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CNPY2调控akt/gsk3β通路在有氧运动干预非酒精性脂肪肝中的作用研究

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CNPY2调控AKT/GSK3β通路在有氧运动干预非酒精性脂肪肝中的作用...

作者：王佳倩成都体育学院

学位级别：硕士

目的:通过高脂膳食诱导非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠模型,采用有氧运动干预,探讨CNPY2调控akt/gsk3β通路在有氧运动干预NAFLD中的作用及可能机制。方法:12±1周雄性CNPY2基因敲除小鼠(ko)及其同系同窝野生小鼠(wt)各30只。小鼠适应性喂... 详细信息

目的:通过高脂膳食诱导非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠模型,采用有氧运动干预,探讨CNPY2调控akt/gsk3β通路在有氧运动干预NAFLD中的作用及可能机制。方法:12±1周雄性CNPY2基因敲除小鼠(ko)及其同系同窝野生小鼠(wt)各30只。小鼠适应性喂养一周后随机分为:对照组(wt-C,ko-C)、模型组(wt-M,ko-M)、模型运动组(wt-ME,ko-ME),每组10只。对照组予以普通饲料喂养,模型组和模型运动组予以高脂饲料喂养,直至18周。实验第10周,模型运动组进行有氧运动干预,连续干预8周,直至实验结束。油红O和HE染色观察肝组织病理形态;全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、低密度脂蛋白(LDL-c)和高密度脂蛋白(HDL-c)水平;免疫蛋白印迹法检测akt、P-akt、gsk3β、P-gsk3β、CNPY2、Caspase-3蛋白表达变化;Tunel法检测肝细胞凋亡。结果:(1)与wt-C组比较,wt-M组体重增加,肝指数上升,血脂代谢紊乱、肝功能受损,CNPY2表达上调,P-akt/akt、P-gsk3β/gsk3β表达下调,Caspase-3表达上调,肝细胞凋亡指数上升(Pakt/akt、P-gsk3β/gsk3β表达上调,Caspase-3表达下调,肝细胞凋亡指数下降(Pakt/akt、P-gsk3β/gsk3β表达上调,Caspase-3表达下调(Pakt/akt、P-gsk3β/gsk3β表达上调,Caspase-3表达下调,肝细胞凋亡指数下降(Pakt/akt、P-gsk3β/gsk3β表达上调,Caspase-3表达下调,肝细胞凋亡指数下降(Pakt/gsk3β通路参与NAFLD形成;CNPY2基因缺失和有氧运动均可有效改善NAFLD,其机制可能与其下调CNPY2的表达,激活akt/gsk3β信号通路,下调Caspase-3表达,减少肝细胞凋亡有关。

关键词：有氧运动非酒精性脂肪肝凋亡 CNPY2 akt/gsk3β

基于akt/gsk3β信号通路探讨游泳训练改善脑出血小鼠运动功能的机制

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基于Akt/GSK3β信号通路探讨游泳训练改善脑出血小鼠运动功能的机...

作者：李永旭福建中医药大学

学位级别：硕士

脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是一种严重危害人类健康的疾病,其年发病率为10-30/10万人,占所有卒中类型的10%至30%。脑出血多发生于基底节区,局部血肿的形成,压迫邻近组织,促进炎症反应、细胞凋亡和脑血脑屏障的破坏,导致严... 详细信息

脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是一种严重危害人类健康的疾病,其年发病率为10-30/10万人,占所有卒中类型的10%至30%。脑出血多发生于基底节区,局部血肿的形成,压迫邻近组织,促进炎症反应、细胞凋亡和脑血脑屏障的破坏,导致严重的脑损伤。细胞凋亡是血肿周围区域细胞死亡的主要形式。已有研究表明,细胞凋亡与神经功能损伤密切相关。众所周知,早期康复对ICH后功能恢复是有效的,相关机制尚未深入阐明。丝氨酸苏氨酸激酶（akt）在ICH康复中发挥着重要的作用,akt在多种生理和病理过程中发挥重要作用,包括炎症和细胞凋亡。活化的akt可调节存活和凋亡通路的几个下游靶点以抑制凋亡,其中最重要的靶点是糖原合成酶激酶3β（gsk3β）,活化的gsk3β促进细胞损伤,增加cleaved caspase 3（CC3）活性,这是细胞凋亡执行阶段的早期步骤。Methylene blue（MB）通过激活akt/gsk3β信号通路对蛛网膜下腔出血（SAH）具有神经保护作用。游泳运动可以降低个体对压力的脆弱性,并且有助于akt/gsk3β/CRMP-2通路和微管动力学介导的对神经可塑性的保护作用。本研究发现,小鼠在诱导脑出血后,p-akt/akt和p-gsk3β/gsk3β蛋白的表达显著下降,神经功能和运动能力显著下降,游泳训练则促进了p-akt/akt和p-gsk3β/gsk3β蛋白的表达,改善了ICH小鼠的神经功能和运动能力。然而akt酶活性抑制剂gsk690693的使用则逆转了这一效果。在康复训练中对akt/gsk3β信号通路进行干预可能有助于改善出血性脑卒中病人的运动功能。目的探讨早期游泳训练对脑出血小鼠神经功能,运动能力和akt信号的影响。并使用gsk690693（akt酶活性抑制剂）抑制akt酶活性,深入探讨游泳训练改善脑出血小鼠神经功能的机制方法本研究通过使用立体定位仪向98只成年SPF级雄性C57BL/6小鼠（10-12周龄,25-30g）脑中注射Ⅳ型胶原酶进行脑出血造模或者注射生理盐水构建假手术。根据改良神经功能评分（m NSS）和小动物核磁共振（MRI）T2WI加权成像结果,小鼠被随机分配到两个独立的实验。实验一:探讨早期游泳训练对脑出血小鼠神经功能,运动能力和akt信号的影响。将小鼠随机分成5组:假手术组（Sham）、脑出血7天组（ICH7d）、脑出血+游泳训练7天组（ICH+7d ST）、脑出血14天组（ICH14d）和脑出血+游泳训练14天组（ICH+14d ST）。Sham组、ICH7d组和ICH14d组均不进行游泳训练。ICH+7d ST组和ICH+14d ST组分别进行7 d和14 d的游泳训练。实验二:实验一结果显示游泳训练可改善ICH小鼠的神经功能缺损,促进akt/gsk3β信号通路的激活。因此,实验二采用akt酶活性抑制剂gsk690693进一步探讨akt/gsk3β通路是否介导游泳训练对ICH小鼠神经功能缺损的保护作用。将小鼠随机分成4组:假手术组（Sham）、脑出血7天组（ICH7d）、脑出血+akt抑制剂（gsk690693）+游泳训练7天组（ICH+inhibitor+7d ST）和脑出血+游泳训练7天组（ICH+7d ST）组。Sham组和ICH7d组均不进行游泳训练。ICH+inhibitor+7d ST组、ICH+7d ST组进行7 d的游泳训练。采用旷场实验来评价游泳训练后ICH小鼠的自发运动能力和焦虑相关行为（包括:旷场总路程、旷场平均速度、旷场中心路程/总路程）、通过Y迷宫自发交替性实验评价实验性脑出血小鼠的工作记忆和自发活动能力、小动物核磁共振弥散张量成像（DTI）检测反映小鼠运动皮层白质纤维的部分各向异性（fractional anisotropy,FA）和平均弥散率（mean diffusivity,MD）。磁共振波谱（MRS）检测纹状体基底节区:肌酸、胆碱、N-乙酰天冬氨酸、肌醇、谷氨酸和乳酸的相对代谢水平。Western blot检测血肿周围组织:p-akt、akt、p-gsk3β、gsk3β、Bax和Bcl-2蛋白的表达情况。免疫组化检测血肿周围组织胶质细胞的激活情况:Iba1和GFAP的表达。进行观察和评估早期游泳训练对脑出血小鼠神经功能和运动能力的影响。探讨akt/gsk3β信号通路在游泳训练改善脑出血小鼠神经功能和运动能力中发挥的作用。结果1.游泳训练显著改善了ICH小鼠的神经功能:与Sham组相比模型组m NSS评分显著上升,Y迷宫正确交替率显著下降（P＜0.01）。与ICH7d组相比,ICH+7d ST组小鼠的m NSS评分显著下降（P＜0.05）,与ICH14d组相比,ICH+14d ST组m NSS评分降低,但是差异不显著,无统计学意义（P

