5抑制剂,分别运用Co MFA和Co MSIA两种经典方法进行了3D... 详细信息

TGF-β信号的转导与纤维化疾病的发生及癌细胞的侵入和转移高度相关,而TGF-β信号通路中的重要节点alk5是治疗这些疾病的理想靶标。本文针对31个新型咪唑[2,1-b][1,3,4]噻二唑类alk5抑制剂,分别运用Co MFA和Co MSIA两种经典方法进行了3D-QSAR研究,并获得了预测能力较优的两个模型(Co MFA:q2=0.803,r2=0.969;Co MSIA:q2=0.765,r2=0.938)。3D-QSAR模型三维等值图揭示了一些结构特性与抑制活性的关系,为该类药物结构改造提供了有效信息,可减少设计合成工作量,提高新药研发成功的可能性。

关键词：咪唑[2,1-b]噻二唑 alk5 CoMFA CoMSIA

RepSox对X射线辐照后血管内皮细胞alk5表达的抑制作用

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山西医科大学学报 2021年第6期52卷 730-734页

作者：冯俊博程永波新疆医科大学第一附属医院消化一科乌鲁木齐830000

目的研究X射线辐照后血管内皮细胞中激活素受体样激酶5(alk5)的表达变化以及RepSox对alk5及其下游靶点的抑制作用。方法将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分为对照组(Control)、辐照组(IR)和RepSox干预组(IR+RepSox)。RepSox干预组辐照前24 h... 详细信息

目的研究X射线辐照后血管内皮细胞中激活素受体样激酶5(alk5)的表达变化以及RepSox对alk5及其下游靶点的抑制作用。方法将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分为对照组(Control)、辐照组(IR)和RepSox干预组(IR+RepSox)。RepSox干预组辐照前24 h进行干预,然后用X射线进行照射。辐照后24 h采用CCK-8法检测细胞增殖,qRT-PCR检测细胞alk5、Smad2和Smad3 mRNA表达,Western blot检测alk5、p-Smad2/3蛋白表达。结果辐照后24 h,与对照组比较,辐照组细胞数量下降(P5);alk5、Smad2、Smad3 mRNA表达均上调(P5),alk5、p-Smad2/3蛋白表达均上调(P5)。与辐照组比较,RepSox干预组细胞数量升高(P5);alk5、Smad2、Smad3 mRNA表达均下调(P5),alk5、p-Smad2/3蛋白表达均下调(P5)。结论辐照可以导致血管内皮细胞alk5及其下游基因表达上调,使用RepSox可以有效地抑制alk5及其下游基因的表达,从而降低辐照对血管内皮细胞的损伤。

关键词：辐照血管内皮细胞 alk5