关键词： akt/gsk3β 胶质细胞激活脑出血运动功能游泳训练

电针通过akt/gsk3β途径改善PCOS大鼠肝脏脂代谢的研究

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电针通过Akt/GSK3β途径改善PCOS大鼠肝脏脂代谢的研究

作者：庄子荀广州医科大学

学位级别：硕士

研究背景多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄妇女最常见的内分泌疾病之一,易导致排卵障碍及不孕,并且存在较高的糖脂代谢紊乱风险,合并发生非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的比例较高... 详细信息

研究背景多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄妇女最常见的内分泌疾病之一,易导致排卵障碍及不孕,并且存在较高的糖脂代谢紊乱风险,合并发生非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的比例较高。胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)是PCOS的常见表现,也是NAFLD关键发病因素。IR导致脂肪分解抑制功能受损,进而增加游离脂肪酸流入肝脏,加重肝脂肪变性和肝损伤,是引起NAFLD的发生的重要原因之一。此外PCOS常见高雄激素以及肥胖等代谢紊乱,也会促进NAFLD的发展。电针(Electroacupuncture,EA)是临床上治疗PCOS的重要方法之一,可改善患者排卵障碍和糖脂代谢紊乱,增强胰岛素敏感性。课题组前期研究发现来曲唑加高脂饮食诱导了肥胖型PCOS大鼠模型,并且显示出肝脏脂肪样变的特点,而电针干预则对PCOS大鼠肝脏脂质堆积形态具有较明显的改善效果。然而来曲唑加高脂饮食诱导的大鼠PCOS肝脂肪样改变的模型是否具有稳定性以及电针改善PCOS大鼠肝脏脂肪样变的机制目前尚不清楚。研究目的1、验证来曲唑和高脂饮食诱导的PCOS伴肝脏脂肪样变大鼠模型;2、基于akt/gsk3β途径,探讨电针改善PCOS大鼠脂代谢的机制。研究方法1、大鼠模型的构建将30只雌性SD大鼠(21日龄)进行体重匹配后,随机分为对照组和高脂饮食组各15只:对照组(适应1周后,继续进食普通饲料);高脂饮食组(适应1周后,开始给予高脂饮食),从两组大鼠28日龄给予不同饮食开始,记为实验第1天。随后在连续35天高脂(high-fat diet,HFD)和正常饮食饲养(normal diet,ND)后对大鼠进行二次随机分组,分别给予来曲唑(Letrozole,LET)及电针(EA)进行干预,分成以下四组:HFD+LET组,HFD+LET+EA组,Control组,Control+EA组。其中,HFD+LET组和HFD+LET+EA组大鼠予来曲唑溶液灌胃1.0 mg/kg,1次/d,连续25 d;Control组和Control+EA组则给予等体积溶剂(0.5%CMC-Na)灌胃,连续25d。同时予HFD+LET+EA组和Control+EA组电针治疗,选穴为大鼠足三里、天枢穴(分别位于大鼠肚脐两侧旁开约5mm,和大鼠后肢胫骨前结节外侧约5mm)。电针以上两组穴位每周5～6次,最多20次。电针治疗期间采用固定装置固定大鼠,每次治疗时间为15～25 min。由于CON组1只大鼠有不规则的动情周期,模型组1只大鼠无典型的PCOS表型和动情周期,故总共有两只被剔除,最后分出的四组如下:(1)HFD+LET组:以诱导PCOS合并肝脏脂肪样变模型(n=7);(2)HFD+LET+EA组:以电针治疗PCOS伴肝脏脂肪样变模型(n=7);(3)Control组:给予等体积溶剂(0.5%CMC-Na)灌胃作为对照组(n=7);(4)Control+EA组:给予等体积溶剂(0.5%CMC-Na)灌胃+电针治疗(n=7);2、电针干预的机制分析实验期间对大鼠定期称重及阴道涂片,评估体重和动情周期变化。实验第61天对大鼠进行在异氟醚麻醉下对大鼠进行心脏采血,取大鼠肝脏及脂肪组织标本(包括性腺旁脂肪、肠系膜脂肪、腹股沟脂肪及腹膜后脂肪),分别进行称重,评估电针对脂肪组织的影响。收集大鼠血样检测激素水平、肝功和血脂,评估糖脂代谢情况。对大鼠肝脏组织进行HE染色、油红O染色,评估电针对大鼠肝脏形态学的改变。对肝组织进行蛋白质印迹分析,检测akt/gsk3β通路相关蛋白表达情况。此外通过对肝脏组织进行实时荧光定量聚合酶链反应,检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、Mcp1以及脂代谢相关分子PPAR-α、PPAR-γ、Acc的表达情况,从而探究电针改善PCOS大鼠肝脏脂代谢的机制。结果1、PCOS伴肝脏脂肪样变大鼠模型验证(1)体重、肝脏、脂肪组织重量比较:LET+HFD大鼠的体重较CON组明显增加(p<0.001),而电针治疗组大鼠体重较LET+HFD相比明显降低(p<0.05)。LET+HFD大鼠的肝脏重量较CON组明显增加(p<0.01),电针治疗组大鼠体重较LET+HFD相比明显降低(p<0.01)。计算肝体比发现,电针治疗组相较于HFD+LET组大鼠肝体比降低(p<0.05)。对大鼠各部位脂肪组织采集后进行称重和对比,LET+HFD组大鼠性腺旁脂肪脂体比明显高于CON组(p<0.001),肠系膜脂肪、腹股沟脂肪、腹膜后脂肪的脂体比也呈上升趋势。针灸治疗组性腺旁脂肪脂体比较LET+HFD组大鼠显著降低(p<0.01),肠系膜脂肪脂体比、腹膜后脂肪肢体比也显著降低(均

关键词：多囊卵巢综合征非酒精性脂肪肝糖脂代谢电针 akt/gsk3β

红景天苷调控akt/gsk3β信号通路对糖尿病骨质疏松的改善作用

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红景天苷调控AKT/GSK3β信号通路对糖尿病骨质疏松的改善作用

作者：王月明锦州医科大学

学位级别：硕士

目的红景天苷对多种病因导致的骨质疏松都有明显的改善作用,但对糖尿病骨质疏松(DOP)的保护作用鲜有报道。本研究拟探讨红景天苷对糖尿病大鼠骨质疏松的防治作用,并初步探讨可能的信号通路。方法Sprague-Dawley(SD)大鼠腹腔注射链脲佐菌... 详细信息

目的红景天苷对多种病因导致的骨质疏松都有明显的改善作用,但对糖尿病骨质疏松(DOP)的保护作用鲜有报道。本研究拟探讨红景天苷对糖尿病大鼠骨质疏松的防治作用,并初步探讨可能的信号通路。方法Sprague-Dawley(SD)大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ),制备Ⅰ型糖尿病动物模型。将大鼠分成3组:CON组(对照组);DM组(糖尿病大鼠);DM-SAL组(红景天苷治疗组)。Von Kossa染色观察股骨骨小梁微观形态,双能X射线吸收测定法测量股骨的密度,试剂盒检测血清中碱性磷酸酶(ALP)及钙磷含量,Western blot检测骨组织中akt、p-akt、gsk3β、p-gsk3β及BMP-2表达,模拟红景天苷与BMP-2进行分子对接。结果与CON组相比,DM组骨小梁面积比、数量和厚度均减少,骨密度下降,股骨的骨灰重/湿重比例降低,血清ALP含量降低,钙磷含量增加,p-akt/akt、p-gsk3/gsk3β比值及BMP-2的表达下降(P35,二者能紧密结合。结论红景天苷可能通过上调BMP-2,进而激活akt/gsk3β信号通路改善DOP。

关键词：红景天苷糖尿病骨质疏松 BMP-2 akt/gsk3β

Neuroprotective effects of Ginkgo biloba dropping pills in Parkinson's disease

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Journal of Pharmaceutical Analysis 2021年第2期11卷 220-231页

作者： Dingyi Yu Pengli Zhang Junying Li Ting Liu Yaodan Zhang Qingqing Wang Jianbing Zhang Xiaoyan Lu Xiaohui Fan Pharmaceutical Informatics Institute College of Pharmaceutical SciencesZhejiang UniversityHangzhou310058China Zhejiang University-Wanbangde Pharmaceutical Group Joint Research Center for Chinese Medicine Modernization Hangzhou310058China

Parkinson's disease(PD) is the second most common neurodegenerative disease in the world;however,it lacks effective and safe treatments. Ginkgo biloba dropping pill(GBDP), a unique Chinese G. biloba leaf extract preparation, exhibits antioxidant and neuroprotective effects and has a potential as an alternative therapy for PD. Thus, the aims of this study were to evaluate the effects of GBDP in in vitro and in vivo PD models and to compare the chemical constituents and pharmacological activities of GBDP and the G. biloba extract EGb 761. Using liquid chromatography tandem-mass spectrometry, 46 GBDP constituents were identified. Principal component analysis identified differences in the chemical profiles of GBDP and EGb 761. A quantitative analysis of 12 constituents showed that GBDP had higher levels of several flavonoids and terpene trilactones than EGb 761, whereas EGb 761 had higher levels of organic ***, we found that GBDP prevented 6-hydroxydopamine-induced dopaminergic neuron loss in zebrafish and improved cognitive impairment and neuronal damage in methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced PD mice. Although similar effects were observed after EGb 761 treatment,the neuroprotective effects were greater after GBDP treatment on several endpoints. In addition, in vitro results suggested that the akt/gsk3β pathway may be involved in the neuroprotective effects of *** findings demonstrated that GBDP have potential neuroprotective effects in the treatment of PD.

关键词： Ginkgo biloba dropping pills Parkinson's disease Neuroprotection akt/gsk3β Bax/bcl-2

胰岛素对阿尔茨海默病细胞模型淀粉样前体蛋白代谢的影响

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第三军医大学学报 2020年第12期42卷 1201-1208页

作者：胡容王丹楼丹丹李廷玉周卫辉宋伟宏重庆医科大学附属儿童医院儿科医学研究所儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地儿科学重庆市重点实验室重庆400014

目的探索胰岛素通过影响淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)代谢对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)细胞模型的作用。方法采用不同浓度的胰岛素处理人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y和非神经源性细胞株HEK293、2EB2,CCK-... 详细信息

目的探索胰岛素通过影响淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)代谢对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)细胞模型的作用。方法采用不同浓度的胰岛素处理人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y和非神经源性细胞株HEK293、2EB2,CCK-8法检测胰岛素对细胞活性的影响;Western blot检测2EB2细胞和SH-SY5Y细胞经不同浓度胰岛素处理后APP、CTF、BACE1、ADAM10和PS1的表达,ELISA法检测Aβ40和Aβ42的水平;蛋白芯片筛选胰岛素介导的关键信号通路分子,Western blot检测上述细胞中胰岛素对信号通路akt以及gsk3β蛋白磷酸化水平的影响。结果CCK-8检测结果显示,0~10μmol/L胰岛素浓度未对实验细胞的活性产生影响(P>0.05)。Western blot结果显示,与未处理组相比,1.00、10.00μmol/L胰岛素处理增加了APP、CTF的表达(Pgsk3β为胰岛素作用的潜在靶点。Western blot结果显示,磷酸化akt和磷酸化gsk3β蛋白的表达均下调,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论胰岛素对阿尔茨海默病致病性产物的产生有增强作用。

关键词：阿尔茨海默病胰岛素淀粉样前体蛋白 β淀粉样蛋白 akt/gsk3β

miRNA-93在膀胱癌中的表达及其对T24细胞生物学特性的影响

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中国肿瘤生物治疗杂志 2017年第2期24卷 139-144页

作者：张红刘念李征乔保平郑州大学附属南阳市中心医院肾病风湿免疫科河南郑州450052 郑州大学附属南阳市中心医院骨二科河南南阳473000 郑州大学附属南阳市中心医院泌尿外科河南南阳473000 郑州大学第一附属医院泌尿外科河南郑州450052

目的:探讨miRNA-93在膀胱癌中的表达及对人膀胱癌细胞株T24细胞生物学特性的影响及其作用机制。方法:选取郑州大学附属南阳市中心医院泌尿外科2010年5月至2016年5月收治的79例膀胱癌患者病理组织标本及配对癌旁正常组织,通过qRT-PCR检测... 详细信息

目的:探讨miRNA-93在膀胱癌中的表达及对人膀胱癌细胞株T24细胞生物学特性的影响及其作用机制。方法:选取郑州大学附属南阳市中心医院泌尿外科2010年5月至2016年5月收治的79例膀胱癌患者病理组织标本及配对癌旁正常组织,通过qRT-PCR检测miRNA-93的表达水平。沉默miRNA-93后,采用CCK-8法、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞增殖和迁移能力的变化及细胞的凋亡情况;Western blotting检测akt/p-akt、gsk3β/p-gsk3β蛋白表达水平的变化。结果:miRNA-93在膀胱癌组织及癌细胞中高表达,且表达水平与癌灶大小、淋巴结转移、病理分级及T分期有关(均P3后,T24细胞的增殖能力显著降低(P3促进T24细胞的凋亡并抑制其迁移;同时,沉默miRNA-93后p-akt和p-gsk3β的蛋白表达水平均显著下降(P3能够促进人膀胱癌细胞株T24细胞的增殖和迁移,并抑制凋亡,其作用机制可能与下调p-akt、p-gsk3β蛋白表达有关,提示miRNA-93可以作为诊断和靶向治疗膀胱癌的潜在作用位点。

关键词： miRNA-93 膀胱癌增殖凋亡迁移 akt/gsk3β

杨梅素通过ROS介导akt/gsk-3β通路诱导结直肠癌SW620细胞凋亡机制的研究

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杨梅素通过ROS介导AKT/GSK-3β通路诱导结直肠癌SW620细胞凋亡机...

作者：冯政西北大学

学位级别：硕士

研究目的:结直肠癌是人肠胃道常见的恶性肿瘤之一,是世界第三大癌症。根据美国癌症协会发布的数据表明,全球每年超130万人受到结直肠癌的危害,严重影响患者健康。此外,在过去二十年间因非健康饮食习惯、过量吸烟、缺乏锻炼等可控的风险... 详细信息

研究目的:结直肠癌是人肠胃道常见的恶性肿瘤之一,是世界第三大癌症。根据美国癌症协会发布的数据表明,全球每年超130万人受到结直肠癌的危害,严重影响患者健康。此外,在过去二十年间因非健康饮食习惯、过量吸烟、缺乏锻炼等可控的风险因素导致的病例占到总病例的50%以上。目前结直肠癌大多数病例的医治方法仍是手术和化疗,虽然这些方法在临床治疗和应用中取得不错的疗效,但晚期病人的五年存活率只有13%,因此急需开发低毒、高效及价廉的新型药物。据报道,许多天然化合物或中草药已经应用到癌症的治疗中,如扁塑藤素、木香烃内酯等。杨梅素(Myricetin)最初是在杨梅树皮中提炼出的一种黄酮类化合物,具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、减肥等作用。当前杨梅素已被报道可以抑制多种肿瘤细胞的生长,如卵巢癌、肝癌等,然而杨梅素在结直肠癌中的抗癌潜在分子机制尚不明确。因此,本研究选取结直肠癌SW620细胞,研究杨梅素诱导其凋亡的机制,以期为杨梅素在治疗结直肠癌的应用中提供新的理论,使其成为治疗结直肠癌的先导化合物。研究方法:使用不同浓度杨梅素刺激结直肠癌SW620细胞,检测内容如下:1.利用倒置显微镜观察SW620细胞的形态,然后通过MTT法检测杨梅素对SW620细胞增殖的作用。2.分别用PI染色、Annexin V-FITC和PI双重染色以及DCFH-DA探针处理,利用流式细胞术检测SW620细胞周期分布、凋亡程度及胞内活性氧(ROS)积累情况;DAPI染色后利用荧光显微镜观察杨梅素对SW620细胞的影响。3.通过免疫印迹法(Western blot,WB)检测周期、凋亡、自噬及akt/gsk-3β通路相关蛋白的表达,包括Cyclin A2、p21、Cleaved-PARP、Beclin-1、LC3B等。4.将SW620细胞分别用ROS清除剂NAC及自噬抑制剂3-MA预先处理,随后通过MTT法和WB法检测杨梅素刺激后对细胞增殖、自噬、及akt/gsk-3β通路蛋白表达的影响。研究结果:***实验显示,在SW620细胞中Myr能显著抑制其增殖,并呈浓度依赖性;利用倒置显微镜观察到SW620细胞死亡数量与Myr浓度呈正相关。2.流式细胞术结果显示,Myr能增加SW620细胞在周期中S期的占比,且呈浓度依赖性。WB实验显示Myr能下调SW620细胞中周期相关蛋白Cyclin A2的表达,并使p21蛋白的表达水平上调。3.流式细胞术结果显示,Myr能诱导SW620细胞凋亡,DAPI染色观察到,随着Myr浓度的增加,SW620细胞内强烈蓝色荧光点的数量不断增加。WB实验显示Myr能上调SW620细胞中凋亡蛋白Cleaved PARP的表达。4.流式细胞术结果显示,Myr能增加SW620细胞内ROS的含量,呈浓度依赖性。而MTT结果显示,加入NAC预处理后减弱了Myr对SW620细胞增殖的抑制程度。***实验显示Myr处理能降低SW620细胞中akt/gsk3β通路中p-akt和p-gsk3β的表达水平,但加入NAC预处理后则表达水平上调。而akt和gsk3β的表达在NAC预处理前后均不改变。***实验检测自噬相关蛋白结果显示,Myr能上调SW620细胞中LC3B-II和Beclin1的表达,激活自噬发生,而其表达量在加入NAC预处理后表达下调。MTT结果显示,加入3-MA预处理抑制自噬后减弱了Myr对SW620细胞增殖的抑制程度。结论:基于以上结果证明,Myr能抑制SW620细胞增殖,诱导细胞凋亡。进一步研究得出Myr通过下调Cyclin A2和上调p21的表达,将细胞周期阻滞在S期来显著抑制结直肠癌SW620细胞增殖。此外,Myr能诱导胞内ROS的生成,且通过ROS介导下调p-akt和p-gsk3β的表达,进而抑制细胞赖以存活的akt/gsk3β通路来诱导细胞凋亡。Myr还能通过ROS上调Beclin-1和LC3B-Ⅱ的蛋白表达,激活凋亡性自噬,促进SW620细胞凋亡。通过研究可知Myr可作为一种潜在的先导化合物,为Myr在治疗结直肠癌的应用中提供新的策略。

关键词：杨梅素 akt/gsk3β 细胞凋亡结直肠癌 ROS

冬凌草甲素抑制食管上皮细胞转化的分子机制研究

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冬凌草甲素抑制食管上皮细胞转化的分子机制研究

作者：徐京龙郑州大学

学位级别：硕士

目的食管癌(Esophageal Cancer,EC)是常见的上消化道肿瘤。我国是世界上食管癌高发区之一,主要高发省份为河北、河南、福建和重庆,尤其在河北省磁县、河南省林州发病率和死亡率较高。食管癌的发生发展是一个长期的过程,食管癌的发生经... 详细信息

目的食管癌(Esophageal Cancer,EC)是常见的上消化道肿瘤。我国是世界上食管癌高发区之一,主要高发省份为河北、河南、福建和重庆,尤其在河北省磁县、河南省林州发病率和死亡率较高。食管癌的发生发展是一个长期的过程,食管癌的发生经历了食管鳞状上皮细胞轻、中度不典型增生,重度不典型增生到原位癌、食管鳞状细胞癌的过程。轻中度不典型增生是重度不典型增生之前的一个阶段,具有双向不稳定性,如对此阶段进行药物干预,阻止其向重度不典型增生及原位癌阶段发展,则能够达到预防食管鳞癌发生的目的。研究发现,细胞内信号转导通路(Wnt、Notch、Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/akt/m TOR)的激活对食管癌的发生、发展起到重要的作用。因此,针对信号通路中特定信号分子靶向作用可能为食管癌预防和治疗的新方法。冬凌草为唇形科香茶菜属植物,民间主要用来治疗咽喉肿痛、虫蛇咬伤和防治食管癌,冬凌草甲素为其主要抗肿瘤成分之一。临床实验证明,冬凌草能够明显缓解肿瘤症状,如食管癌、贲门癌、原发性肝癌和乳腺癌等,能够稳定和缩小肿瘤体积并且能够延长患者生命,对其抗肿瘤机制多集中于对肿瘤细胞的杀伤作用、诱导肿瘤细胞凋亡、增强其他抗肿瘤药物疗效等方面。但该化合物对食管早期轻中度不典型增生是否有抑制作用并在食管癌的化学预防中发挥作用并不清楚。本研究以表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)诱导食管上皮细胞转化为模型,探索冬凌草甲素对食管上皮细胞转化的抑制作用及其相应分子机制,以期为早期食管癌化学预防提供依据。材料与方法***细胞毒性实验:检测不同浓度(DMSO、1、5、10、25、50和100μM)的冬凌草甲素对SHEE细胞的毒性作用,筛选出细胞增殖抑制实验的药物浓度。***细胞的增殖抑制实验:根据细胞毒性实验结果筛选出的最大药物浓度为20μM,设置细胞增殖抑制实验药物浓度(DMSO、1、2.5、5、10和20μM),检测不同浓度冬凌草甲素在不同时间点(0h、24h、48h、72h和96h)对SHEE细胞的增殖抑制作用。3.软琼脂克隆形成实验:观察不同浓度(DMSO、EGF、1μM+EGF、2.5μM+EGF、5μM+EGF、10μM+EGF和20μM+EGF,EGF浓度为10ng/ml)的冬凌草甲素对EGF诱导的SHEE细胞转化能力的影响。4.磷酸蛋白激酶芯片检测:用DMSO、EGF(10ng/ml)、冬凌草甲素(20μM)+EGF(10ng/ml)处理细胞,通过磷酸蛋白激酶芯片,筛选出冬凌草甲素能够抑制EGF诱导的蛋白激酶。5.蛋白印迹实验:验证磷酸蛋白激酶芯片结果,确定冬凌草甲素抑制EGF诱导的磷酸蛋白激酶。6.对细胞信号通路EGFR/akt/gsk-3β、EGFR/akt/m TOR和EGFR/ERK/RSK的检测:通过药物浓度梯度蛋白印迹实验,探究不同浓度冬凌草甲素(DMSO、EGF、1μM+EGF、2.5μM+EGF、5μM+EGF、10μM+EGF和20μM+EGF,EGF浓度为10ng/ml)对EGF诱导的蛋白激酶磷酸化的抑制作用,并且和已知PI3K抑制剂LY294002的抑制作用进行对比。结果1.不同浓度(DMSO、1、5、10、25、50和100μM)的冬凌草甲素分别作用于SHEE细胞24和48 h,CCK-8法测定OD值,以实验组/对照组的比值为纵坐标,冬凌草甲素的浓度为横坐标作出细胞生存率曲线,得出冬凌草甲素对SHEE细胞80%存活率约为20μM。2.不同浓度(DMSO、1、2.5、5、10和20μM)的冬凌草甲素分别作用于SHEE细胞0h、24h、48h、72h和96h,CCK-8法测定OD值,以吸光度为纵坐标,时间为横坐标作出不同药物浓度的细胞增殖曲线,发现较低剂量冬凌草甲素和短时间处理对SHEE细胞并没有明显的增殖抑制作用,20μM浓度的冬凌草甲素作用72h和96h后能够抑制SHEE细胞的增殖(P3.不同浓度(DMSO、EGF、1μM+EGF、2.5μM+EGF、5μM+EGF、10μM+EGF和20μM+EGF,EGF浓度为10ng/ml)的冬凌草甲素软琼脂克隆形成实验,DMSO组细胞没有转化,处于单个分散状态,EGF组细胞转化能力强且克隆数量多,冬凌草甲素组随着浓度的增高细胞转化能力降低且克隆数量变少(Pakt/m TOR和akt/gsk3β的磷酸化,冬凌草甲素对EGF诱导的ERK/RSK信号通路磷酸化水平没有抑制作用。5.蛋白印迹实验结果和芯片结果保持一致。6.药物浓度梯度蛋白印迹实验结果发现,冬凌草甲素对EGF诱导的akt/m TOR和akt/gsk3β磷酸化的抑制作用呈现浓度依赖性(P

关键词：冬凌草甲素食管癌化学预防 akt/mTOR akt/gsk3β